Утверждаю

Заместитель главного

государственного врача БССР

В.Г.ЖУКОВСКИЙ

20 мая 1991 г. N 4-18/1890

МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

ПО ОБНАРУЖЕНИЮ, ИДЕНТИФИКАЦИИ И ОПРЕДЕЛЕНИЮ

ОСТАТОЧНЫХ КОЛИЧЕСТВ ЛЕВОМИЦЕТИНА В ПРОДУКТАХ

ЖИВОТНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ

Разработаны Институтом питания АМН СССР, кафедрой общей гигиены Белорусского Государственного института усовершенствования врачей Минздрава СССР.

Предназначены для контроля остаточных количеств левомицетина в пищевых продуктах санитарно-эпидемиологическими станциями, а также заводскими и сельскохозяйственными лабораториями.

Введение

Среди ряда посторонних веществ, которые могут загрязнять различные пищевые продукты, важное место занимают лекарственные средства. Наиболее часто пищевые продукты загрязняются остатками лекарственных препаратов, применяемых для профилактики и лечения животных и птицы, ускорения их роста, улучшения качества и сохранности кормов и т.п. Номенклатура лекарств, используемых в животноводстве и ветеринарии, постоянно расширяется.

К сильнодействующим лекарственным препаратам, используемым в ветеринарии и животноводстве, относятся антибиотики. Известно большое число антибиотиков, природных и полусинтетических, обладающих различными свойствами, механизмом и спектром действия, распределением в организме животного, характером метаболизма и др.

Широкое применение антибиотиков в ветеринарии и животноводстве создает определенные проблемы с точки зрения гигиены питания, требует проведения соответствующих мероприятий для снижения уровня загрязненности продуктов этими веществами, а также организации контроля за остаточными количествами препаратов в продуктах животноводства.

При систематическом поступлении в организм человека с пищей антибиотики могут вызывать различные аллергические реакции, нарушение обмена веществ, дисбактериоз, подавлять активность некоторых ферментов, изменять микрофлору, способствовать распространению устойчивых форм микроорганизмов и т.д. Следует учитывать возможность отрицательного влияния антибиотиков в сырье для пищевой промышленности на проведение ряда технологических процессов по переработке мяса, рыбы, молока и других продуктов, кроме того, наличие антибиотиков может затруднять бактериологические исследования качества продуктов животного происхождения.

В мясе, печени, почках, молоке, твороге, сметане, сыре, яйце, рыбе, меде и других продуктах довольно часто обнаруживают остаточные количества антибиотиков, что предопределяет необходимость проведения выборочного, периодического или систематического их контроля. Некоторые из перечисленных продуктов являются диетическими (молоко, творог, сметана и др.), поэтому отсутствие в них токсических и лекарственных соединений особенно важно.

В СССР остаточные количества ряда антибиотиков регламентированы предельно допустимыми концентрациями (ПДК) <*>. К ним относятся тетрациклины (0,01 ед./г), пенициллины (0,01 ед./г) и стрептомицин (0,5 ед./г).

--------------------------------

<*> Медико-биологические требования и санитарные нормы качества продовольственного сырья и пищевых продуктов. М., Издательство стандартов, 1990 г.

Для контроля уровней этих антибиотиков Минздравом СССР утверждены микробиологические методы определения, которые позволяют обнаруживать и идентифицировать группы указанных веществ на уровне ПДК.

Левомицетин (хлормицетин, хлорамфеникол) - эффективный синтетический антибиотик широкого спектра действия, запрещен к использованию в животноводстве и ветеринарии для лечения скота, птицы, мясо, молоко и яйца которых предназначены для питания людей. Это связано с токсичностью левомицетина, проявляющейся в аллергических реакциях, поражении кроветворных органов и др. Однако относительная дешевизна этого препарата и высокая антибактериальная активность приводят к нелегальному использованию его в относительно высоких масштабах.

Микробиологические методы неэффективны для анализа этого антибиотика в пищевых продуктах, т.к. найденные тест-культуры малочувствительны и не позволяют осуществлять контроль за остаточными количествами левомицетина хотя бы на уровне ПДК других антибиотиков, разрешенных к применению.

В связи с этим за рубежом наиболее часто применяют химические методы определения левомицетина в пищевых продуктах с использованием хроматографического разделения.

В настоящих Методических рекомендациях впервые в СССР предпринята попытка применения для контроля остаточных количеств левомицетина в пищевых продуктах простого химического метода анализа, основанного на извлечении антибиотика экстракцией органическим растворителем, концентрировании экстракта, отделении левомицетина в тонком слое силикагеля от коэкстрактивных веществ и определении его после восстановления в виде производного с n-деметиламинобензальдегидом.

