Утверждены

Минздравом СССР

31 июля 1973 г. N 1112-73

18 октября 1977 г. N 1796-77

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

ПО УНИФИЦИРОВАННОМУ МЕТОДУ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ

В ОБЪЕКТАХ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ БИОЛОГИЧЕСКИХ ИНСЕКТИЦИДНЫХ

ПРЕПАРАТОВ НА ОСНОВЕ КРИСТАЛЛОСПОРООБРАЗУЮЩИХ БАКТЕРИЙ

ВИДА БАЦИЛЛА ТУРИНГИЕНЗИС

Разработаны взамен "Определения энтобактерина в капусте, яблоках и смородине" от 31.07.73 N 1112-73; "Микробиологического метода определения энтобактерина в воздухе рабочей зоны" от 31.07.73 N 1112-73 и "Методических указаний по определению гомелина в объектах окружающей среды микробиологическим методом" от 18.10.77 N 1796-77.

Настоящие Методические указания распространяются на микробиологический метод определения содержания бактериальных инсектицидных препаратов (лепидоцид, инсектин, гомелин, битоксибациллин, БИП, дипел и т.п.) в воздухе, на растениях, в почве, воде и других объектах окружающей среды при санитарном контроле.

Краткая характеристика препаратов. Бактериальные инсектицидные препараты состоят из энтомоцидного компонента (споры, токсины и другие продукты жизнедеятельности кристаллоспорообразующих бактерий вида бацилла турингиензис) - 10 - 60% и инертного наполнителя (каолин, хлористый натрий и т.п.) - 40 - 90%. Препараты представляют собой мелкодисперсные порошки аморфной структуры серого или коричневого цвета. Имеют слабый специфический запах. В воде образуют малостойкую суспензию. Споры бацилл турингиензис и термостабильный бета-экзотоксин выдерживают длительное кипячение, а кристаллоиды белоксодержащего эндотоксина разрушаются при температуре 60 °C и выше.

Бациллы турингиензис не развиваются и не размножаются в теплокровном организме, безопасны в эпидемиологическом отношении.

    Бактериальные  инсектицидные препараты малотоксичны - ЛД   для

                                                            50

белых  мышей, крыс и морских свинок при введении в желудок более 5

г/кг.   Раздражающее   и   аллергенное   действие   препаратов  не

исключается.

    Препараты   применяются   в  качестве  инсектицидов  кишечного

действия.   Высокоэффективны   в  борьбе  с  пяденицами,  совками,

листовертками,  огневками и другими насекомыми на полевых, садовых

культурах и лесонасаждениях.

    Утвержденные  или  рекомендованные предельно допустимые уровни

загрязнения     объектов     окружающей    среды    бактериальными

инсектицидными  препаратами составляют: ПДК в воздухе рабочей зоны

     4       7

-  10   -  10   микробных    тел  (м.т.) в 1 куб. м; в атмосферном

                                     4           5

воздухе населенных пунктов - 3,0 x 10  - 1,5 x 10   м.т./куб. м; в

                                                           7     8

воде   водоемов  санитарно-бытового  водопользования  -  10  - 10

м.т./л; в почве - нет  необходимости  нормировать; МДУ  в  пищевых

              7     8

продуктах - 10  - 10  м.т./кг.

Принцип метода. Метод основан на получении смыва с фильтрующего материала, растений и посеве его на плотную питательную среду, выращивании бацилл турингиензис при оптимальной температуре, идентификации и подсчете выросших колоний, расчете содержания препарата в исследуемом объекте.

    Метрологическая  характеристика  метода.  Диапазон определения

                         2          8

концентраций  - от 3 x 10  до 3 x 10   м.т./мл. Предел обнаружения

        2                             6

- 2 x 10  м.т./куб.  м воздуха; 2 x 10  м.т./кг  пищевого продукта

и   т.п.   Среднее   значение  определения  стандартных  количеств

препарата   -   80%   при  6  исследованных  параллельных  пробах.

Стандартное   отклонение    отдельного    определения   +/- 10,5%.

Относительное  стандартное отклонение 0,13. Доверительный интервал

среднего  значения  из  6  определений  при  надежности 0,95 равен

+/- 13,8%.

Избирательность метода. Метод избирателен в присутствии бацилл цереус и других почвенных спорообразующих бактерий.

Реактивы и материалы. Аналитические аэрозольные фильтры из ацетилцеллюлозы типа АФА-БА, АФА-ХА и т.п. Иммерсионное масло. Малахитовый зеленый, 5-процентный водный раствор. Метиленовый синий, 0,3-процентный спиртовой раствор. Мясо-пептонный агар 1,5-процентный, pH 7,0 - 7,2. Физиологический раствор (0,85-процентный водный раствор хлорида натрия) стерильный. Формалин. Эозин, 0,5-процентный водно-карболовый раствор.

