Утверждены

Минздравом СССР

8 июня 1989 г. N 5026-89

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

ПО ОПРЕДЕЛЕНИЮ ТРИФУМИНА И ЕГО МЕТАБОЛИТОВ В ОВОЩАХ,

ФРУКТАХ, ЗЕРНЕ, ПОЧВЕ И ВОДЕ МЕТОДОМ

ТОНКОСЛОЙНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ <*>

--------------------------------

<*> Разработаны М.В. Письменной, М.А. Клисенко (ВНИИГИНТОКС).

    Краткая  характеристика  препарата и его основных метаболитов. Трифумин

(NF-114, трифмин), действующее начало 4-хлор-альфа, альфа,   альфа-трифтор-

N-1(III-имидазол-1-ил)-2-пропоксиэтилиден-0-толуидин.    Брутто  -  формула

C  H  ClF N O.   Молекулярная   масса   345,75.   Общепринятое   название -

 15 15   3 3

трифлумизол.   Кристаллический   порошок   без  запаха,  т.  пл.  63,5  °C,

растворимость  (г/100  мл  при  25 °C): в воде (pH 5,3) - 0,0015, ацетоне -

261, хлороформе - 185, н-гексане - 4,4, метаноле - 50; давление паров 1,9 x

  -4

10   Па  (25  °C).  В  водных  растворах  наиболее  устойчив  при  pH 6.  С

увеличением  температуры  гидролиз  значительно ускоряется. Временные МДУ в

огурцах,  томатах,  яблоках  0,1  мг/кг. Содержание трифумина в винограде и

землянике не допускается.

    Основные   метаболиты   трифумина:    1-(4-хлор-1-трифторметилфенил)-2-

пропоксиамидин,  (ТМ-6-1).   Белые   кристаллы  без  запаха,  растворимы  в

метаноле,   н-гексане,   дихлорметане.   Брутто - формула    C  H  ClF N O.

                                                              12 14   3 2

Молекулярная       масса       294,6.     N-(4-хлор-2-трифторметилфенил)-1-

пропоксиацетамид, (ФД-1-1) - бесцветная маслянистая жидкость, растворима  в

метаноле,   н-гексане,    дихлорметане.   Брутто - формула   C  H  ClF NO .

                                                              12 13   3  2

Молекулярная масса 295,7.

    Принцип метода. Метод основан на экстракции трифумина и его метаболитов

из  пробы  органическим  растворителем,  концентрировании,  очистке на слое

Al O   после  перераспределения веществ в смесь этанол  - 0,02 н HCl (1:1),

  2 3

последующем  подщелачивании  раствора до pH 7,5 и экстракции их в н-гексан.

Тонкослойнохроматографическое  определение проводят в тонком слое пластинок

"Алуфол" или "Силуфол", используя в качестве проявляющего реагента 1-нафтол

после  термического разложения веществ на пластинке до ароматического амина

и  диазотирования,  либо  реагент  на основе бромфенолового синего с AgNO .

                                                                         3

Первый  вариант  проявления позволяет обнаружить трифумин и его метаболиты,

второй - только трифумин.

Метрологическая характеристика метода. Нижний предел обнаружения по реакции азосочетания 0,2 мкг (на пластинках "Алуфол"), 3 мкг (на пластинках "Силуфол"); по реакции с бромфеноловым синим 1 мкг (на пластинках "Силуфол"). Метрологические характеристики определения трифумина в воде, почве, овощах, фруктах и зерне приведены в таблице 141.

Таблица 141

МЕТРОЛОГИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ МЕТОДА

┌────────┬──────────┬─────────────┬────────────┬─────────────┬────────────┐

│Опреде- │Иссле-    │Нижний предел│  Среднее   │Доверительный│   Число    │

│ляемое  │дуемый    │определения, │  значение  │  интервал   │параллельных│

│вещество│объект    │  мг/кг или  │определения,│среднего при │определений,│

│        │          │  мг/л <*>   │     %      │ p = 0,95, % │     n      │

├────────┼──────────┼─────────────┼────────────┼─────────────┼────────────┤

│Трифумин│Вода      │0,001 <**>   │86          │+/- 8,4      │7           │

│        │Овощи,    │0,004        │92          │+/- 2,9      │30          │

│        │фрукты    │             │            │             │            │

│        │Зерно     │0,008        │91          │+/- 10,4     │7           │

│        │Почва     │0,004        │91          │+/- 8,9      │7           │

│ФМ-6-1  │Вода      │0,001 <**>   │92          │+/- 7,9      │8           │

│        │Овощи,    │0,004        │95          │+/- 2,1      │30          │

│        │фрукты    │             │            │             │            │

│        │Зерно     │0,008        │90          │+/- 8,7      │7           │

│        │Почва     │0,004        │96          │+/- 4,2      │7           │

│ФД-1-1  │Вода      │0,001 <**>   │85          │+/- 9,1      │8           │

│        │Овощи,    │0,004        │92          │+/- 2,5      │30          │

│        │фрукты    │             │            │             │            │

│        │Зерно     │0,008        │88          │+/- 10,8     │7           │

│        │Почва     │0,004        │87          │+/- 9,0      │7           │

└────────┴──────────┴─────────────┴────────────┴─────────────┴────────────┘

--------------------------------

<*> Приведены данные при обнаружении по реакции азосочетания на пластинках "Алуфол".

