Утверждаю

Начальник Главного

санитарно-эпидемиологического

управления Министерства

здравоохранения СССР

А.ПАВЛОВ

25 октября 1968 г. N 760а-68

ИНСТРУКЦИЯ

ПО ПРИМЕНЕНИЮ РЕАКЦИИ НЕПРЯМОЙ ГЕМАГГЛЮТИНАЦИИ (РНГА)

ДЛЯ ОБНАРУЖЕНИЯ СТОЛБНЯЧНОГО МИКРОБА В ОБЪЕКТАХ

ВНЕШНЕЙ СРЕДЫ <*>

--------------------------------

<*> Инструкция подготовлена сотрудниками ордена Трудового Красного Знамени Института эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи АМН СССР Т.И. Сергеевой, К.И. Матвеевым и Т.И. Булатовой.

Метод обнаружения столбнячного микроба с помощью реакции непрямой гемагглютинации является высоко специфичным и может быть применен в лабораториях санэпидстанций, больниц, научно-исследовательских институтах как вспомогательный метод исследования с целью установления обсемененности предметов внешней среды при проверке запыленности больничных помещений, проверке на стерильность перевязочного материала и др.

I. Объекты и цели исследования

Исследование на наличие столбнячного микроба производится в следующих случаях:

а) при изучении краевой эпидемиологии столбняка с целью установления степени обсемененности Cl. tetani почвы, пыли, растений и других объектов внешней среды;

б) при проведении плановых санитарно-гигиенических анализов на запыленность больничных помещений: палат, перевязочных, предоперационных, операционных, родильных и детских отделений, а также при проверке на стерильность перевязочных материалов, кетгута, шелка, лекарственных средств и т.п.;

в) при анализе материалов от больных с целью подтверждения диагноза и от трупов - для постмортального заключения.

II. Взятие проб для исследования

1. Пробы почвы берутся в стерильные бактериологические пробирки с резиновыми пробками. Пробы почвы следует брать на расстоянии трех - пяти метров друг от друга в населенных пунктах (дворы, скотные дворы, огороды, сады, дороги, улицы, детские и спортивные площадки и т.д.), а также в лугах, полях, пастбищах, лесах, на берегах рек.

Для взятия почвы пробирка извлекается из стерильного бумажного пакета, нижней частью пробирки сдвигается поверхностный слой почвы в 3 - 5 см, затем открытым концом пробирки путем винтообразного движения вглубь набирается почва, после чего плотно закрывается <*>. На пробирке делают надпись: место взятия почвы, номер пробы, дата. Листья, растения и другие объекты помещаются в стерильную посуду.

--------------------------------

<*> Применение шпаделей для снятия поверхностного слоя почвы затруднено, так как требуется на каждую пробу стерильный шпадель.

2. Для взятия пыли в помещениях необходимо заготовить тампоны из ваты на палочке, смочить тампоны физиологическим раствором, вложить их в пробирки, закрыть пробирки резиновыми пробками и простерилизовать в автоклаве. Взятие пыли производится следующим образом: тампоны извлекают за кончик палочки из пробирки и влажным тампоном собирают пыль с поверхности предметов, после чего опять помещают в пробирку, которая закрывается пробкой и надписывается.

Для анализа перевязочные средства, образцы кетгута, шелка, лекарств направляются в заводской упаковке или же из них делается выборочное взятие стерильными инструментами тампонов, марлевых салфеток, ваты и других материалов, которые помещаются в стерильную посуду с надписью, содержащей название материала, место взятия и дату.

3. При подозрении на столбняк от больных берут на исследование содержимое раны, отторгнутые ткани, инородные тела, извлеченные из ран, перевязочные средства (тампоны, дренажные трубки, кетгут, шелк и т.д.). При криминальных абортах следует брать тампоном выделения из шейки матки. В случае подозрения на столбняк у новорожденного необходимо взять на исследование ткани из пупочной ранки, тампоны, повязки, шелк, использованные для перевязки пуповины. От трупов следует брать кусочек мышечной ткани из предполагаемого места внедрения инфекции и содержимое раны. Для взятия материала на исследование применяются стерильные инструменты и посуда. Пробы этикетируются, где указывается название материала, фамилия, имя, отчество больного или трупа, дата взятия. Все пробы до исследования должны храниться при температуре не выше 4°.

