Государственное санитарно-эпидемиологическое нормирование
Российской Федерации

4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Метод микробиологического измерения
концентрации клеток микроорганизма
Bacillus licheniformis 1001 - продуцента бацитрацина
в воздухе рабочей зоны

Методические указания

МУК 4.2.1781-03

Минздрав России

Москва 2004

Методические указания. - М.: Федеральный центр Госсанэпиднадзора Минздрава России, 2004.

1. Разработаны: Российским государственным медицинским университетом (к.б.н. Н.И. Шеиной).

2. Утверждены Первым заместителем министра здравоохранения Российской Федерации - Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации 24 октября 2003 г.

3. Введены в действие с 1 декабря 2003 г.

4. Введены впервые.

УТВЕРЖДАЮ

Главный государственный санитарный

врач Российской Федерации,

Первый заместитель Министра

здравоохранения Российской Федерации

Г.Г. Онищенко

24 октября 2003 г.

Дата введения: 1 декабря 2003 г.

4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Метод микробиологического измерения концентрации

клеток микроорганизма Bacillus licheniformis 1001 –

продуцента бацитрацина в воздухе рабочей зоны

Методические указания

1. Общие положения и область применения

Настоящие методические указания устанавливают методику проведения микробиологического количественного анализа концентрации клеток штамма В. lichenifofmis 1001 - продуцента бацитрацина в воздухе рабочей зоны в диапазоне концентраций от 50 до 500000 клеток в 1 м³ воздуха.

Методические указания разработаны в соответствии с требованиями ГОСТ 12.1.005-88 «ССБТ. Воздух рабочей зоны. Общие санитарно-гигиенические требования» и Р 8.563-96 «Методики выполнения измерений».

Методические указания предназначены для применения в лабораториях предприятий, организаций и учреждений, аккредитованных в установленном порядке на право проведения микробиологических исследований.

Методические указания одобрены и рекомендованы секцией «Гигиенические аспекты биотехнологии и микробного загрязнения окружающей среды» Проблемной комиссии «Научные основы гигиены окружающей среды».

2. Биологическая характеристика В. licheniformis 1001 и его гигиенический норматив

Систематическое положение микроорганизма

Класс                                         Schizomycetes

Отряд                                         Eubacteriales

Семейство                                 Bacillaceae

Род                                             Bacillus

Вид                                             licheniformis

Штамм                                       1001

На МПА штамм образует большие округлые колонии, максимальный диаметр которых составляет 0,8 - 1,1 см. В центре колонии наблюдается плотное матовое желтоватого цвета уплотнение, максимальный диаметр которого может составлять 0,3 - 0,5 см. Вокруг него располагается прозрачная складчатая кайма, края которой сильно изрезаны. Колонии гладкие, плоские, матовые. Не врастают в агар и легко отделяются от него. Цвет белесый с желтоватым оттенком.

Морфологически штамм представлен подвижными мелкими толстыми короткими палочками, образующими центрально расположенные эндоспоры, располагаются поодиночке или небольшими конгломератами, редко образуют цепочки. Палочки снабжены жгутиками, расположенными перитрихиально.

В. licheniformis аэроб, сапрофит, мезофил, грамположителен. Чувствителен к целому ряду антибиотиков, умеренно чувствителен к бензилпенициллину.

Штамм-продуцент растет на жидких и агаризованных средах. Оптимальная температура роста 36 - 38 °С, оптимальная рН 7,0 - 8,0, культивирование 7 суток. Для размножения используется мясопептонная агаризованная среда (МПА).

Предельно допустимая концентрация (ПДК) в воздухе рабочей зоны - 50000 кл./м³, пометка А, 4 класс опасности.

3. Пределы измерений

Методика обеспечивает выполнение измерений количества клеток микроорганизма в воздухе рабочей зоны в диапазоне концентраций от 50 до 500000 клеток в 1 м³ воздуха при доверительной вероятности 0,95.

4. Метод измерений

Прямой метод основан на аспирации из воздуха производственных помещений клеток микроорганизма на агаризованную среду МПА и подсчета количества выросших колоний по типичным культурально-морфологическим признакам.