<**> Предел определения в воде можно снизить в 2,5 раза (до 0,0004 мг/л), увеличив объем пробы, взятой для анализа, до 500 мл.

Избирательность метода. Применение двух проявляющих реагентов, позволяющих обнаруживать трифумин по различным функциональным группам, дает возможность идентифицировать его в присутствии хлор-, фосфорсодержащих пестицидов, триазинов, производных фенилмочевины.

Реактивы и материалы. Ацетон х.ч. н-Гексан х.ч. Сульфат натрия безводный, ч. Хлороводородная кислота х.ч., концентрированная и 0,01 и 0,02 н водные растворы, приготовленные из фиксанала. Гидроксид натрия х.ч., 0,01 н водный раствор. Гидроксид калия ч. Хлорид натрия ч.д.а. 1-Нафтол ч.д.а. Бромфеноловый синий индикатор ч.д.а. Нитрат серебра ч.д.а. Этанол 96-процентный, стандартные пластинки "Алуфол", "Силуфол" (20 x 20 см), "Хемапол", ЧСФР. Индикаторная бумага универсальная "Реахим" или "Лахема", "Хемапол", ЧСФР. Оксид алюминия для хроматографии. Фильтры легкофильтрующие "красная лента". Препарат трифумин, метаболиты трифумина ФМ-6-1 и ФД-1-1. Основные стандартные растворы трифумина и его метаболитов с концентрацией на 1000 мкг/мл готовят растворением 25 мг каждого вещества в 5 мл ацетона. Объем раствора доводят в мерных колбах н-гексаном до 25 мл. Трифумин в растворе устойчив при хранении в течение 1,5 мес., метаболиты - 3 мес. Рабочий стандартный раствор - смесь трифумина и его метаболитов. Вносят 5 мл основного стандартного раствора каждого вещества в мерную колбу вместимостью 50 мл и доводят объем раствора н-гексаном до метки. Концентрация в смеси каждого вещества 100 мкг/мл. Растворы устойчивы в холодильнике в течение 10 дней. Проявляющие реагенты: N 1 - а - к смеси из 46 мл воды и 4 мл концентрированной хлороводородной кислоты прибавляют 1 г нитрита натрия; б - к раствору 2,8 г гидроксида калия в 50 мл воды прибавляют 0,1 г 1-нафтола. Проявляющие реагенты применяют свежеприготовленными; N 2 - а - 0,05 г бромфенолового синего растворяют в 10 мл ацетона и доводят объем раствора до 100 мл 1-процентным водно-ацетоновым (вода-ацетон 1:3) раствором нитрата серебра; б - 5-процентный водный раствор уксусной кислоты по объему (5 мл уксусной кислоты и 95 мл воды). Растворы устойчивы в течение 2 мес.

Приборы и посуда. Аппарат для встряхивания. Дробилка почвенная лабораторная или ступка. Ротационный вакуумный испаритель. Колбы мерные вместимостью 25; 50 и 100 мл, конические вместимостью 50; 100 и 250 мл; грушевидные вместимостью 50 и 100 мл ОКШ 50-14/23ТС. Сита почвенные. Воронки химические, делительные на 50; 250 и 500 мл. Пробирки мерные на шлифах вместимостью 5 мл. Пипетки на 0,1; 0,2; 1; 5 и 10 мл.

Подготовка пластинок для хроматографии. Пластинки "Алуфол" или "Силуфол" перед нанесением пробы промывают в хроматографической камере ацетоном, давая растворителю подняться до верхнего края пластинки. Отмечают верхний край пластинки, дают растворителю испариться с пластинки и прогревают ее 20 мин. при 60 °C. При хроматографировании линия старта должна быть со стороны нижнего края пластинки.

Ход анализа. Экстракция. К 200 мл воды прибавляют 5 г NaCl, перемешивают, прибавляют 50 мл ацетона, а затем переносят в делительную воронку и трижды экстрагируют н-гексаном порциями по 50 мл, встряхивая каждый раз в течение 3 мин. Верхний органический слой сливают в колбу для отгонки, фильтруя через слой безводного сульфата натрия (10 - 15 г), насыпанного на легкофильтрующий фильтр "красная лента", вложенный в фильтровальную воронку. Упаривают растворитель до 0,5 мл под вакуумом на ротационном испарителе при температуре бани не более 45 °C (в фарфоровых чашках при комнатной температуре). Остаток упаривают до 0,2 - 0,3 мл при комнатной температуре и хроматографируют. Пробу количественно наносят на пластинку, ополаскивая колбу н-гексаном (3 - 4 раза по ~ 0,1 мл).

