"Методические указания по определению глуфосинат аммония (баста) и его метаболита в почве хроматографическими методами" // Технорма.RU

Утверждены

Министерством здравоохранения СССР

29 июля 1991 г. N 6153-91

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

ПО ОПРЕДЕЛЕНИЮ ГЛУФОСИНАТ АММОНИЯ (БАСТА) И ЕГО МЕТАБОЛИТА

В ПОЧВЕ ХРОМАТОГРАФИЧЕСКИМИ МЕТОДАМИ

Настоящие Методические указания предназначены для санитарно-эпидемиологических станций и научно-исследовательских учреждений Минздрава РФ, а также ветеринарных, агрохимических, контрольно-токсикологических лабораторий Минсельхоза РФ и лабораторий других ведомств, занимающихся определением остаточных количеств пестицидов, регуляторов роста растений и биопрепаратов в продуктах питания, кормах и внешней среде.

Методические указания апробированы и рекомендованы в качестве официальных Группой экспертов при Госхимкомиссии по химическим средствам борьбы с вредителями, болезнями растений и сорняками.

1. Краткая характеристика препаратов

Баста (глуфосинат аммоний) - DL-гомоаланин-4-ил(метил)-фосфонат аммония (по номенклатуре ИЮПАК).

│ - +

(CH P-CH -CH -CH-COOH) NH C H N O P.

3\\ 2 2 │ 4 5 15 2 4

O NH

2 М.м. 198,2.

Фирменное название - ХОБ 039866.

Белое кристаллическое вещество, температура плавления 215 °C (разлагается). Растворим в воде, не растворим в органических растворителях. ОДУ в воде водоемов 0,02 мг/л.

Гербицид для борьбы с широким спектром одно- и многолетних двудольных и злаковых сорняков в овощеводстве, виноградарстве, садоводстве.

Метаболит глуфосината аммония - 3-метилфосфинатпропионовая кислота.

│ C H O P.

CH -P -CH -CH -COOH 4 9 4

3 ││ 2 2

O М.м. 152,1.

Фирменное название - ХОЕ 061517.

2. Методика определения глуфосинат аммония (баста)

и его метаболита в почве

2.1. Основные положения

2.1.1. Принцип метода

Метод основан на извлечении глуфосинат аммония и метаболита из почвы двухфазной смесью вода - хлороформ, отделении и концентрировании водной фазы, очистке препаратов на колонке с полисорбом.

Из аликвоты (1/10) подготовленного экстракта проводят определение глуфосинат аммония методом хроматографии в тонком слое (ТСХ) на пластинках "Силуфол" или "Армсорб", обнаружение по реакции с нингидрином.

После концентрирования оставшейся части экстракта (9/10) определение глуфосинат аммония и метаболита проводят методом реакционной (реакция с триметилортоацетатом) газожидкостной хроматографии о термоионным (ТИД) или с пламенно-фотометрическим фосфорным (ПФД) детектором в виде производных:

OCH

│

CH P-CH -CH -CH-COOCH (производное от глуфосинат аммония)

3\\ 2 2 │ 3

O NH

│

O=C-CH

OCH

│

CH -P-CH -CH -COOCH (производное от метаболита баста)

3 \\ 2 2 3

2.1.2. Метрологическая характеристика метода

Метрологическая характеристика метода приведена в таблице.

Таблица

МЕТРОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА

МЕТОДА ОПРЕДЕЛЕНИЯ В ПОЧВЕ БАСТА И ЕГО МЕТАБОЛИТА ГЖХ И ТСХ

┌────────────────────────────────────────┬──────────┬─────────────────────┐

│ Показатели точности измерения │ ТСХ │ ГЖХ │

│ ├──────────┼──────────┬──────────┤

│ │глуфосинат│глуфосинат│метаболит │

│ │ аммония │ аммония │ │

├────────────────────────────────────────┼──────────┼──────────┼──────────┤

│Среднее значение определения (%) │80 │81,4 │83,3 │

│Стандартное отклонение (%) │17,4 │12,8 │13,5 │

│Относительное стандартное отклонение (%)│+/- 7,8 │+/- 5,7 │+/- 6,0 │

│Доверительный интервал (+/-%) │21,6 │15,9 │16,8 │

│Относительная погрешность измерений │27,0 │19,5 │20,1 │

│(+/-%) │ │ │ │

│Предел обнаружения (мг/кг) │0,1 │0,01 │0,01 │

└────────────────────────────────────────┴──────────┴──────────┴──────────┘

2.1.3. Избирательность метода

Определению методом ТСХ не мешают другие ФОП, в том числе водорастворимые глифосат и фосфамид; определению могут мешать водорастворимые коэкстрактивные вещества, содержащие аминогруппу. В связи с этим проводится либо ТСХ-анализ контрольного образца исследуемой почвы, либо наличие препарата подтверждается методом ГЖХ, который избирателен в присутствии этих соединений.

