"Методические указания по определению метаболитов фосфамида в биологических средах методом тонкослойной хроматографии" // Технорма.RU

Утверждены

Министерством здравоохранения СССР

29 июля 1991 г. N 6133-91

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

ПО ОПРЕДЕЛЕНИЮ МЕТАБОЛИТОВ ФОСФАМИДА В БИОЛОГИЧЕСКИХ

СРЕДАХ МЕТОДОМ ТОНКОСЛОЙНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ

(Дополнение к Методическим указаниям N 4323-87 от 08.06.87)

Настоящие Методические указания предназначены для санитарно-эпидемиологических станций и научно-исследовательских учреждений Минздрава РФ, а также ветеринарных, агрохимических, контрольно-токсикологических лабораторий Минсельхоза РФ и лабораторий других ведомств, занимающихся определением остаточных количеств пестицидов, регуляторов роста растений и биопрепаратов в продуктах питания, кормах и внешней среде.

Методические указания апробированы и рекомендованы в качестве официальных Группой экспертов при Госхимкомиссии по химическим средствам борьбы с вредителями, болезнями растений и сорняками.

1. Краткая характеристика

Фосфамид (рогор, БИ-58) в организме теплокровных животных и человека образует продукты превращения:

0,0-диметил-S-карбонилметилдитиофосфат (диметоат-карбоновая кислота, температура плавления 42 °C);

0,0-диметил-S-карбметоксиметилдитиофосфат, температура кипения

98 - 99 °C при 6,7 Па, n = 1,5200;

альфа

0,0-диметилдитиофосфорная кислота, температура кипения 52 - 55

°C при 10,66 Па, n = 1,5340;

альфа

0,0-диметилтиофосфорная кислота, n = 1,4800;

альфа

0,0-диметилфосфорная кислота, температура кипения 79 - 80 °C

при 0,13 Па, n = 1,4082.

альфа

Указанные метаболиты могут образовываться при метаболизме других пестицидов, сходных по химическому строению с фосфамидом.

Метаболиты хорошо растворимы в органических растворителях, в том числе в ацетоне, этаноле, хлороформе, этилацетате и др.

2. Методика определения метаболитов фосфамида

в биологических средах (ткани внутренних органов,

кровь, моча)

2.1. Основные положения

2.1.1. Принцип метода

Метод основан на экстракции метаболитов фосфамида из биологических сред органическим растворителем (хлороформ или этилацетат), очистке полученных экстрактов и последующем определении методом тонкослойной хроматографии. Хроматографирование исследуемых соединений проводят в подвижных фазах на основе ацетона, включающих малополярные и полярные растворители. Проявление на хроматограммах с помощью проявляющих реагентов: 2,6-дибром-N-хлорхинонимина, а также 4-(п-нитробензил)пиридина с последующей обработкой тетраэтиленпентамином.

2.1.2. Метрологическая характеристика метода приведена в таблице 1.

