Утверждены

Министерством здравоохранения СССР

29 июля 1991 г. N 6129-91

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

ПО ГРУППОВОЙ ИДЕНТИФИКАЦИИ ХЛОРОРГАНИЧЕСКИХ ПЕСТИЦИДОВ

И ИХ МЕТАБОЛИТОВ В БИОМАТЕРИАЛЕ, ПРОДУКТАХ ПИТАНИЯ

И ОБЪЕКТАХ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ МЕТОДОМ АДСОРБЦИОННОЙ

ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ

Настоящие Методические указания предназначены для санитарно-эпидемиологических станций и научно-исследовательских учреждений Минздрава РФ, а также ветеринарных, агрохимических, контрольно-токсикологических лабораторий Минсельхоза РФ и лабораторий других ведомств, занимающихся определением остаточных количеств пестицидов, регуляторов роста растений и биопрепаратов в продуктах питания, кормах и внешней среде.

Методические указания апробированы и рекомендованы в качестве официальных Группой экспертов при Госхимкомиссии по химическим средствам борьбы с вредителями, болезнями растений и сорняками.

1. Краткая характеристика препаратов

Краткие характеристики действующих веществ хлорорганических пестицидов (4,4'-ДДТ и его производные, альдрин, ГПХ, ГПХЭ, даконил, дилор, кельтан, ПХП) и их метаболитов (полихлорфенолы и полихлорбензолы) приведены в книгах: "Методы определения микроколичеств пестицидов в продуктах питания, кормах и внешней среде", М., Колос, 1977, 368 с.; Клисенко М.А., Александрова Л.Г. "Определение остаточных количеств пестицидов", Киев, Здоровье, 1983, 248 с.; "Методические указания по определению микроколичеств пестицидов в продуктах питания, кормах и внешней среде", ч. 1, М., 1987, 276 с.

2. Методика групповой идентификации ХОП и их метаболитов

2.1. Основные положения

2.1.1. Принцип метода

Метод основан на извлечении ХОП и их метаболитов из различных субстратов, очистке и концентрировании экстрактов, последующей идентификации отдельных групп ХОП с помощью адсорбционной ВЭЖХ при спектрофотометрическом детектировании.

2.1.2. Метрологическая характеристика метода

Параметры анализа хлорорганических пестицидов и их метаболитов методом адсорбционной ВЭЖХ представлены в таблице.

Таблица

ПАРАМЕТРЫ ВЭЖХ-АНАЛИЗА ХЛОРОРГАНИЧЕСКИХ СОЕДИНЕНИЙ

И ИХ МЕТАБОЛИТОВ <*>

--------------------------------

<*> Предел обнаружения для ДДТ и его производных, а также полихлорфенолов и полихлорбензолов 0,05 - 0,5, для других ХОП - 0,1 - 2,0 мкг в пробе.