2.2. Реактивы и растворы

Общие для ТСХ и ГЖХ

Ацетон, хч, ГОСТ 2603-79.

Хлороформ, чда, ГОСТ 20015-74.

Полисорб C-60/100, ТУ 6-05-211-1313-86.

Диэтиловый эфир медицинский, ГОСТ 6265-74.

Вата обезжиренная (промытая эфиром).

Фильтры бумажные легкофильтрующие ("красная лента").

Аммиак водный, 25%, ч, ГОСТ 3760-79.

Этилацетат, хч, ГОСТ 22300-81.

Глуфосинат аммоний с содержанием основного вещества не менее 99%.

Метаболит глуфосината аммония с содержанием основного вещества не менее 99%.

Основной стандартный раствор глуфосинат аммония (ОСР): 100 мг баста в 100 мл 1-процентного водного раствора аммиака. Хранить в холодильнике не более 3-х месяцев. ОСР метаболита по этой же прописи.

К методу ТСХ

Этанол 96-процентный, ГОСТ 5962-81.

Медь сернокислая, чда, ГОСТ 19347-84, прокаленная при 160 °C до светло-голубого цвета.

Пластинки "Силуфол", Хемапол, Чехословакия или отечественные.

"Армсорб КСКГ", "Армсорб КСКГ-УФ-254".

Метанол, хч, ГОСТ 6995-77.

Рабочие стандартные растворы глуфосинат аммония. Раствор 1 - 100 мкг/мл - готовят разведением ОСР 1-процентным водным раствором аммиака, хранят в холодильнике не более 2-х недель; раствор 2 - 10 мкг/мл - готовят разведением раствора 1 и раствор 3 - 1 мкг/мл - разведением раствора 2 этанолом в день проведения исследований.

Проявляющий реагент: 2-процентный раствор нингидрина в ацетоне. Хранить в темной склянке.

К методу ГЖХ

Неподвижная фаза - 3% OV-17 на хроматоне N-AW-DMCS.

Азот газообразный особой чистоты, ГОСТ 9293-74.

Водород в баллоне с редуктором, ГОСТ 3022-80.

Толуол, чда, ГОСТ 5789-78.

Уксусная кислота ледяная, ГОСТ 18270-81.

Триметилортоацетат, хч.

Фильтры разового пользования.

Силикагель КСК, ГОСТ 3956-76. Силикагель измельчают до 1 - 2 мм, просеивают, сушат при 130 °C в течение 6 часов, а затем увлажняют до содержания воды 4% по весу. Однородность увлажнения достигается вращением в течение нескольких часов в ротационном испарителе без вакуума. Хранить в склянке с притертой пробкой не более месяца.

Рабочие стандартные растворы глуфосинат аммония (или метаболита): 1' - 40 мкг/мл, 2' - 20 мкг/мл, 3' - 10 мкг/мл - готовят разведением ОСР 1-процентным водным раствором аммиака. Для получения хроматографируемых производных берут по 0,1 мл каждого стандарта, упаривают досуха при комнатной температуре и далее поступают, как описано в разделе получения хроматографируемых производных в образце. Концентрация полученных производных баста (или метаболита) в 2 мл метанола: из 1' - 2 мкг/мл, 2' - 1 мкг/мл, 3' - 0,5 мкг/мл.

2.3. Приборы и посуда

Общие для ГЖХ и ТСХ

Аппарат для встряхивания проб АВУ, ТУ 64-11081-83.

Ротационный вакуумный испаритель ИР-1М с набором колб, ТУ 25-11-917-74.

Вакуумный водоструйный насос, ГОСТ 25336-82.

Колба Бунзена, 250 мл, ГОСТ 25336-82.