Таблица 1

МЕТРОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА МЕТОДА ОПРЕДЕЛЕНИЯ

МЕТАБОЛИТОВ ФОСФАМИДА В БИОЛОГИЧЕСКИХ СРЕДАХ

┌──────────────────────────────┬─────────────┬───────┬──────────────┬──────────┐

│ Метаболиты фосфамида │ Минимально │Нижний │Аналитическая │Примечание│

│ │детектируемое│предел │открываемость │ │

│ │ количество │обнару-│ │ │

│ │ │жения, │ │ │

│ │ │мкг/мл │ │ │

├──────────────────────────────┼─────────────┼───────┼──────────────┼──────────┤

│Метаболит N 1 │1 мкг │0,5 │80,5 +/- 8,5% │ткани │

│(0,0-диметил-S- │ │ │ │внутренних│

│карбонилметилдитиофосфат) │ │ │ │органов │

│ │ │0,04 │82,0 +/- 10,8%│моча │

│ │ │1,0 │80,5 +/- 10,0%│кровь │

│Метаболит N 2 │5 мкг │5,0 │78,5 +/- 12,5%│кровь │

│(0,0-диметилфосфорная кислота)│ │0,2 │80,5 +/- 11,8%│моча │

│ │ │2,5 │78,9 +/- 10,3%│ткани │

│Метаболит N 3 │2 мкг │1,0 │81,5 +/- 12,5%│ткани │

│(0,0-диметилтиофосфорная │ │2,0 │79,5 +/- 10,5%│кровь │

│кислота) │ │0,08 │82,8 +/- 8,5% │моча │

│Метаболит N 4 │1 мкг │0,5 │82,4 +/- 12,5%│ткани │

│(0,0-диметилдитиофосфорная │ │1,0 │80,5 +/- 10,5%│кровь │

│кислота) │ │0,04 │85,5 +/- 10,0%│моча │

│Метаболит N 5 │1 мкг │0,5 │82,9 +/- 8,5% │ткани │

│(0,0-диметил- │ │1,0 │79,6 +/- 9,5% │кровь │

│карбметоксиметилдитиофосфат) │ │0,04 │85,4 +/- 10,6%│моча │

└──────────────────────────────┴─────────────┴───────┴──────────────┴──────────┘

Примечание: в модельные опыты вносили по 10, 20, 50, 100 мкг исследуемых веществ. Количество опытов 60 (P = 0,05).

2.1.3. Избирательность метода

В условиях двумерной хроматографии после I хроматографирования из указанной выше смеси метаболитов + фосфамид раздельно определяются фосфамид, "диметоат-карбоновая кислота" и 0,0-диметилкарбметилдитиофосфат, а после II хроматографирования раздельно определяются 0,0-диметилфосфорная кислота и (или) 0,0-диметилтиофосфорная кислота (или 0,0-диметилдитиофосфорная кислота).

Последние две кислоты, если не присутствуют одновременно в пробе, отличаются окраской зоны локализации при взаимодействии с 2,6-дибром-N-хлорхинонимином.

Определению не мешают пестициды, которые могут присутствовать в пробе (с учетом технологии возделывания с/х культур), - диазинон, циклоат, эптам, метоксихлор, линдан.

2.2. Реактивы и растворы

0,0-Диметил-S-карбонилметилдитиофосфат ("диметоат-карбоновая кислота", метаболит N 1).

0,0-Фосфорная кислота хч (метаболит N 2).

0,0-Диметилтиофосфорная кислота хч (метаболит N 3).

0,0-Диметилдитиофосфорная кислота хч (метаболит N 4).

0,0-Диметилкарбометоксиметилдитиофосфат (метаболит N 5).

Фосфамид хч или товарная форма пестицида (40-процентный или 38-процентный концентрат эмульсии).

Ацетон хч, ГОСТ 2603-79.

Бензол хч, ГОСТ 5955-75.

н-Гексан ч, ТУ 6-09-3375-78.

Хлороформ хч, ТУ 6-09-4263-76.

Уксусная кислота хч, ГОСТ 61-75.

Дистиллированная вода.

Натрий сернокислый безводный чда, ГОСТ 4166-76.

2,6-Дибром-N-хлорхинонимин, ТУ 6-09-05-63-73, хч, 0,5-процентный раствор в гексане.

4-(п-Нитробензил)пиридин, ТУ 6-09-15-93-74.

Тетраэтиленпентамин, ТУ 6-09-05-804-78.

Этилацетат хч, ГОСТ 22300-76.

Натрий лимоннокислый чда, ГОСТ 22280-78, 5% раствор.

Подвижные фазы:

I хроматографирование: N 1 - бензол - этилацетат - ацетон (60:15:25), N 2 - гексан - ацетон - хлороформ (1:1:3) и N 3 - бензол - этилацетат - уксусная кислота (50:25:25:2).

II подвижная фаза: ацетон - вода - этилацетат (4:6:2).

Проявляющие реагенты:

N 1 - 2,6-дибром-N-хлорхинонимин, 0,5-процентный раствор в н-гексане;

N 2 - а) 4-(п-нитробензил)пиридин, 2-процентный раствор в ацетоне, б) тетраэтиленпентамин, 10-процентный раствор в ацетона.