III. Посев исследуемых материалов

Исследование всех вышеуказанных материалов производится путем посева их на жидкую среду и дальнейшего исследования культуральной жидкости посевов с помощью реакции непрямой гемагглютинации (РНГА).

Для посевов используется бульон Глузмана или бульон Вейнберга с кусочками мяса под вазелиновым маслом при рН 7,2 - 7,4, разлитые по 70 мл во флаконы емкостью 100 мл.

Перед посевом флаконы со средой прогревают на водяной бане при 100° в течение 10 минут для регенерации среды, после чего охлаждают до 45°.

В каждый флакон перед посевом добавляют по 0,5% стерильного 40% раствора глюкозы (1 мл на флакон).

Посев почвы производится следующим образом: в пробирку с пробой почвы добавляют равный объем физиологического раствора, после чего почва тщательно перемешивается пастеровской пипеткой, спустя 40 - 60 минут выдерживания при комнатной температуре по 2 - 3 мл почвенной суспензии вносится во флакон со средой.

Тампон с пылью извлекают за палочку из пробирки, осторожно отделяют его пипеткой от палочки и целиком помещают в питательную среду. Листья, растения и другие предметы помещают стерильным пинцетом во флакон со средой.

Перевязочные и другие материалы, проверяемые на стерильность, исследуют в специальных стерильных боксах и одежде с соблюдением правил асептики. Приблизительно по 2 - 3 гр. материала (тампоны, бинты, вата, кетгут, шелк и т.д.) извлекают стерильными инструментами и помещают в среду.

Кусочки тканей, взятые из трупов, предварительно измельчаются, а затем вносятся в питательную среду; содержимое раны, тампоны и другие материалы от больных засеваются так же, как указано выше.

Все посевы помещают в термостат при 37°. При наличии роста исследование посевов следует начинать спустя 48 часов после посева.

Посевы материалов, подвергавшихся стерилизации (перевязочные средства, кетгут, шелк), необходимо при отсутствии видимого роста выдерживать в термостате до 2-х недель. Трех - четырехсуточные посевы испытуемых материалов исследуются методом реакции непрямой гемагглютинации (РНГА) и микроскопированием.

IV. Материалы и реактивы, необходимые для постановки РНГА

Для постановки РНГА необходимы следующие реактивы и материалы:

1) Реактивы для приготовления буферных растворов:

    1/15 М NaHPO 2H O

                4  2

    1/15 М KH PO

             2  4

физиологический раствор

2) Танин

3) Противостолбнячная сыворотка, очищенная и концентрированная методом "Диаферм-3" активностью 1000 - 1500 АЕ в 1 мл

4) Бараньи эритроциты (нативные, консервированные в растворе Олсвера или формалинизированные эритроциты)

5) Нормальная кроличья сыворотка

6) Столбнячный очищенный, концентрированный, но не адсорбированный анатоксин, активностью 150 - 200 ЕС в 1 мл

7) Доски для гемагглютинации из плексигласа с 72 лунками. Объем лунки 2 мл

8) Шприц непрерывного действия на 1 мл

9) Пипетки градуированные на 1, 2, 5 мл.

Приготовление буферных растворов

    Для приготовления 1 литра 1/15 М Na HPO 2H O  раствора   берется  11,88

                                       2   4  2

г реактива и добавляется до 1 литра физиологический раствор.

    Для приготовления 1  литра  1/15  М  KH PO   раствора  берется  9,08  г

                                           2  4

реактива и добавляется до 1 литра теплый (45°) физиологический раствор.  Из

этих исходных растворов готовятся буферные растворы для постановки РНГА.

    Буфер с рН 6,4

                                    ┐

    1/15 М Na HPO 2H O    - 61,1 мл │

             2   4  2               │       100 мл

    1/15 М KH PO          - 38,9 мл │

             2  4                   ┘

    Буфер с рН 7,0

                                    ┐

    1/15 М Na HPO 2H O    - 53,4 мл │

             2   4  2               │       240 мл

    1/15 М KH PO          - 186,6 мл│

             2  4                   ┘

Для получения большего количества буферных растворов составные части увеличивают в нужное число раз. Буферные растворы изготовляют заранее, контролируют их рН и сохраняют при 4 - 10°.