Доступность реактивов и оборудования позволяет рекомендовать этот метод для серийных анализов пищевых продуктов в условиях санэпидстанций, заводских и сельскохозяйственных лабораторий.

Предел обнаружения левомицетина на хроматографической пластинке 5 - 10 нг в зоне. Относительное стандартное отклонение при визуальном определении не превышает 0,4, при спектрофотометрическом - 0,2. Метод позволяет проводить анализ левомицетина при содержании его 0,05 мг/кг продукта и выше.

Метод состоит из следующих основных стадий:

1. Отбор и подготовка пробы.

2. Извлечение левомицетина из пищевых продуктов и концентрированного экстракта.

3. Хроматографическое разделение, идентификация и ориентировочная оценка концентрации левомицетина в экстракте.

4. Подтверждение наличия левомицетина в пробе.

5. Количественное определение и расчет содержания левомицетина в продукте.

Аппаратура, материалы и реактивы

Гомогенизатор тканей по <...>

Спектрофотометр СФ-26 или аналог

Термостат ТС-80М-2 или аналог

Азот, поверочный нулевой газ

Центрифуга настольная по <...> 375-4261 или аналог

Ротационный испаритель с крышкой по ТУ 25-11-917

Баня масляная или глицериновая

Камера для тонкослойной хроматографии с притертой крышкой, например стеклянный четырехгранный сосуд 195 x 195 x 200 мм завода "Дружная горка".

Пластины для тонкослойной хроматографии "Силуфол" размером 15 x 15 см, ЧСФР или Сорбфил 100 x 100 (г. Краснодар) ТУ 26-11-17-89

Ножницы

Весы технические по ГОСТ 24104

Весы аналитические по ГОСТ 24104

Линейка

Карандаш графитовый М или аналог

Цилиндры мерные вместимостью 25 и 100 мл по ГОСТ 1770

Колбы плоскодонные на 250 и 500 мл с НШ N 14,5 по ТУ 48-52

Колбы мерные на 25 мл по ГОСТ 1770

Пипетки на 5 и 10 мл по ГОСТ 20292

Колбы для упаривания на <...> мл с НШ N 14,5 по ГОСТ 10394

Микрошприц на 10 и 25 мкл

Натрий сернокислый, безводный по ГОСТ 4166

Серная кислота по ГОСТ 14262 <...> 1 н

Этилацетат по ГОСТ <...>

Натрий хлористый по ГОСТ <...> насыщенный раствор в воде

Натрий углекислый по ГОСТ <...> 2% водный раствор

Ацетонитрил по ТУ 6-09-3534-87

Петролейный эфир, фракции <...>

Метанол

бета-глукуронидаза, водный раствор 1 мг/мл

Вода дистиллированная по ГОСТ 6709

Кислота соляная, конц. по ГОСТ 3118

    Хлорид  олова  (II), восстанавливающий реактив: 3 мл 15% раствора SnCl

                                                                          2

(в воде) + 15 мл HCl      + 180 мл H O

                    конц.           2

Левомицетин

Однозамещенный фосфат калия

Двузамещенный фосфат натрия

1. Отбор и подготовка проб

Способ отбора и подготовки проб должен быть указан в нормативно-технической документации на конкретную продукцию.

2. Извлечение левомицетина из пищевых продуктов

и концентрирование экстракта

    Мясо  <*>.  10  +/-  0,1  г  гомогенизируют  с 15 мл 0,025 М фосфатного

буфера,  pH  6,88  (0,34  г  KH PO   и  0,36  г Na HPO  растворяют в 100 мл

                               2  4               2   4

дистиллированной    воды),    добавляли    200    мкл    водного   раствора

бета-глукуронидазы   и   инкубировали   1,5   часа  при  37  °С.  Гомогенат

экстрагировали  3  x  30  мл  этилацетата,  при  необходимости применяя для

расслоения  суспензии  центрифугирование  5  -  10  мин.  при 4000 об./мин.

Этилацетатный слой объединяли.

    --------------------------------

    <*>  Аналогично  извлекали  левомицетин  из мясных продуктов, органов и

тканей животных.

    Молоко  <**>.  25  +/-  0,1  мл  насыщают  10 г Na SO , приливают 10 мл

                                                      2  4

этилацетата  и  5  мл  1  н   H SO ,  интенсивно встряхивают 1 - 2 мин. Для

                               2  4

расслоения  эмульсии  применяют  центрифугирование  5  -  10  мин. при 4000

об./мин. Этилацетат декантируют, а супернатант экстрагируют последовательно

30  и  20  мл этилацетата, при необходимости применяя центрифугирование для

расслоения.