┌──────────────────────┬──────────┬──────────────────┬────────────────────┐

│   Идентифицируемое   │V уд., мкл│Хроматографические│  лямбда макс., нм  │

│      соединение      │          │     зоны, мкл    │                    │

├──────────────────────┼──────────┼──────────────────┼────────────────────┤

│            1         │    2     │         3        │         4          │

├──────────────────────┼──────────┼──────────────────┼────────────────────┤

│ХБ                    │160       │160 - 180         │220                 │

│1,4-ДХБ               │175       │                  │220, 280            │

│1,2,3-ТХБ             │180       │                  │240, 270, 290       │

│1,2,4-ТХБ             │170       │                  │230, 270, 290       │

│1,3,5-ТХБ             │170       │                  │230, 280            │

│1,2,4,5-ТеХБ          │180       │                  │220, 250, 290       │

│1,2,3,4,5,6-ПХБ       │165       │                  │230, 250, 290       │

│2,4'-ДДТ              │236       │190 - 260         │240                 │

│4,4'-ДДТ              │240       │                  │240                 │

│2,4'-ДДЭ              │245       │                  │260                 │

│4,4'-ДДЭ              │190       │                  │250                 │

│2,4'-ДДД              │260       │                  │230                 │

│4,4'-ДДД              │255       │                  │230                 │

│2-ХФ                  │375       │230 - 530         │220, 280            │

│3-ХФ                  │230       │                  │220, 290            │

│4-ХФ                  │475       │                  │260                 │

│2,3-ДХФ               │350       │                  │220, 280            │

│2,4-ДХФ               │370       │                  │230, 290            │

│2,6-ДХФ               │305       │                  │220, 280            │

│3,4-ДХФ               │230       │                  │230, 290            │

│3,5-ДХФ               │275       │                  │230, 280            │

│2,3,4-ТХФ             │350       │                  │230, 290            │

│2,3,5-ТХФ             │275       │                  │220, 290            │

│2,3,6-ТХФ             │280       │                  │220, 290            │

│2,4,5-ТХФ             │290       │                  │220, 300            │

│2,4,6-ТХФ             │280       │                  │220, 300            │

│3,4,5-ТХФ             │290       │                  │230, 290            │

│2,3,4,6-ТеХФ          │370       │                  │230, 300            │

│2,3,5,6-ТеХФ          │250       │                  │230, 290            │

│2,3,4,5,6-ПХФ         │530       │                  │230, 300            │

│Альдрин               │270       │180 - 300         │280                 │

│Гексахлорпараксилол   │270       │                  │280                 │

│Гептахлор             │295       │                  │280                 │

│Гептахлорапоксид      │300       │                  │280                 │

│Даконил               │180       │                  │270                 │

│Дилор                 │275       │                  │290                 │

│Кельтан               │180       │                  │280                 │

│Полихлорпинен         │275       │                  │280                 │

└──────────────────────┴──────────┴──────────────────┴────────────────────┘

2.1.3. Избирательность метода

Метод групповой идентификации ХОП и их метаболитов избирателен в присутствии азот-, фосфорорганических пестицидов и других органических примесей.

2.2. Реактивы и растворы

Ацетон осч, ТУ 6-09-3513-86.

н-Гексан ч, ТУ 6-09-3375-78.

Натрия сульфат безводный ч, ГОСТ 4166-76.

Серная кислота чда, ГОСТ 4204-77.

Фильтры "синяя лента".

Стандартный раствор многокомпонентной смеси ХОП и их метаболитов в н-гексане с концентрацией индивидуальных компонентов по 100 мкг/мл.

2.3. Приборы и посуда

Хроматограф микроколоночный жидкостный типа "Милихром".

Колонка стандартная металлическая (50 x 2 мм) с сорбентом "Силасорб-600", 5 мкм, Chemapol (ЧССР).

Весы аналитические типа ВЛКТ-50, ГОСТ 24104-80.

Испаритель ротационный типа ИР-1М2, ТУ 25-1173-84.

Линейка металлическая, ГОСТ 25706-83.

Воронки конические, ГОСТ 25336-82.

Колбы круглодонные со шлифом на 100 мл, ГОСТ 25336-82.

Колбы плоскодонные с пришлифованной пробкой на 100 мл, ГОСТ 25336-82.

Пипетки мерные на 1 мл, ГОСТ 1770-74.

Пробирки мерные на 10 мл, ГОСТ 1770-74.

Цилиндры мерные на 50 и 100 мл, ГОСТ 1770-74.

2.4. Отбор, хранение и подготовка проб

Отбор, хранение и подготовка проб к анализу проводятся в соответствии с "Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, пищевых продуктов и окружающей среды для определения пестицидов", утвержденными заместителем Главного государственного санитарного врача СССР 21.08.79 за N 2051-79.

2.5. Подготовка к анализу

2.5.1. Приготовление элюента

Элюирующую смесь - н-гексан - ацетон в объемном соотношении 6:1 готовят в день проведения анализа проб: цилиндром вместимостью 100 мл отмеряют 90 мл н-гексана, который выливают в плоскодонную колбу с пришлифованной пробкой, туда же приливают 15 мл ацетона, колбу закрывают пробкой и ее содержимое перемешивают при легком взбалтывании, затем элюирующую смесь фильтруют через складчатый фильтр с прокаленным сульфатом натрия в сосуд для элюента.

2.5.2. Подготовка хроматографической системы к проведению анализа

Подготовку прибора к хроматографическому анализу начинают с промывки насоса и заполнения его свежеприготовленным элюентом, затем приступают к промывке хроматографической системы прибора и заполнению кюветы сравнения используемым элюентом. После установления равномерного нулевого сигнала детектора и снижения шумов до минимума проводят анализ групповой идентификации ХОП и их метаболитов.

2.6. Проведение анализа

2.6.1. Подготовка пробы к проведению анализа методом ВЭЖХ

Пробы биоматериала (органы, ткани теплокровных или человека; биологические жидкости: кровь, моча, желчь, грудное молоко), пищевых продуктов или объектов окружающей среды массой (или объемом), указанной в известных методиках определения ХОП и (или) их метаболитов, экстрагируют органическим растворителем согласно описанию хода проведения анализа. Для удаления из гексанового экстракта пробы сопутствующих органических примесей природного происхождения, а также азот-, фосфорорганических пестицидов и продуктов их превращения, влияющих на анализ смеси хлорорганических соединений, проводится предварительная их переэкстракция в концентрированную серную кислоту, затем гексановый экстракт высушивают сульфатом натрия и упаривают на ротационном испарителе при 60 °C до небольшого объема, который переносят в мерную пробирку и упаривают досуха в токе азота особой чистоты. Сухой остаток пробы растворяют в 0,2 мл элюента (смесь н-гексана с ацетоном (6:1)) и проводят хроматографическое разделение и идентификацию отдельных групп ХОП и их метаболитов.

2.6.2. Хроматографическое разделение и идентификация отдельных групп ХОП и их метаболитов

Разделение и групповая идентификация ХОП и их метаболитов осуществляются при следующих условиях хроматографирования:

неподвижная фаза - "Силасорб-600", 5 мкм, подвижная фаза - гексан - ацетон в объемном соотношении 6:1; скорость элюирующего потока 200 мкл/мин.; детектор - переменно-волновой спектрофотометр с проточной ячейкой 1,6 мкл; под диапазон чувствительности 3,2 А; время измерения выходного сигнала 0,6 с; скорость протяжки диаграммной ленты 720 мм/ч; длина волны (лямбда) поглощения светового потока (нм) определяется идентифицируемой группой соединений.