Приборы, аппаратура, посуда. Автоклав. Аппарат для встряхивания. Водяная баня. Колбы на 100 мл. Микроскоп. Петля микробиологическая. Пипетки на 1 и 10 мл. Пробирки. Резиновые соединительные трубки. Стекла предметные. Термостат. Фильтродержатели. Чашки Петри. Шпатель Дрыгальского. Эксикатор. Электроаспиратор.

Посуду и питательные среды стерилизуют в автоклаве при 120 °C 30 мин. Аналитические фильтры стерилизуют в эксикаторе в парах формалина в течение 24 ч.

Отбор проб. Бактериальные инсектицидные препараты (бациллы турингиензис) улавливают из воздуха на аналитические аэрозольные фильтры из ацетилцеллюлозы путем фильтрации через них воздуха. Через фильтр просасывают 10 - 100 мл воздуха со скоростью 5 - 15 л/мин. и более. Пробы растений, почвы и других объектов окружающей среды отбирают в количестве 100 - 150 г. Пробы отбирают и хранят, соблюдая стерильность. Хранят при температуре 2 - 5 °C.

Ход анализа. Аналитический фильтр или навеску растений, почвы и т.п. в количестве 1 - 2 г помещают в колбу, заливают 10 - 20 мл физиологического раствора и смывают бациллы турингиензис путем встряхивания в течение 20 - 30 мин. Затем колбу помещают в водяную баню с температурой воды 80 °C на 10 мин. Из пастеризованного смыва готовят разведения в физиологическом растворе 1:10, 1:100, 1:1000 и т.д. На чашки Петри с мясо-пептонным агаром засевают по 0,1 мл исходного смыва и его разведений (в зависимости от предполагаемого бактериального обсеменения исследуемой пробы). На каждое разведение используют по 2 - 5 чашек. Чашки Петри помещают в термостат с температурой нагрева 28 °C. Через 48 - 72 ч проводят идентификацию и подсчет колоний бацилл турингиензис. При идентификации учитывают внешний вид колоний (компактные, 1,5 - 2,5 мм в диаметре, сероватого цвета с ризоидными краями) и готовят из "характерных" колоний препараты для микроскопического исследования.

На чистое обезжиренное предметное стекло наносят каплю физиологического раствора и микробную массу из части колонии, смешивают и распределяют на площади 1 - 2 кв. см, высушивают на воздухе, фиксируют над пламенем горелки и красят раствором метиленового синего в течение 2 - 3 мин. Рассматривают препарат в микроскоп через иммерсионную систему.

Бациллы турингиензис - сине-фиолетовые крупные палочки (2,5 - 5,0 x 1,3 - 1,8 мкм) с закругленными концами, единичные или в виде нитей из 5 - 10 клеток. Через 48 - 72 ч роста на мясо-пептонном агаре бациллы турингиензис образуют споры (овальной формы, 0,7 x 1,0 мкм, размещены около центра клетки) и кристаллоидные белоксодержащие включения эндотоксина (ромбовидной или овальной формы, 0,5 x 2,0 мкм). Для дифференциации бацилл турингиензис от бацилл цереус и других почвенных спорообразующих бактерий применяют специальный метод окраски препаратов.

Мазок красят раствором малахитового зеленого при подогреве над пламенем горелки до появления паров, промывают водой и докрашивают в течение 30 с водно-карболовым раствором эозина. При этом способе окраски споры становятся зелеными, а кристаллы эндотоксина - красными. Бациллы цереус и другие почвенные спорообразователи не содержат указанных внутриклеточных включений, что и служит дифференциальным признаком.

После идентификации подсчитывают колонии бацилл турингиензис, выросшие на каждой чашке Петри. В расчет обсемененности исследованной пробы принимают то разведение смыва, при дублированном посеве которого на чашках Петри выросло по 25 - 250 колоний бацилл турингиензис.

Обработка результатов анализа. Концентрацию бактериального инсектицидного препарата в исследованной пробе воздуха (X, м.т./куб. м), почвы, растений и т.п. (X, м.т./кг) рассчитывают по формуле:

                              1000ABV

                                     1

                          X = --------,

                                VV

                                  2

где:

A - среднее значение количества колоний бацилл турингиензис на чашках Петри, засеянных принятым в расчет разведенным смывом;

B - принятое в расчет разведение смыва (1, 10, 100 и т.п.);

V - объем засеянного на чашку Петри разведенного смыва, мл;

    V  - объем смыва, мл;

     1

    V   -  объем пробы воздуха, приведенный к нормальным условиям,

     2

или навеска пробы растений, почвы, л или г;

1000 - коэффициент пересчета в куб. м или г в кг.

Концентрация бактериального инсектицидного препарата в исследованной пробе может быть представлена в весовых единицах (мг/куб. м, мг/кг), для чего в знаменатель формулы следует ввести коэффициент C - стандартное содержание бацилл турингиензис в препарате, м.т./мг.

Требования безопасности. Соблюдаются меры безопасности, обычно рекомендуемые для работ с непатогенными культурами бактерий и других микроорганизмов.