"Временные методические указания по определению остаточных количеств титуса в зеленой массе и зерне кукурузы высокоэффективной жидкостной хроматографией" // Технорма.RU

Утверждены

Министерством здравоохранения СССР

29 июля 1991 г. N 6193-91

ВРЕМЕННЫЕ МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

ПО ОПРЕДЕЛЕНИЮ ОСТАТОЧНЫХ КОЛИЧЕСТВ ТИТУСА В ЗЕЛЕНОЙ МАССЕ

И ЗЕРНЕ КУКУРУЗЫ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИЕЙ

Настоящие Методические указания предназначены для санитарно-эпидемиологических станций и научно-исследовательских учреждений Минздрава РФ, а также ветеринарных, агрохимических, контрольно-токсикологических лабораторий Минсельхоза РФ и лабораторий других ведомств, занимающихся определением остаточных количеств пестицидов, регуляторов роста растений и биопрепаратов в продуктах питания, кормах и внешней среде.

Методические указания апробированы и рекомендованы в качестве официальных Группой экспертов при Госхимкомиссии по химическим средствам борьбы с вредителями, болезнями растений и сорняками.

1. Краткое описание препарата

Химическое название: 1-(4,6-диметоксипиримидин-2-ил)-3-[(3-этилсульфонилпиридин-2-ил)сульфонил]мочевина.

OCH

___N N___/ 3

// \\---SO NH-C-NH--// \\

\ ___ / 2 \\ \ ___ /

--- \ O N --- \

SO C H OCH

2 2 5 3

Общепринятые названия: титус, ДРХ-Е9636.

Эмпирическая формула: C H N O S .

14 17 5 7 2

Молекулярная масса: 431,4.

Химически чистый титус представляет собой белое кристаллическое вещество с температурой плавления 176 - 178 °C. В виде сухой пленки на стекле и в растворе в ацетонитриле относительно устойчив; в кислой (pH < 3) и щелочной среде (pH > 9) быстро гидролизуется. Период полураспада в водной среде при pH 5 - 4,6 дня; pH 7 - 7,2 дня; pH 9 - 0,3 дня, в почве - от 1,7 до 4,3 дня.

Хорошо растворим в ацетонитриле, метиленхлориде и хлороформе. Растворимость в дистиллированной воде: при 25 °C < 10 мг/л, в буферном растворе при pH 7 - 7,3 г/л.

Титус малотоксичен для человека и теплокровных животных (СД

для крыс > 5000 мг/кг), не обладает побочными токсическими

эффектами, может вызвать слабое раздражение слизистой оболочки

глаз.

Титус - новый повсходовый гербицид, эффективный в борьбе со злаковыми однолетними и многолетними сорняками в посевах кукурузы и посадках картофеля. Зарегистрирован в России как средство борьбы со злаковыми сорняками, особенно гумаем ползучим, в посевах кукурузы в виде 75-процентной сухой текучей суспензии с нормой расхода 40 - 50 г/га.

2. Методика определения титуса в зеленой массе и зерне

кукурузы методом высокоэффективной жидкостной хроматографии

2.1. Основные положения

2.1.1. Принцип метода

Методика основана на определении остатков титуса с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии с использованием фотокондуктивного детектора и колонки с силикагелем. Определение проводят после экстракции гербицида буферной смесью и реэкстракции метиленхлоридом.

Количественное определение проводится методом абсолютной калибровки.

2.1.2. Избирательность метода

В предлагаемых условиях метод специфичен в присутствии пестицидов, применяемых при выращивании кукурузы: 2,4-Д, симазин, атразин, эрадикан.

2.1.3. Метрологическая характеристика метода

Таблица 1

┌─────────────┬───┬────────────────────────────────────────────────────────────┐

│Анализируемый│ n │ Метрологические параметры, P = 0,95 │

│ объект │ ├───────┬─────────────┬────────────┬─────────────┬───────────┤

│ │ │предел │ диапазон │ среднее │ стандартное │доверитель-│

│ │ │обнару-│определяемых │ значение │отклонение S,│ный │

│ │ │жения, │концентраций,│определения,│ % │интервал │

│ │ │мг/кг │ мг/кг │ % │ │среднего │

│ │ │ │ │ │ │результата,│

│ │ │ │ │ │ │% │

├─────────────┼───┼───────┼─────────────┼────────────┼─────────────┼───────────┤

│Зеленая масса│ │ │ │ │ │ │

│растений │15 │0,05 │0,05 - 1,0 │89,0 │7,48 │+/- 4,1 │

│Зерно │ │ │ │ │ │ │

│кукурузы │15 │0,05 │0,05 - 1,0 │86,5 │6,40 │+/- 3,5 │

└─────────────┴───┴───────┴─────────────┴────────────┴─────────────┴───────────┘

2.2. Реактивы и материалы

Титус с содержанием действующего вещества 99,5% фирмы Дюпон.

Ацетонитрил, ТУ 6-09-3534-82.