Воронка Бюхнера, d = 75 см, ГОСТ 9147-80.

Холодильник бытовой с морозильной камерой.

Колбы конические 250, 50 мл, ГОСТ 25336-82.

Цилиндры мерные емкостью 100, 50 мл, ГОСТ 1770-74.

Пробирки мерные емкостью 5, 10 мл, ГОСТ 1770-74.

Колонки хроматографические, d = 18 мм, высота 20 см.

Пипетки на 1 - 10 мл, ГОСТ 1770-74.

К методу ТСХ

Микропипетки на 0,1; 0,2 мл, ГОСТ 1770-74, или дозаторы пипеточные на 0,1; 0,2 мл П1, ТУ 84-1-3329-81, или шприц на 1 мл.

Камера хроматографическая, ГОСТ 25336-82.

Пульверизатор стеклянный, ГОСТ 25336-82.

Камера для опрыскивания - колпак для насосов с кнопкой и рантом диаметром 200 мм, высотой 280 мм, ТУ 25-11-1022-75.

К методу ГЖХ

Газовый хроматограф серии "Цвет" или аналогичный с ТИД или ПФД фосфорным.

Колбонагреватели для круглодонных колб или электроплитка с закрытой спиралью.

Холодильники Либиха 200 - 400 мм, ГОСТ 25336-82.

Колбы грушевидные емкостью 50, 100 мл, ГОСТ 25336-82.

Шприц емкостью 10 мл многократного применения, ТУ 64-1-3776-83, или шприц разового применения.

Микрошприцы на 10 мкл, тип МШ-1И, ТУ 5Е2-833-024.

Колонка стеклянная, длина 1 м, диаметр 3,5 мм.

Секундомер.

2.4. Отбор проб

Отбор проб осуществляется в соответствии с "Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, продуктов питания и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов", утвержденными зам. Главного государственного санитарного врача СССР за N 2051-79 от 21.08.1979.

2.5. Проведение определения

2.5.1. Экстракция

К 100 г воздушно-сухой почвы приливают 100 мл хлороформа и 200 мл воды. Встряхивают образец в течение 30 мин. на аппарате для встряхивания, дают отстояться 15 мин. и фильтруют часть экстракта через бумажный фильтр "красная лента" на воронке Бюхнера под вакуумом, собирая в фильтрате несколько более 100 мл водного слоя. Переносят фильтрат в делительную воронку, отбрасывают хлороформный слой и отбирают точно 100 мл водной фазы. Измеренный водный экстракт переносят в делительную воронку и промывают этилацетатом 2 x 30 мл, этилацетат (верхний слой) отбрасывают. Водный экстракт переносят в колбу для отгонки растворителей емкостью 250 мл. Присоединяют колбу к ротационному испарителю, помещают ее в баню с мелко раздробленным льдом и солью (10:3) <*>. Вращают колбу на ротационном испарителе (без включения вакуума), чтобы вода в колбе начала кристаллизоваться. Кристаллизацию проводят до тех пор, пока в колбе не останется ~ 20 мл воды. Оставшуюся воду переносят в отгонную колбу емкостью 50 - 100 мл и продолжают кристаллизацию до тех пор, пока в колбе не останется 2 - 3 мл, быстро переносят воду в мерную пробирку. Далее проводят очистку образца на колонке.

--------------------------------

<*> Примечание. Приготовленную смесь лед с солью можно повторно заморозить в холодильнике, чтобы использовать в дальнейшем.

Одновременно с анализируемым образцом подготавливают экстракт аналогичного контрольного образца.

Очистку экстрактов проводят на колонке с полисорбом.

Подготовка колонки. Колонку присоединяют к колбе Бунзена, соединенной с водоструйным насосом. В колонку помещают тампон из обезжиренной ваты, насыпают 15 см полисорба, наливают 10 мл ацетона и включают водоструйный насос. Затем на слой полисорба помещают ватный тампон и промывают слой еще 40 мл ацетона при легком просасывании водоструйным насосом, чтобы полностью удалить ацетон. Затем насос отключают.