    --------------------------------

    <**> Аналогично извлекали левомицетин из кефира, ряженки, йогуртов.

    Яйцо  <***>.  10  +/-  0,1  г  гомогената яйца перетирают с 5 г Na SO ,

                                                                      2  4

приливают 40 мл этилацетата и 5 мл 1 н H SO , перемешивают и центрифугируют

                                        2  4

5  -  10  мин.  при  4000 об./мин. Этилацетатный слой декантируют, а водную

часть   экстрагируют   последовательно   30   и   20  мл  этилацетата,  при

необходимости   применяя  центрифугирование  для  расслоения.  Объединенные

этилацетатные  экстракты  из  продуктов  промывают последовательно 10 мл 2%

раствора Na CO , насыщенного NaCl, и 10 мл насыщенного раствора NaCl.

           2  3

    ----------------------------

    <***>  Яичный  порошок  предварительно  разводят  водой до консистенции

жидкой сметаны.

    Органический  слой  отбирают  и упаривают на ротационном испарителе при

температуре   <=   50   °С  до  минимального  объема,  отдувают  азотом  до

исчезновения  запаха  этилацетата,  добавляют 3 мл смеси ацетонитрил - вода

1:4   и  экстрагируют  3  x  5  мл  петролейного  эфира.  Петролейный  эфир

отбрасывают  и извлекают левомицетин этилацетатом (3 x 5 мл). Этилацетатный

экстракт  сушат  над  Na SO  (1 г), декантируют, промывают 3 мл этилацетата

                        2  4

сульфат  натрия,  объединяют  его с экстрактом и  упаривают  на ротационном

испарителе  при  температуре  <= 50 °С досуха. Остаток растворяют в 200 мкл

метанола.

3. Хроматографическое разделение,

идентификация и ориентировочная оценка концентрации

левомицетина в экстракте

3.1. Приготовление стандартных растворов

Отвешивают 25 мг левомицетина, помещают в мерную колбу на 25 мл и растворяют в метаноле, концентрация левомицетина - 1 мг/мл. 0,25 мл полученного раствора помещают в мерную колбу на 25 мл и разбавляют метанолом. Концентрация левомицетина в стандартном растворе 10 нг/мкл.

При анализе сметаны ее разбавляют в 2,5 - 5 раз в зависимости от жирности. Сыры и творог гомогенизируют с водой до получения гомогенной массы.

3.2. Хроматографическое разделение

На пластинку для тонкослойной хроматографии наносят (рис. а - рисунки здесь и далее не приводятся): в точки 1, 3 и 5 соответственно 1, 2 и 4 мкл раствора стандарта, а в точки 2 и 4 соответственно 3 и 10 мкл концентрированного экстракта.

    Пластинку  помещают  в  камеру  для  ТСХ  и  хроматографируют в системе

растворителей  хлороформ  -  метанол  10:1.  По достижении фронтом  элюента

верхнего  края пластинки ее вынимают, сушат, опрыскивают раствором  SnCl  в

                                                                        2

HCl,     оставляют     на     15     мин.     и    опрыскивают    раствором

n-диметиламинобензальдегида.  Появление  желтых пятен на хроматографической

пластинке    по   оттенку   и   R ,  соответствующих   пятнам    стандарта,

                                 f

свидетельствует  о возможном присутствии левомицетина в продукте. Сравнивая

интенсивность  окраски  пятен  стандартов  и  опытной пробы, ориентировочно

оценивают содержание левомицетина в экстракте.

               4. Подтверждение наличия левомицетина в пробе

    Аликвотную  часть  экстракта (50 - 100 мкл) упаривают досуха, добавляют

150  мкл  10%  раствора HCl, греют на масляной бане при температуре 98 °С в

течение 30 мин., отдувают досуха азотом и приливают 200 мкл 2% метанольного

раствора N CO .

          2  3

    На  хроматографическую  пластинку наносят 5 - 10 мкл полученной пробы и

соответствующее количество стандарта левомицетина (с учетом предварительной

оценки  содержания  левомицетина  в экстракте); пластинку помещают в камеру

для  ТСХ  и  хроматографируют в системе растворителей хлороформ - метанол -

уксусная кислота - вода 12:5:4:2.

    По  достижении  фронтом  элюента  верхнего края пластинки ее  вынимают,

сушат,  опрыскивают  раствором  SnCl   в  HCl,  оставляют  на 15 мин. Вновь

                                    2

опрыскивают  раствором  n-диметиламинобензальдегида. Появление желтых пятен

на  хроматографической  пластинке  по  оттенку и R , соответствующих пятнам

                                                  f

стандарта, подтверждает наличие левомицетина в продукте.