Близкие объемы удерживания (V уд.) представителей отдельных групп хлорорганических соединений и подбор соответствующей длины волны позволяют разграничить зоны хроматографирования, характерные для разных групп, что обеспечивает их идентификацию в сложной пестицидной смеси пробы при сопоставлении с зонами хроматографирования стандартной смеси соответствующих групп соединений.

2.6.3. Примеры идентификации отдельных групп ХОП в многокомпонентной смеси неизвестного состава пробы

Пример 1. Из 0,2 мл сконцентрированного раствора пробы в элюенте 20 мкл вводят в хроматографическую колонку и проводят анализ при 280 нм в ранее описанном режиме.

При этой длине волны, близкой к лямбда макс. некоторых из исследуемых соединений, можно идентифицировать:

1) группу хлорбензолов (V уд. 160 - 180 мкл);

2) группу хлорфенолов (V уд. 230 - 530 мкл);

3) группу соединений представителей различных классов ХОП - альдрин, ГХПК, ГПХ, ГПХЭ и некоторых других (V уд. 180 - 300 мкл).

Идентификация 4,4'-ДДТ и его производных достигается повторным хроматографированием при лямбда 230 нм. Объемы удерживания соединений этой группы находятся в пределах 235 - 260 мкл, а V уд. 4,4'-ДДЭ - 190 мкл. При данных условиях идентификации группы 4,4'-ДДТ и его производных не мешают присутствующие в пробе ХОП других классов (альдрин и другие), а также детектируемые на этой длине волны представители группы хлорбензолов (3-ХФ, 3,4-ДХФ, 2,3,5,6-ТеХФ) с близкими объемами удерживания (230, 250 мкл). Окончательную идентификацию спорных хроматографических сигналов осуществляют подбором необходимой длины волны и снятием развернутых спектров соединений (таблица).

Пример 2. Аликвотная часть конечного раствора исследуемой пробы в элюенте вводится в хроматограф, и проводится групповое разделение смеси ХОП неизвестного состава при 230 нм. В этих условиях регистрируемые выходные сигналы позволяют идентифицировать следующие группы соединений: хлорбензолы (V уд. 160 - 180 мкл); 4,4'-ДДТ и его производные (V уд. 235 - 260; V уд. 4,4'-ДДЭ 190 мкл). Однако идентификация последних может быть затруднена наличием в пробах хлорфенолов (3-, 3,4- и 2,3,5,6-хлорфенолы имеют близкие с компонентами группы ДДТ объемы удерживания). Поэтому окончательную идентификацию осуществляют после повторного хроматографирования пробы при лямбда 220 нм, близкой к лямбда макс. указанных хлорфенольных соединений. Надежность идентификации может быть повышена снятием развернутого спектра поглощения при остановке процесса хроматографирования на соответствующем выходном сигнале с дискретностью 10 или 2 нм.

Пример 3. Аликвотную часть конечного раствора пробы в элюенте хроматографируют в описанном выше режиме при лямбда 280 нм. В этом случае возможна идентификация трех групп соединений: хлорбензолы, хлорфенолы и ХОП различных классов (альдрин и др.), за исключением ДДТ и его производных. Наложение хроматографической зоны ряда хлорфенольных соединений (объем удерживания от 275 до 305 мкл) и представителей хлорорганических пестицидов других классов не позволяет провести правильную идентификацию этих соединений, поэтому анализ повторяют при лямбда 310 нм. В этих условиях ДДТ и его производные и основная часть хлорфенолов (за исключением 2,4,6-ТХФ, 2,3,4,6-ТеХФ и 2,3,4,5,6-ПХФ) не регистрируются. Объемы удерживания двух последних соединений не совпадают с хроматографической зоной ХОП (370 и 530 мкл), что устраняет их влияние на идентификацию. Помехи 2,4,6-ТХФ можно устранить переключением спектрофотометра на 260 нм при повторном анализе пробы, когда выходной сигнал этого соединения не регистрируется, или записав развернутый спектр 2,4,6-ТХФ, имеющий две лямбда макс. - 220 и 300 нм.

При проведении число операций по хроматографическому разделению и идентификации может быть ограничено в соответствии с задачами проводимых исследований.

2.6.4. Обработка результатов анализа

Качественный состав идентифицируемых групп ХОП и их метаболитов определяется путем сопоставления их хроматографических зон в смеси неизвестного состава пробы и многокомпонентной стандартной смеси идентифицируемых групп соединений. После установления группового состава смеси хлорорганических пестицидов в анализируемой пробе, исходя из наличия отдельных групп, выбирают наиболее эффективный метод (ТСХ, ГЖХ, ВЭЖХ) для дальнейшего количественного измерения индивидуальных компонентов отдельных групп и их метаболитов.

3. Требования безопасности

Необходимо соблюдать общепринятые правила безопасности при работе с органическими растворителями, токсичными веществами, концентрированными кислотами.