Вода бидистиллят, ГОСТ 7602-72.

Калий фосфорнокислый двузамещенный.

Кислота уксусная ледяная, ГОСТ 61-75.

Кислота ортофосфорная, ГОСТ 6552-80.

Метилен хлористый для хроматографии, ГОСТ 12794-80.

Натрий сернокислый безводный, хч, ГОСТ 4166-76.

Спирт изопропиловый, ГОСТ 9805-84.

Спирт метиловый для хроматографии, ТУ 6-09-1709-77.

Циклогексан для хроматографии, ТУ 6-09-1832-77.

Приготовление растворов:

а) 1 - молярный раствор K HPO : 174 г фосфорнокислого

2 4

двузамещенного калия помещают в мерную колбу объемом 1000 мл,

добавляют дистиллированной воды до полного растворения соли и

доводят объем водой до метки;

б) фосфатный буфер (pH 7,0): смешивают 150 мл 1 М K HPO с

2 4

1350 мл дистиллированной воды. Доводят pH смеси до 7,0, добавляя

по каплям концентрированную ортофосфорную кислоту и контролируя pH

среды с помощью универсального иономера;

в) экстрагирующая смесь: готовят смесь метанола с фосфатным буфером в соотношении 75:25 по объему;

г) подвижная фаза для ВЭЖХ: циклогексан - 750 мл, изопропанол - 125 мл, метанол - 125 мл, смесь уксусной кислоты с водой (9:1) - 1 мл;

д) состав для кондиционирования колонки: изопропанол - 400 мл, уксусная кислота ледяная - 100 мл, вода бидистиллят - 10 мл.

Приборы, аппаратура, посуда

Жидкостный хроматограф "Уотерс", модель 510, с фотокондуктивным детектором "Тракор", модель 965, или другой аналогичного типа.

Колонка стальная длиной 30 см с сорбентом на основе силикагеля с удельной поверхностью 300 кв. м/г и размером частиц 10 мкм марки мю-Порасил фирмы Уотерс или Силасорб-300 фирмы Хемапол.

Мельница лабораторная.

Гомогенизатор лабораторный со стаканом емкостью 100 - 150 мл.

Ротационный вакуумный испаритель ИР-1М, ТУ 25-11-917-74, или аналогичного типа.

Водоструйный насос, ГОСТ 25336-82.

Иономер универсальный ЭВ-74.

Воронки конические, стеклянные, ГОСТ 25336-82.

Воронки делительные на 500 мл, ГОСТ 25336-82.

Концентраторы грушевидные КТУ-100-14/19 НШ-19, ГОСТ 25336-82.

Воронки Бюхнера фарфоровые диаметром 70 мм, ГОСТ 9147-80.

Колбы Бунзена объемом 800 мл, ГОСТ 25336-82.

Пипетки мерные на 2,0; 1,0; 5,0; 10,0; 25 мл, ГОСТ 20292-74.

Колбы мерные на 25, 50 и 100 мл, ГОСТ 1770-74.

Вата стеклянная для хроматографии.

Фильтры диаметром 20 мм с отверстиями 20 мкм фирмы Милипор.

2.3. Отбор проб

Отбор проб проводится в соответствии с "Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, пищевых продуктов и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов" (N 2051-79 от 21.08.79). Отобранные пробы зерна подсушивают до стандартной влажности и хранят в сухом, хорошо вентилируемом помещении. Перед анализом пробы размалывают на лабораторной мельнице до размеров частиц менее 1 мм.

Пробы зеленой массы замораживают и хранят в холодильнике при температуре ниже -15 °C.

2.4. Подготовка к определению

2.4.1. Кондиционирование хроматографической колонки

Перед началом работы хроматографа раствор для кондиционирования колонки и подвижную фазу дегазируют в течение 2-х часов, пропуская через растворы гелий. Операцию повторяют ежедневно в течение 1 часа перед началом анализа, не выключал прибора. При добавлении новой порции растворителей дегазирование проводят в течение 2-х часов.

Готовую колонку устанавливают в термостат хроматографа и стабилизируют при 35 °C, пропуская через нее в течение 4-х часов раствор для кондиционирования колонки со скоростью 0,5 мл и затем еще 4 часа подвижную фазу для ВЭЖХ с той же скоростью. Эту операцию проводят ежедневно перед началом ввода проб в ночное время с использованием таймеров (реле времени). Нарушение данного режима приводит к резкой потере чувствительности.

2.4.2. Приготовление стандартных растворов

Стандартный раствор N 1 с концентрацией титуса 1 мг/мл готовят следующим образом: взвешивают 50 мг титуса с точностью +/- 0,0002 г, переносят навеску в мерную колбу на 50 мл ацетонитрилом и доводят объем раствора до метки этим же растворителем. Методом последовательного разбавления в ацетонитриле готовят стандартный раствор N 2 с концентрацией 100 мкг/мл. Растворы N 1 и 2 можно хранить в холодильнике не более 1 месяца.