Стандартные растворы исследуемых метаболитов и фосфамида в хлороформе или этилацетате с содержанием вещества 100 мкг/мл. Если стандартный раствор фосфамида готовят из препаративной формы пестицида, то учитывают его процентное содержание в препарате. Срок хранения стандартных растворов до 1 месяца в холодильнике.

2.3. Приборы, аппаратура, посуда

Ротационный вакуумный испаритель ИР-1М с набором колб, ТУ 25-11-917-76, или аналогичный аппарат для отгонки растворителей.

Аппарат для встряхивания, ТУ 64-1-1081-73 или аналогичный.

Колбы мерные, цилиндры, ГОСТ 1770-74.

Термостат.

Пипетки, микропипетки, ГОСТ 20292-74.

Стаканы, склянки химические емкостью 50 - 100 мл, ГОСТ 25336-82.

Воронки химические, ГОСТ 25336-82.

Воронки делительные, ГОСТ 25336-82.

Колбы грушевидные, ГОСТ 25336-82 (для отгонки растворителей).

Камера для хроматографирования, ГОСТ 25336-82.

Камера для опрыскивания пластинок, ГОСТ 25336-82.

Пульверизатор стеклянный, ГОСТ 25336-82.

Баня водяная, ТУ 64-12350-76.

Стеклянные капилляры для нанесения проб на хроматографические пластинки.

Хроматографические пластинки "Силуфол" размером 15 x 15 или 20 x 20 см.

Линейка, планиметр, миллиметровая бумага.

Измельчитель тканей, МРТУ 42-1505-63 или аналогичный.

2.4. Проведение определения

2.4.1. Экстракция и очистка экстрактов

Ткани внутренних органов (печень, почки, легкие, селезенка, сердце)

Измельченную пробу тканей внутренних органов массой 2 г помещают в склянку с притертой пробкой и приливают 10 мл охлажденного ацетона или этилацетата и встряхивают на холоде в течение 30 - 40 минут. Затем растворитель отделяют от пробы, фильтруя его через безводный сернокислый натрий (2 - 3 г) в колбу для отгонки растворителей.

Экстракцию повторяют еще дважды, используя свежие порции растворителя. Объединенный экстракт отгоняют при температуре 40 - 50 °C до объема раствора примерно 0,5 мл. Остаток раствора подсушивают безводным сернокислым натрием.

Кровь. Пробу крови 0,5 - 1 мл вносили в пробирку, смоченную раствором лимоннокислого натрия, и приливали 10 мл хлороформа. Экстрагировали на холоде в течение 30 мин. Хлороформ отделяли от пробы, фильтровали через безводный сернокислый натрий (1 - 2). Экстракцию повторяли еще дважды, используя по 5 мл хлороформа, в течение 10 и 5 минут. Объединенные экстракты вносили в колбу для отгонки растворителей.

Пробу крови можно поместить в ступку, куда насыпается 10 г безводного сернокислого натрия и растирается в течение 5 минут. Приливается 15 мл этилацетата и перемешивается содержимое ступки 20 минут. Этилацетат отделяется от массы и фильтруется через фильтр в колбу для отгонки растворителей. Сюда же фильтруются вторая и третья порции экстрагента (по 10 мл, экстракция по 5 минут). Растворитель отгоняется на ротационном испарителе при температуре 45 - 50 °C до остатка примерно 0,5 мл. Если остаток получился мутным, то его подсушивают безводным сернокислым натрием. Затем количественно переносят на хроматографическую пластинку.

Моча. 25 мл исследуемой мочи помещают в колбу с притертой пробкой, приливают 2 - 5 мл хлористого натрия и 10 мл хлороформа или этилацетата. Осторожно встряхивают в течение 30 минут (1 экстракция), 10 минут (2 и 3 экстракции). Органический растворитель отделяют от пробы, объединяют и пропускают через слой безводного сернокислого натрия (до 10 г). Переносят растворитель в колбу для отгона растворителей и отгоняют его до объема 0,5 мл при температуре 70 °C (50 °C). Если необходимо, остаток подсушивают безводным сернокислым натрием. Количественно переносят на хроматографическую пластинку.

