Государственное санитарно-эпидемиологическое нормирование Российской Федерации

4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ.
МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Метод микробиологического измерения
концентрации клеток микроорганизма
Pseudomonas fluorescens (denitrificans) В 99 -
продуцента витамина В₁₂ в атмосферном воздухе
населенных мест

Методические указания
МУК 4.2.1004-00

Минздрав России

Москва 2001

1. Разработаны канд. биол. наук Р. В. Бару, канд. биол. наук А. В. Лапчинской (Государственный научный центр по антибиотикам).

2. Утверждены и введены в действие Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации, Первым заместителем министра здравоохранения российской Федерации 20 декабря 2000 г.

3. Введены впервые.

СОДЕРЖАНИЕ

УТВЕРЖДАЮ

Главный государственный санитарный врач

Российской Федерации - Первый заместитель

Министра здравоохранения Российской Федерации

Г. Г. Онищенко

20 декабря 2000 г.

Дата введения: с момента утверждения

4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Метод микробиологического измерения концентрации
клеток микроорганизма Pseudomonas fluorescens
(denitrificans) В 99 - продуцента витамина В₁₂
в атмосферном воздухе населенных мест

1. Общие положения и область применения

Настоящие методические указания устанавливают методику проведения микробиологического количественного анализа концентрации клеток штамма Pseudomonas fluorescens (denitrificans) В 99 - продуцента витамина В₁₂ атмосферном воздухе населенных мест в диапазоне концентраций от 100 до 3000 клеток в 1 м³ воздуха.

Методические указания разработаны в соответствии с требованиями ГОСТов 17.2.4.02-81 «Охрана природы. Атмосфера. Общие требования к методам определения загрязняющих веществ» Р.8.563-96 «Методики выполнения измерений».

Методические указания предназначены для применения и лабораториях предприятий, организации и учреждений, аккредитованных в установленном порядке на право проведения микробиологических исследований.

Методические указания одобрены и рекомендованы секцией «Гигиенические аспекты биотехнологии и микробного загрязнения окружающей среды» Проблемной комиссии «Научные основы гигиены окружающей среды».

2. Характеристика штамма-продуцента витамина В₁₂

Микроорганизм Pseudomonas fluorescens (denitrificans) В 99 является продуцентом витамина В₁₂. Штамм растет на агаризованных средах на основе мелассы при температуре 28 °С. В течение 3-х суток образует округлые колонии 1 - 2 мм белого цвета. Морфологически представляет собой грамотрицательные подвижные палочки размером 0,45 - 0,85 х 0,6 мкм. Штамм устойчив к следующим антибиотикам: левомицетину, линкомицину, полимиксину М, ристомицину, цефалотину и эритромицину.

Предельно допустимая концентрация (ПДК) в атмосферном воздухе населенных мест - 200 кл/м³.

3. Пределы измерений

Методика обеспечивает выполнение измерений количества клеток продуцента витамина В₁₂ в атмосферном воздухе населенных мест в диапазоне концентраций от 100 до 3000 клеток в 1 м³ воздуха при доверительной вероятности 0,95.

4. Метод измерений

Метод основан на аспирации из воздуха клеток продуцента витамина В₁₂ на поверхность плотной питательной среды и подсчета выросших колоний по типичным морфологическим признакам.

5. Средства измерений, вспомогательные устройства, реактивы и материалы

При выполнении измерений применяют следующие средства измерений, вспомогательные устройства и материалы.

5.1. Средства измерений, вспомогательные устройства, материалы

5.2. Реактивы, растворы

Антибиотики: левомицитин, линкомииин, полнмиксин М, цефалотин, эритромицин.

Селективная среда для штамма-продуцента

Среда: меласса - 100 - 150 г; (NH₄)₂HPO₄ - 1,3 г; MgS0₄ 7H₂0 - 1,0 г; (NH₄)₂SO₄ - 0,5 г; MnSO₄H₂O - 0,1 г; ZnSO₄ 7H₂O - 0,1 г; агар Difco - 20 г; вода дистиллированная - до 1000 мл; рН - 6,8 - 7,0; стерилизация 121 °С, 30 мин.

6. Требования безопасности

При выполнении измерений концентрации клеток продуцента витамина В₁₂ в атмосферном воздухе населенных мест соблюдают следующие требования.

6.1. Правила техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТу 12.1.005-88.

6.2. Электробезопасность при работе с электроустановками по ГОСТу 12.1.019-79 и инструкции по эксплуатации прибора.

6.3. «Инструкции по устройству, требованиям безопасности и личной гигиены при работе в микробиологических лабораториях предприятий микробиологической промышленности» (1977).

6.4. Все виды работ с реактивами проводят только в вытяжном шкафу при работающей вентиляции, работа с биологическим материалом осуществляется в боксе, оборудованном бактерицидными лампами.

7. Требования к квалификации операторов

К выполнению измерений и обработке их результатов допускают лиц с высшим или средним специальным образованием, прошедших соответствующую подготовку и имеющих навыки работы в области микробиологических исследований.