Приготовление раствора танина

Для танизирования эритроцитов используется медицинский порошкообразный танин. Рабочим разведением танина является разведение его в физиологическом растворе в соотношении 1:20000.

Сначала готовят исходный раствор танина, который можно сохранять в холодильнике при 4 - 10° в течение 2 - 3-х недель и использовать для работы.

Для приготовления исходного раствора взвешивают на торсионных или аналитических весах 10 - 12 мг танина и помещают в пробирку, куда добавляют физиологический раствор до концентрации 1 мг/мл, в результате чего получают разведение танина 1:1000. Для получения разведения 1:20000 исходный раствор разводят в 20 раз (1 мл исходного раствора + 19 мл физиологического раствора).

Противостолбнячная сыворотка "Диаферм-3" должна быть первоначально апробирована в РНГА со столбнячным анатоксином или токсином, так как не всякая серия сыворотки бывает пригодна для сенсибилизации эритроцитов. Методика проверки сыворотки изложена ниже.

Бараньи эритроциты

Для РНГА лучше использовать эритроциты, консервированные в растворе Олсвера, которые при хранении в холодильнике могут быть применены для РНГА в течение 3 - 4-х недель.

Раствор Олсвера для консервации эритроцитов:

1) Глюкоза - 2,05 г

2) Лимоннокислый Na - 0,8 г

3) Хлористый Na - 0,42 г

4) Дистиллированная вода - до 100 мл.

Установить рН - 6,1 - 6,2, стерилизовать 2 раза по 30 минут текучим паром. Кровь из барана берется в стерильную посуду с раствором Олсвера в соотношении 1:1.

Для РНГА можно использовать также формалинизированные эритроциты и танизированные по методу М.И. Леви (1962, 1967), которые в течение нескольких месяцев сохраняют свои свойства.

V. Методика постановки реакции

Приготовление танизированных эритроцитов

По 3 - 5 мл нативных или консервированных эритроцитов барана отмывают 4 - 5 раз физиологическим раствором в центрифуге при 2500 - 3000 об./мин. по 5 - 7 минут. Прозрачную бесцветную надосадочную жидкость сливают, по 0,15 мл осадка отмытых эритроцитов помещают в центрифужные пробирки, куда вносят 4 мл физиологического раствора и 4 мл рабочего разведения танина (1:20000), смесь выдерживают при 37° в течение 10 минут и отмывают:

а) смесь центрифугируют 5 - 7 минут при 3000 об./мин., надосадочную жидкость сливают;

б) осадок отмывают физиологическим раствором 2 раза.

Сенсибилизация эритроцитов противостолбнячной

сывороткой

К осадку отмытых танизированных эритроцитов добавляют 3 мл противостолбнячной сыворотки, разведенной 1:10 буферным физиологическим раствором с рН - 6,4. Смесь выдерживают при 37° в течение 1 часа, после чего отмывают на центрифуге:

а) центрифугируют 5 - 7 минут при 3000 об./мин., надосадочную жидкость сливают;

б) осадок отмывают 4 мл буферного физиологического раствора с рН 6,4, надосадочную жидкость сливают;

в) осадок отмывают буферным физиологическим раствором рН 6,4 с 1% нормальной инактивированной при 56° 30 минут кроличьей сывороткой, надосадочную жидкость сливают;

г) осадок суспендируют в 6 мл буферного раствора рН 6,4 с 1% нормальной инактивированной кроличьей сывороткой - получается 2,5% взвесь танизированных сенсибилизированных противостолбнячной сывороткой эритроцитов.

Сенсибилизация танизированных формалинизированных эритроцитов производится следующим образом: 5 мл 2,5% взвеси эритроцитов отмывают физиологическим раствором, к осадку добавляют противостолбнячную сыворотку в указанном количестве, смесь выдерживают в термостате 2 часа, после чего отмывают, как указано выше, и взвешивают в 5 мл физиологического раствора с pH 6,4 и 1% нормальной кроличьей сывороткой (инактивированной).