2.4.2. Хроматографирование

Пробу 0,5 мл количественно переносят на хроматографическую

пластинку, нанося ее на высоте 5 см от нижнего края пластинки.

Слева и справа от пробы наносят смеси стандартных растворов

фосфамида и его метаболитов N 1 - 5, содержащие по 1, 2, 5 и 10

мкг каждого вещества. Помещают пластинку в камеру для

хроматографирования, куда за 30 - 50 минут наливают одну из трех

подвижных фаз для I хроматографирования. После окончания

хроматографирования (высота подъема растворителей подвижной фазы 9

- 10 см) и после улетучивания следов растворителей на расстоянии

1,5 см от линии старта (по высоте) проводят горизонтальную линию,

параллельную линии старта, и отрезают верхнюю часть пластинки.

Обрабатывают ее одним из проявляющих реагентов, N 1 или 2. Если

применяют ПР N 1, то после опрыскивания пластинку помещают в

термостат при температуре 110 - 120 °C на 2 - 3 минуты. Фосфамид и

метаболиты N 1 и N 5 проявляются в виде красно-кирпичного цвета

пятен, метаболиты N 2, 3, 4 остались на нижней части пластинки.

Если используют ПР N 2, то сначала обрабатывают пластинку

раствором 4-(п-нитробензил)пиридина, помещают на 10 минут в

термостат при 110 °C, а затем опрыскивают раствором

тетраэтиленпентамина. Исследуемые вещества проявляются в виде

синих пятен. Фосфамид и метаболиты N 1 и N 5 в подвижной фазе N 1

имеют R , равное 0,44, 0,51, 0,96 соответственно, в подвижной фазе

N 2 - 0,39, 0,28, 0,92, в подвижной фазе N 3 - 0,54, 0,66, и 0,92

соответственно.

Нижнюю часть пластинки поворачивают на 90 °C и наносят справа

от пробы 2 или три стандартных раствора метаболитов N 2, N 3, N 4.

Проводят II хроматографирование в подвижной фазе ацетон - вода -

этилацетат (4:6:2). После поднятия фронта растворителя на 10 см и

улетучивания следов подвижной фазы обрабатывают одним из двух

проявляющих реагентов, как описано выше. Величина R метаболитов

N 2, N 3, N 4 равна 0:0,50 и 0,50. Если метаболиты N 3 и N 4

находятся одновременно в пробе, то они будут определяться

суммарно, если же они не присутствуют одновременно, то их можно

идентифицировать по окраске пятна: метаболит N 3 имеет желтого

цвета пятна, а N 4 - кирпично-коричневого.

2.5. Обработка результатов анализа

Содержание метаболитов и фосфамида на хроматограммах проб определяют путем сравнения интенсивности окрашивания пятен и их площади на хроматограммах проб и стандартных растворов. Площадь пятен измеряют с помощью планиметра или промасленной миллиметровой бумаги. Содержание вещества на хроматограмме может быть определено с помощью денситометра.

Для расчета содержания исследуемых веществ в биопробе используют формулу, в которую вносят площадь пятна на хроматограмме стандарта, наиболее близкую по размерам к площади пятна на хроматограмме пробы.

Расчет концентрации исследуемого вещества в биопробе проводят по формуле:

C x S x V

ст пр 2

X = --------------,

S x V x P

ст 1

где:

X - концентрация исследуемого вещества в пробе, мкг/мл, мкг/г;

C - концентрация вещества на хроматограмме стандарта, мкг;

ст

S - площадь пятна на хроматограмме стандарта, кв. мм;

ст

S - площадь пятна на хроматограмме пробы, кв. мм;

пр

V - хроматографический объем пробы, мл;

V - общий объем пробы, мл;

P - навеска пробы, г (или объем, мл).

3. Требования безопасности

Необходимо соблюдать все требования безопасности при работе в химической лаборатории с ядовитыми веществами и электронагревательными приборами.