Для калибровки хроматографа ежедневно готовят рабочие стандартные растворы с концентрацией титуса 0,1; 0,2; 0,4; 0,6 мкг/мл, внося пипеткой соответствующее количество раствора N 2 в мерные колбы, упаривая ацетонитрил досуха током азота и доводя объем раствора до метки подвижной фазой без уксусной кислоты.

Хроматографируют по 20 мкл каждого рабочего раствора, измеряют высоту пика (или площадь) и строят график зависимости высоты (площади) пика от концентрации титуса.

2.5. Описание определения

2.5.1. Экстракция и очистка экстракта

Навеску измельченного зерна или зеленой массы - 10 г помещают в пластиковую банку с крышкой, приливают 100 мл экстрагирующей смеси и гомогенизируют в течение 1 мин. при скорости 1500 об./мин. Банки с гомогенатом устанавливают на встряхиватель, закрывают плотно крышками и встряхивают 10 мин. По истечении срока банки переносят в центрифугу с охлаждением и центрифугируют 10 мин. при скорости 3500 - 4500 об./мин. Экстракт осторожно переносят в воронку Бюхнера с бумажным фильтром и фильтруют под вакуумом в колбу Бунзена. Экстракцию повторяют, добавляя в банку 50 мл ацетонитрила, встряхивая 10 мин., центрифугируя и отфильтровывая. Объединенный экстракт переносят из колбы Бунзена в чистую пластиковую банку объемом 250 мл, обмывая колбу экстрагирующей смесью. К экстракту приливают 50 мл метиленхлорида, банку плотно закрывают крышкой и интенсивно встряхивают смесь в течение 10 мин. Затем экстракт центрифугируют 10 мин. при 3500 - 4500 об./мин. Содержимое банки осторожно (по стеклянной палочке) переносят в делительную воронку и нижний слой (метиленхлорид) сливают в концентратор через безводный сульфат натрия. Повторяют экстракцию еще 2 раза порциями метиленхлорида по 50 мл с последующим центрифугированием. Объединенные экстракты упаривают досуха на ротационном испарителе при t = 40 °C.

Сухой остаток растворяют в 5 мл подвижной фазы, не содержащей уксусной кислоты, и вводят в хроматограф 20 мкл раствора.

2.5.2. Условия хроматографирования

Жидкостный хроматограф "Уотерс", модель 510, с программатором температуры и фотокондуктивным детектором "Трактор", модель 365.

Показания аттенуатора - 1 x 50.

Скорость движения ленты самописца - 120 мм/час.

Колонка стальная длиной 30 см, внутренний диаметр 3 мм. Неподвижная фаза - мю-Порасил, Уотерс.

Температура колонки - 35 °C.

Скорость потока подвижной фазы - 0,3 мл/мин.

Объем пробы, вводимой в колонку, - 20 мкл.

Абсолютное время удерживания титуса - 27 мин. 29 сек.

Линейность детектирования сохраняется в пределах 2 - 20 нг.

Каждую анализируемую пробу вводят 2 раза и вычисляют среднюю высоту (площадь) пика. Образцы, дающие пики большие, чем стандартный раствор 1,0 мкг/мл, разбавляют.

2.5.3. Обработка результатов анализов

Содержание титуса рассчитывают методом соотношения со стандартом по формуле:

П x A x V

пр

X = -----------,

П x p

где:

X - содержание гербицидов в пробе, мг/кг;

П - высота (площадь) пика стандарта, мм;

П - высота (площадь) пика образца, мл;

пр

A - концентрация стандартного раствора, мкг/мл;

V - объем экстракта, подготовленного для хроматографирования,

мл;

p - масса анализируемого образца, г.

3. Требования техники безопасности

Необходимо соблюдать общепринятые правила безопасности при работе с органическими растворителями, токсичными веществами, электронагревательными приборами и сжатыми газами.

Таблица 2

ПОЛНОТА ОПРЕДЕЛЕНИЯ ТИТУСА В ЗЕЛЕНОЙ МАССЕ И ЗЕРНЕ КУКУРУЗЫ

(5 ПОВТОРНОСТЕЙ ДЛЯ КАЖДОЙ КОНЦЕНТРАЦИИ)

┌────────────────┬─────────────────┬─────────────────┬────────────────────┐

│ Среда │Добавлено титуса,│Обнаружено, мг/кг│Полнота определения,│

│ │ мг/кг │ │ % │

├────────────────┼─────────────────┼─────────────────┼────────────────────┤

│Зеленая масса │0,5 │0,469 │93,8 │

│ │0,1 │0,00833 │83,3 │

│ │0,05 │0,045 │90,0 │

│Зерно кукурузы │0,5 │0,418 │83,5 │

│ │0,1 │0,0859 │85,9 │

│ │0,05 │0,045 │90,0 │

└────────────────┴─────────────────┴─────────────────┴────────────────────┘