Разведение исследуемого материала

Из посевов исследуемого материала на жидкие питательные среды спустя 48 часов инкубации при 37° берут по 0,5 мл культуральной жидкости, делают мазок на предметном стекле для микроскопирования, а затем разводят в 5 раз буферным физиологическим раствором рН 7,0 и 0,4% нормальной кроличьей инактивированной сывороткой (1:250).

Во все лунки доски для гемагглютинации разливают по 0,5 мл буферный раствор рН 7,0 с 0,4% кроличьей сыворотки. В 1-ю лунку вносят 0,5 мл разведенной в 5 раз культуральной жидкости, далее делают последовательные 2-кратные разведения исследуемого материала путем переноса из лунки в лунку по 0,5 мл смеси, из предпоследней лунки 0,5 мл выливают, последняя лунка остается для контроля. Таким образом получают разведения испытуемой культуральной жидкости от 1:10 до 1:10240 <*> (схема 1).

--------------------------------

<*> При апробации противостолбнячных сывороток таким же образом разводят столбнячный анатоксин или столбнячный токсин.

Схема 1

В первую лунку каждого из 5 горизонтальных рядов вносят исходные разведения пяти исследуемых культур (N 1 - 5). В 6-й ряд вносят 0,5 мл столбнячного анатоксина или токсина и разводят так же (контроль активности сенсибилизированных эритроцитов). После приготовления разведений испытуемого материала в каждую лунку, включая и контрольные, вносят по 0,1 мл взвеси танизированных сенсибилизированных сывороткой эритроцитов. Содержимое лунок тщательно перемешивают путем осторожного встряхивания, и доски помещают в термостат на 1 час при 37°, а затем оставляют при комнатной температуре. Предварительный учет результатов реакции производят через 2 - 3 часа, окончательный через 18 часов.

Учет результатов

Учет результатов производится визуально по следующей схеме:

(+) - положительная реакция: равномерная агглютинация эритроцитов, лунка заполнена гомогенной розовой взвесью;

(+/-) - учитываемая крайняя положительная реакция: зона агглютинированных эритроцитов несколько меньше диаметра лунки и окружена красным тонким ободком эритроцитов;

(-) - отрицательная реакция: зона эритроцитов занимает половину или менее диаметра лунки и окружена плотным красным ободком или представляет собой плотный красный диск ("пуговка"), лежащий на дне лунки.

За положительный результат следует считать (+) или (+/-) реакцию в разведении 1:20 и выше испытуемого материала (т.е. во 2-й и последующих лунках горизонтального ряда доски), при отрицательном контроле в вертикальном 12-м ряду и положительном - в 6-м горизонтальном ряду в разведении не менее 1:1280 - 1:2560 <*>.

--------------------------------

<*> При контроле противостолбнячных сывороток следует отбирать для работы те серии сывороток, которые дают положительный результат в РНГА с анатоксином или токсином в разведении не менее чем до 1:2560 - 1:5120.

Мазки, приготовленные из каждого исследуемого посева, фиксируют над пламенем, окрашивают по Граму и микроскопируют. Наличие в препарате грамположительных палочковидных микробов со спорами в виде барабанной палочки при положительной РНГА с данным посевом указывает на наличие возбудителей столбняка в исследуемом материале.

При наличии в препарате микробов, похожих на Cl. tetani, и сомнительной реакции гемагглютинации необходимо повторить РНГА на 5 - 6-е сутки выращивания посевов, а также поставить биологическую пробу на белых мышах.

Для этого нужно развести испытуемую культуральную жидкость в 5 раз и ввести по 0,5 мл двум белым мышам в мышцу задней лапки. Появление признаков столбняка (напряжение хвоста и конечности на стороне введения, изгибание позвоночника, судороги) у мыши свидетельствует о наличии столбнячного микроба.

При выделении чистой культуры с целью идентификации столбнячного микроба путем посева на высокий столбик высевы отдельных колоний на жидкую среду следует проверять также по указанной методике.