8. Условия измерений

Процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят в нормальных условиях при температуре воздуха (20±5 °С), атмосферном давлении 630 - 800 мм рт. ст. и влажности воздуха не более 80 %.

9. Проведение измерения

9.1. Условия отбора проб воздуха

Для определения продуцента витамина В₁₂ воздух аспирируют при помощи аппарата Кротова со скоростью 10 л/мин на поверхность плотной питательной среды. Время аспирации воздуха (5 - 20 мин) зависит от предполагаемой концентрации клеток продуцента.

Аппарат Кротова перед каждым отбором пробы воздуха тщательно протирают спиртом. Особенно тщательно обрабатывают поверхность подвижного диска и внутреннюю стенку прибора; наружную и внутреннюю стенку крышки. На подвижной диск устанавливают подготовленную чашку Петри со средой, одновременно снимая с нее крышку. Прибор закрывают Соприкосновение крышки прибора со средой недопустимо. После отбора пробы воздуха и остановки диска, прибор открывают, быстро снимают чашку Петри и закрывают крышкой от данной чашки. На дне чашки Петри стеклографом отмечают точку контроля, время аспирации и дату отбора пробы.

9.2. Выполнение анализа

Метод предполагает учет количества типичных по морфологическим признакам колоний, выросших на 2 - 3 сутки после посева воздуха. Прямой метод позволяет учитывать на чашке до 200 колоний продуцента.

Селективную среду расплавляют, остужают до 60 °С, добавляют свежеприготовленный в стерильной дистиллированной воде раствор антибиотика (левомицитин, линкомицин, цефалотин и др.) из расчета 30 мкг на 1 мл среды (для подавления посторонней бактериальной микрофлоры), тщательно перемешивают и разливают по 10 мл в стеклянные чашки Петри на горизонтальной поверхности чашки с застывшей средой помещают в термостат на сутки при температуре 37 °С, после чего проросшие чашки бракуют, стерильные чашки используют для контроля воздуха.

После отбора проб воздуха чашки Петри помещают в термостат на 28 °С. Через 48 - 72 ч производят подсчет выросших типичных колоний продуцента. При необходимости культуру подвергают микроскопированию.

10. Вычисление результатов измерения

Расчет концентрации клеток продуцента в пересчете на 1 м³ воздуха производят по формуле:

, кл/м³,

где        Х - концентрация клеток продуцента в воздухе;

N - количество колоний продуцента, выросших на чашке;

1000 - коэффициент пересчета на 1 м³ воздуха;

V - объем воздуха, л (произведение скорости на время аспирации).

В случае невозможности использования аппарата Кротова рекомендуется применять метод седиментации клеток продуцента из воздуха непосредственно на чашки Петри с плотной питательной средой. Время отбора проб воздуха может составлять до 60 мин (при определении концентрации микроорганизма в атмосферном воздухе). При использовании этого метода применяют следующий расчет концентрации клеток продуцента:

эмпирически установлено, что за 5 мин на площадь 100 см² оседает количество бактерий, содержащееся в 10 л воздуха, за 1 мин - 2 л воздуха. Площадь чашки Петри диаметром 100 мм (радиус 8 см) равна 78,54 см².

Составляем пропорцию:

на 100 см² за 1 мин оседает 2 л воздуха

на 78,54 см² - Х л

Х = 1,57 л/мин.

Следовательно, на стеклянную чашку Петри за 1 мин оседает 1,57 л воздуха.

Надо определить количество клеток в 1 м² воздуха.

Па 1 чашку (диаметр 100 мм) за 1 мин оседает количество микробов, содержащихся в 1,57 л воздуха, за Т мин - 1,57 ^. Т л.

В этом количестве содержится N колониеобразующих единиц (микробных клеток - спор, обрывков мицелия), а в 1 м³ воздуха содержится -

.

Пример: за 30 мин седиментации выросло 12 колоний микроорганизма. В 1 м³ воздуха содержится

= 253 клетки.

11. Оформление результатов измерений

Результаты измерений оформляют протоколом по форме.

Протокол №

количественного микробиологического анализа штамма-продуцента Pseudomonas fluorescens (denitiificans) В 99 в атмосферном воздухе.

1. Дата проведения анализа___________________________________

2. Место отбора пробы_______________________________________

3. Название лаборатории_____________________________________

4. Юридический адрес организации____________________________

Результаты микробиологического анализа

Ответственный исполнитель

Научный руководитель

Список литературы

1. Руководство по контролю загрязнения атмосферы: РД 52.04.186-96. - М., 1991. -693с.

2. ГОСТ 8.563-96 ГСИ. Методики выполнения измерений.

3. ГОСТ 17.2.4.02-81 Охрана природы. Атмосфера. Общие требования к методам определения загрязняющих веществ - М.: Изд-во стандартов, 1981. - 3 с.