Косвенный метод основан на аспирации из воздуха клеток микроорганизма на поверхность плотной питательной среды (МПА) и подсчета зон задержки роста тест-культуры Micrococcus flavus ATCC 10240 через 24 - 48 часов. При данном методе на одной чашке Петри после забора пробы может быть учтено не более 50 колоний на чашке, т.к. большее количество колоний на чашке образуют сливающиеся зоны задержки роста тест культуры под действием антибиотика бацитрацина.

5. Средства измерений, вспомогательные устройства, реактивы и материалы

При выполнении измерений применяют следующие средства измерений, вспомогательные устройства и материалы.

5.1. Средства измерений, вспомогательные устройства, материалы

Прибор для бактериологического анализа

воздуха, модель 818 (щелевой прибор Кротова)                   ТУ 64-12791-77

Термостаты электрические суховоздушные или водяные

Автоклав электрический                                                         ГОСТ 9586-75

Бокс, оборудованный бактерицидными лампами

Холодильник бытовой

Весы лабораторные, аналитические типа ВЛА-200

Микроскоп биологический с иммерсионной

системой типа «Биолам Л-211»

Лупа с увеличением ´ 10                                                         ГОСТ 25706-83

Чашки Петри бактериологические плоскодонные,

стеклянные, диаметром 100 мм

Пробирки биологические, вместимостью 20

и 35 мл                                                                                       ГОСТ 10515-75

Пипетки мерные на 1, 5, и 10 мл                                            ГОСТ 1770-74

Колбы конические, вместимостью 250 и 500 мл                  ГОСТ 1770-74

Секундомер                                                                               ГОСТ 9586-75

Барометр                                                                                   ГОСТ 24696-79

Марля медицинская                                                                 ГОСТ 9412-77

Вата медицинская гигроскопическая                                     ГОСТ 25556-81

5.2. Реактивы, растворы

Антибиотики: ампициллина натриевая соль, нистатин

Спирт этиловый ректификат                                                  ГОСТ 5962-67

Агаризованная среда МПА (агар - 1,5 - 1,8 %,

рН 7,0 - 8,0, режим стерилизации 1,1 - 1,2 ати

в течение 30 мин)

Тест-культура Micrococcus flavus ATCC 10240

(Гос. научно-контрольный институт

ветеринарных препаратов)

6. Требования безопасности

При выполнении измерений концентрации клеток штамма-продуцента в воздухе рабочей зоны соблюдают следующие требования.

6.1. Правила техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.005-88.

6.2. Электробезопасность при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019-79 и инструкции по эксплуатации прибора.

6.3. Руководство «Положение об организации работы по технике безопасности в микробиологической промышленности» (1980), «Инструкции по устройству, требованиям безопасности и личной гигиены при работе в микробиологических лабораториях предприятий микробиологической промышленности» (1977).

6.4. Все виды работ с реактивами проводят только в вытяжном шкафу при работающей вентиляции, работа с биологическим материалом осуществляется в боксе, оборудованном бактерицидными лампами.

7. Требования к квалификации операторов

К выполнению измерений и обработке их результатов допускают лиц с высшим или средним специальным образованием, прошедших соответствующую подготовку и имеющих навыки работы в области микробиологических исследований.

8. Условия измерений

Процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят в нормальных условиях при температуре воздуха (20 ± 5 °С), атмосферном давлении 630 - 800 мм рт.ст. и влажности воздуха не более 80 %.

9. Проведение измерения

9.1. Условия отбора проб воздуха

Для определения концентрации клеток микроорганизма воздух аспирируют при помощи аппарата Кротова со скоростью 10 л/мин на поверхность плотной питательной агаризованной среды МПА. Время аспирации воздуха (1 - 10 мин) зависит от предполагаемой концентрации клеток штамма-продуцента.

Аппарат Кротова перед каждым отбором пробы воздуха тщательно протирают спиртом. Особенно тщательно обрабатывают поверхность подвижного диска и внутреннюю стенку прибора; наружную и внутреннюю стенку крышки. На подвижной диск устанавливают подготовленную чашку Петри со средой, одновременно снимая с нее крышку. Прибор закрывают. Соприкосновение крышки прибора со средой недопустимо. После отбора пробы воздуха и остановки диска, прибор открывают, быстро снимают чашку Петри и закрывают крышкой от данной чашки. На дне чашки Петри стеклографом отмечают точку контроля, время аспирации и дату отбора пробы.