К подготовленному, как описано выше экстракту (2 - 3 мл), прибавляют 50 мл ацетона и хорошо перемешивают. Пропускают полученный ацетоновый раствор через колонку под вакуумом водоструйного насоса, промывают колонку 20 мл ацетона (под вакуумом), затем 20 мл смеси ацетон - вода 9:1 (под вакуумом) и весь элюат отбрасывают. Колбу отключают от вакуума, пропускают через колонку 15 мл воды при прокапывании без отсоса. Когда над слоем останется ~ 0,5 мл воды, подключают колбу с колонкой к водоструйному насосу. Сливают элюат из колбы в мерную пробирку и измеряют точно объем V (должно быть ~ 10 мл). Отбирают 1 мл экстракта для анализа методом ТСХ, а остаток (~ 9 мл) используют для анализа методом ГЖХ.

2.5.2. Тонкослойная хроматография

К взятой для анализа аликвоте (1 мл) экстракта прибавляют 1 мл этанола и 1 мл (1,2 г) прокаленной сернокислой меди, перемешивают, дают отстояться и аликвоту 0,1 - 0,2 мл наносят на пластинку.

Хроматографическую пластинку ("Силуфол", "Армсорб") размером

10 x 12 см делят на 4 полосы шириной по 2,5 см. С нижнего края

пластинки по центру каждой полосы наносят микропипеткой (шприцом)

или пипеточным дозатором по 0,2 мл контрольного элюата, элюата

исследуемого образца, 0,2 мл рабочего стандартного раствора 3, что

соответствует 0,2 мкг, и 0,1 мл рабочего стандартного раствора 2,

что соответствует 1 мкг. Пластинку при нанесении проб и стандартов

для более быстрого испарения воды можно подогревать на

электрогрелке. Когда вода испарится, пластинку помещают в

хроматографическую камеру, в которую налита смесь метанол - аммиак

(7:3). Дают растворителю подняться на 10 см от старта и вынимают

пластинку из камеры. Помещают ее под УФ-свет на 25 минут,

располагая на расстоянии 20 см от источника света. После облучения

опрыскивают пластинку проявляющим реагентом и помещают на 1 мин. в

сушильный шкаф при температуре 40 °C. Затем вынимают из шкафа и

оставляют при комнатной температуре (исключить прямое попадание

солнечного света). Через 5 - 7 минут проявляются сиренево-красного

цвета пятна глуфосинат аммония с R 0,7 +/- 0,05. Сразу после

проявления стандартов проводится оценка содержания глуфосинат

аммония в исследуемом образце <*>.

----------------------------

<*> Примечание: при увеличении температуры и времени прогрева,

а также при более длительном хранении (уже после проявления

стандартов) в некоторых образцах проявляются коэкстрактивные

вещества в R 0,68 +/- 0,05 и 0,72 +/- 0,05 и R 0,5 +/- 0,05.

f f

Учитывая это, необходимо проводить ТСХ-анализ аналогичного

контрольного образца. При отсутствии последнего в случае

обнаружения баста методом ТСХ (особенно при превышении ПДК)

необходимо провести дополнительное определение в оставшейся

аликвоте пробы (см. п. 2.5.1) методом ГЖХ, как описано ниже (п.

2.5.3).

При определении методом ТСХ количественное определение проводится путем визуального сравнения интенсивности окраски и размера пятна пробы и пятен стандартных растворов. Наиболее точно (ошибка +/- 12%) количественная оценка достигается при концентрациях 0,2 - 1 мкг. При большем содержании пестицида в исследуемом образце необходимо разбавить элюат (исходный объем V = 10 мл) и повторить ТСХ-определение, как описано выше. Расчет результатов содержания баста в образце проводят по следующей формуле:

A x V x B x K

X = -------------,

V x P

где:

X - содержание баста в образце, мг/кг;

A - содержание баста, найденное в образце на пластинке, мкг;

V - общий объем водного элюата, мл;

B - кратность разведения V;

V - объем этанольного экстракта, нанесенного на пластинку,

мл;

P - масса анализируемой пробы, г (с учетом взятой аликвоты 1/2

навески);

K - коэффициент, учитывающий потери при концентрировании

вымораживанием до объема 2 - 3 мл, равен 1,2.

2.5.3. Газожидкостная хроматография

Полученный экстракт V (10 мл) или остаток этого экстракта после отбора аликвоты для ТСХ переносят в круглодонную колбу емкостью 50 мл и упаривают под вакуумом на роторном испарителе, при температуре бани не более 50 °C, досуха. Прибавляют для удаления остаточной воды 3 - 5 мл этилацетата и испаряют еще раз досуха.