                  5. Количественное определение и расчет

                    содержания левомицетина в продукте

    При  необходимости  точного  количественного определения левомицетина в

пищевом продукте на хроматографическую пластинку наносят в несколько точек,

близко  расположенных  друг  к другу, аликвотную часть экстракта и таким же

образом  раствор  стандарта  так,  чтобы количество левомицетина в нем было

близко  к  установленному  в  пробе  при ориентировочной визуальной оценке.

Пластинку  хроматографируют  и  опрыскивают  как  в  п.  3.2. Вырезают зоны

левомицетина  в  опытной пробе, стандарте и соответствующую по R  и площади

                                                                f

зону  на  пластинке,  служащую  контролем  (рис. б). Зоны элюируют 3 x 1 мл

метанола,  метанол  упаривают досуха, приливают 200 мкл 5% раствора SnCl  в

                                                                        2

5% HCl, греют при температуре 98 °С в  течение  1  часа;  пробы  охлаждают,

добавляют  по 2 мл 1% раствора n-диметиламинобензальдегида в метаноле, 1 мл

метанола и измеряют оптическую плотность полученных растворов опытной пробы

и  стандарта относительно контрольной пробы на спектрофотометре в кюветах с

l = 10 мм при лямбда = 430 нм.

    Рассчитывают содержание левомицетина в пробе продукта по формуле:

                                 ОП  x P x V

                       -3          о

                 C = 10   x k x ------------- (мг/кг),

                                ОП   x V  x M

                                  ст    1

    где:

    k - коэффициент,   учитывающий   полноту   извлечения   левомицетина из

пищевого  продукта  и равный 1,33 для мяса, 1,13 - для молока и 1,25 -  для

яиц;

    ОП   - оптическая плотность элюата опытной пробы, относ. ед.;

      о

    ОП   - оптическая плотность элюата стандарта, относ. ед.;

      ст

    P - количество стандарта левомицетина, нанесенного на пластинку, мкг;

    V - объем анализируемой пробы, мкл;

    V  - объем  аликвотной  части  экстракта,  взятой  для  количественного

     1

определения, мкл;

    M - масса образца пищевого продукта, кг (л).

Интервал определяемых масс левомицетина составляет 0,5 - 6,0 мкг.

Вычисления проводят до второго десятичного знака.

За окончательный результат испытаний принимают среднее арифметическое двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает 20%.

Окончательный результат округляют до первого десятичного знака.

Заключение

В случае обнаружения остаточных количеств левомицетина и подтверждения правильности его идентификации в исследуемых пищевых продуктах вопрос с их реализацией решается согласно "Методическим указаниям по определению остаточных количеств антибиотиков в продуктах животноводства". Москва, Минздрав СССР, ГОЭУ. 1985 г., 34 с. <*>

--------------------------------

<*> N 3049-84 от 29 июня 1984 г.

РЕЦЕНЗИЯ

НА МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ОБНАРУЖЕНИЮ,

ИДЕНТИФИКАЦИИ И ОПРЕДЕЛЕНИЮ ОСТАТОЧНЫХ КОЛИЧЕСТВ

ЛЕВОМИЦЕТИНА В ПРОДУКТАХ ЖИВОТНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ

Представленные рекомендации являются первой в СССР попыткой наладить систематический контроль за наличием и уровнями левомицетина в пищевых продуктах. До настоящего времени анализ левомицетина при необходимости выполняли микробиологически. Однако, отсутствие чувствительных тест-культур не позволяет рассчитывать на обнаружение микрограммовых количеств этого антибиотика такими способами. В связи с этим особенно важно создание химического метода контроля остаточных количеств левомицетина, позволяющего с небольшими затратами обнаружить, идентифицировать и количественно определить его содержание. Левомицетин обладает определенной токсичностью и поэтому запрещен к использованию как у нас в стране, так и за рубежом для лечения, например, лактирующих коров или кур-несушек. Анализ литературных данных позволяет сделать заключение, что применение его для лечения сельскохозяйственных животных и птицы - достаточно частое явление, оправданное дешевизной и эффективностью препарата.

Интенсификация сельскохозяйственного производства может стать одной из причин снижения качества пищевых продуктов и, в частности, загрязнения их антибиотиками. Поэтому своевременный и надежный контроль за наличием левомицетина становится важным и актуальным.

Все отмеченное позволяет рекомендовать утвердить разработанные методические рекомендации для внедрения в практику работы учреждений Госсаннадзора. Полученные этим методом материалы целесообразно обобщить для создания общей картины частоты и уровней загрязнения пищевых продуктов БССР левомицетином.

Руководитель отдела гигиены питания

Института питания АМН СССР, профессор

Г.И.БОНДАРЕВ