9.2. Выполнение анализа

При выполнении анализа воздуха прямым методом агаризованную среду МПА расплавляют, остужают до 50 - 60 °С, добавляют свежеприготовленный в стерильной дистиллированной воде раствор антибиотика ампициллина из расчета 10 - 15мкг на 1 мл среды (для подавления посторонней бактериальной микрофлоры), раствор нистатина из расчета 10 мкг на мл среды (для подавления грибковой флоры), тщательно перемешивают и разливают в чашки Петри.

Чашки с застывшей средой помешают в термостат на сутки при температуре 37 °С, после чего проросшие чашки бракуют, стерильные чашки используют для контроля воздуха.

После отбора проб воздуха чашки Петри помещают в термостат с температурой 40 °С (для интенсификации развития бактерии). Через 48 - 72 часа производят подсчет выросших колоний по культурально-морфологическим признакам (прямой метод).

При выполнении анализа воздуха производственных помещений косвенным методом чашки Петри с пробами вынимают из термостата через 24 часа, инкубируют в парах хлороформа не менее 20 - 30 мин в вытяжном шкафу. Затем чашки оставляют на 2 ч при комнатной температуре для преддиффузии и наслаивают верхний слой среды МПА, в которую предварительно вносят взвесь 18 - 20 часовой тест культуры

Micrococcus flavus из расчета 2 мл 1-миллиардной взвеси на 100 мл среды. Затем чашки инкубируют в термостате при 28 - 32 °С в течение 16 - 18 часов и подсчитывают количество зон задержки роста тест культуры под действием бацитрацина.

10. Вычисление результатов измерения

Расчет концентрации клеток продуцента в пересчете на 1 м³ воздуха производят по формуле:

 кл./м³, где

Х - концентрация клеток продуцента в воздухе;

N - количество зон вокруг колоний продуцента, выросших на чашке;

1000 - коэффициент пересчета на 1 м³ воздуха;

V - объем воздуха, л (произведение скорости на время аспирации).

В случае невозможности использования аппарата Кротова, рекомендуем применять метод седиментации клеток продуцента из воздуха непосредственно на чашки Петри с плотной питательной средой. Время отбора проб воздуха может составлять до 30 мин. При использовании этого метода пользуются следующим расчетом концентрации клеток продуцента:

эмпирически установлено, что за 5 мин на площадь 100 см² оседает количество бактерий, содержащееся в 10 л воздуха, следовательно за 1 мин - количество бактерий из 2 л воздуха. Площадь чашки Петри диаметром 100 мм равна 78,54 см². Составляя пропорцию, определяем, что за 1 мин на стеклянную чашку Петри оседают клетки из 1,57 л/мин. Количество клеток в 1 м³ воздуха определяем по вышеприведенной формуле, где V = 1,57 л/мин ´ t (время аспирации, мин).

Предлагаемый метод является ориентировочным и может быть использован как вспомогательный метод.

11. Оформление результатов измерений

Результаты измерений оформляют протоколом по форме.

Протокол №
количественного микробиологического анализа штамма-продуцента Bacillus licheniformis 1001 в воздухе рабочей зоны

Результаты микробиологического анализа

Ответственный исполнитель

Научный руководитель

Список литературы

1. ГОСТ 12.1.005-88 «ССБТ. Воздух рабочей зоны. Общие санитарно-гигиенические требования».

2. ГОСТ 8.563-96. ГСИ «Методики выполнения измерений».

3. Положение об организации работы по технике безопасности в микробиологической промышленности. - М., 1980. 27 с.

4. Инструкции по устройству, требованиям безопасности и личной гигиены при работе в микробиологических лабораториях предприятий микробиологической промышленности. - М., 1977. 7 с.

5. Ахматова Э.А. Санитарно-микробиологическая характеристика воздуха рабочих помещений Фрунзенского завода кормовых антибиотиков // Здравоохранение Киргизии, 1983. № 4. С. 12 - 15.

6. Даниелова Л.Т., Амбарцумян Л.А. К методике определения остаточных количеств бацитрацина в пищевых продуктах животноводства // Антибиотики, 1980. Т. 25. № 1. С. 41 - 44.

СОДЕРЖАНИЕ