Получение хроматографируемых производных

К сухому остатку прибавляют 2 мл ледяной уксусной кислоты и встряхивают 15 мин. Затем прибавляют 8 мл триметилортоацетата, интенсивно встряхивают и нагревают с обратным холодильником в течение 4-х часов на колбонагревателе (электроплитке или песчаной бане), периодически встряхивая колбу вместе с холодильником. По окончании прибор снимают с нагревателя, добавляют в колбу трижды по 15 мл толуола и испаряют его каждый раз под вакуумом при температуре бани не более 50 °C до 0,5 - 1 мл (до удаления запаха уксусной кислоты). Доводят объем толуола до 3 мл и затягивают его в шприц. После этого добавляют в колбу 15 мл этилацетата, упаривают под вакуумом до 3 - 5 мл, затягивают его в тот же шприц и тщательно перемешивают растворитель. Далее проводится очистка на мини-колонке с силикагелем.

Очистка на мини-колонке

В пастеровскую пипетку, закрытую с одного конца стеклянной ватой, отвешивают 0,6 г силикагеля (4% влажности). Колонку кондиционируют пропусканием 5 мл смеси этилацетата и толуола (1:1; об./об.). Через фильтр типа Millex SR, который насаживают на шприц, раствор переносят в мини-колонку с силикагелем (можно предварительно профильтровать раствор через фильтр "красная лента", а затем переносить на мини-колонку) и дают стечь раствору. Колбу, в которой проводили реакцию, промывают 10 мл этилацетата. Этот раствор также переносят через тот же фильтр и дают ему стечь из колонки. Затем колонку подключают к слабому вакууму, отсасывают растворитель до осушения колонки. После этого полученные метоксипроизводные элюируют смесью этилацетат - метанол (1:1; об./об.) и собирают первые 5 мл элюата. Упаривают элюат до 1 - 1,5 мл, переносят в мерную пробирку, доводят точно до 2 мл метанолом и анализируют методом ГЖХ. Одновременно с пробами метоксилируют стандартные рабочие растворы для ГЖХ (1', 2' и 3').

Измерение методом ГЖХ проводится на хроматографе с ТИД или ПФД фосфорным:

- колонка стеклянная, длина 1 м, диаметр 3,5 мм;

- фаза 3% OV-17 на хроматоне N-AW-DMCS.

Условия анализа ТИД ПФД фосфорный

газ-носитель азот 23 мл/мин. 30 мл/мин.

водород 14 - 17 мл/мин. 70 мл/мин.

воздух 400 мл/мин. 100 мл/мин.

температура испарителя 225 °C 225 °C

детектора - 225 °C

колонки 220 °C (190 °C) <*> 220 °C (170 °C) <*>

вводимый объем 2 - 3 мкл 2 - 3 мкл

время удерживания 3,25 мин. (1,5 мин.) <*> 1,5 мин. (1,5) <*>

--------------------------------

<*> В скобках приведены отличающиеся условия для метаболита баста, остальные условия анализа одинаковые.

Содержание глуфосинат аммония (или метаболита) (X, мг/кг) в почве рассчитывают по формуле:

C x V x H x V x K

ст ст пр

X = -----------------------,

H x V x V x P

ст 1 2

где:

C - концентрация стандартного раствора, полученного

ст

метоксипроизводного баста (или метаболита), введенного в

хроматограф, мкг;

V - объем стандартного раствора метоксипроизводного баста

ст

(или метаболита), введенного в хроматограф, мкл.

H - высота пика хроматографируемого объема пробы, мм;

пр

V - общий объем экстракта, мл;

H - высота пика хроматографируемого объема стандарта, мм;

ст

V - объем экстракта, взятый из общего объема для получения

метоксипроизводных, мл;

V - хроматографируемый объем пробы, мкл;

P - масса анализируемой пробы, г (с учетом взятой аликвоты

общего экстракта соответствует 1/2 навески);

K - коэффициент, учитывающий потери при концентрировании

водного экстракта вымораживанием, равен 1,2.

3. Требования безопасности

Выполняются в соответствии с "Правилами устройства техники безопасности, производственной санитарии, противоэпидемического режима и личной гигиены при работе в лабораториях (отделениях, отделах) санэпидучреждений системы МЗ СССР" N 2455-81 от 20.01.81.