К 50 г почвы, измельченной до 0,5 - 1 см, овощей, фруктов, к 25 г измельченного до 2 - 3 мм и отсеянного от муки зерна прибавляют 60 мл (к зерну - 40 мл) смеси н-гексан-ацетон (7:3) и экстрагируют в течение 30 мин. на аппарате для встряхивания. Экстракт сливают в колбу для отгонки растворителей, фильтруя через слой безводного сульфата натрия (10 г) на фильтровальной воронке с небольшим ватным тампоном. Приливают к пробе новую порцию смеси растворителей, повторяют экстракцию. Экстракты объединяют, сливая через слой безводного сульфата натрия. Если экстракт мутный, добавляют в него безводный сульфат натрия (10 - 15 г), а затем фильтруют через небольшой ватный тампон. Упаривают экстракт до 0,5 мл под вакуумом на ротационном испарителе при температуре бани не более 45 °C. Остаток упаривают досуха при комнатной температуре и очищают от сопутствующих веществ.

Очистка от сопутствующих веществ. Оксид алюминия 2 куб. см (2,5 г) насыпают на легкофильтрующий фильтр "красная лента", вложенный в небольшую фильтровальную воронку, промывают 10 мл 0,01 н HCl, элюат отбрасывают. К сухому остатку в колбе прибавляют 4 мл смеси этанол - 0,02 н HCl (1:1), ополаскивают этим раствором колбу и фильтруют его через подготовленный слой оксида алюминия. Колбу несколько раз ополаскивают 0,01 н HCl (общий объем 10 мл), сливая каждый раз смывы через слой оксида алюминия. Оксид алюминия промывают 5 мл воды и присоединяют к фильтрату. К полученному фильтрату прибавляют 50 мл воды, нейтрализуют раствор 0,01 н NaOH и доводят до pH 7,5 (контроль по индикаторной бумаге). Полученный раствор переносят в делительную воронку и 4 раза экстрагируют н-гексаном, предварительно насыщенным водой, порциями по 20 мл. Объединенные н-гексановые экстракты промывают 20 мл воды, воду отбрасывают, н-гексан сушат, сливая через слой безводного сульфата натрия на воронке. К экстракту прибавляют 20 мл ацетона и упаривают до 0,5 мл под вакуумом, как описано выше для воды.

    Условия  хроматографирования  при  методе  ТСХ.  На пластинку "Алуфол",

промытую  ацетоном,  с  помощью  капилляра  или микропипетки наносят пробу,

ополаскивая колбу 3 - 4 раза небольшими количествами (0,1 мл) н-гексана. На

эту же пластинку наносят 0,05 - 0,2 мл рабочего стандартного раствора смеси

трифумина  и  его  метаболитов. Пластинку хроматографируют в подвижной фазе

гексан-ацетон   (3:1)   при   температуре  в  помещении  20  -  22  °C  или

гексан-ацетон  (4:1)  при  температуре  выше  22  °C.  После того как фронт

растворителя  поднимется  на  10 см, пластинку вынимают из камеры, отмечают

линию  фронта  и  оставляют  на  несколько  минут  на  воздухе до испарения

растворителя.  Затем  пластинку  слегка опрыскивают 0,01  н раствором HCl и

прогревают  в  сушильном  шкафу при температуре 160 - 170 °C в течение 1 ч.

После   охлаждения   ее  помещают  в  камеру  для  опрыскивания  и  орошают

проявляющим  реагентом  N  1  - сначала реактивом а и сразу же реактивом б.

Трифумин  и  его  метаболиты  проявляются в виде красных пятен. Величина R

                                                                          f

трифумина,   ФМ-6-1,   ФД-1-1   и   подвижной   фазе   гексан-ацетон  (3:1)

соответственно  0,23; 0,49; 0,82; в ПФ гексан-ацетон (4:1) - соответственно

0,17;  0,37;  0,78.  Для  этой  реакции  можно также использовать пластинки

"Силуфол", но чувствительность обнаружения будет ниже.

    При использовании проявляющего реагента на основе бромфенолового синего

(реагент  N  2) пробу наносят на пластинку "Силуфол", хроматографируют в ПФ

гексан-ацетон  (2:1).  При  проявлении  орошают  сначала  реактивом N  2 а,

прогревают  при 100 °C в течение 5 мин. и орошают реактивом N 2 б. Трифумин

проявляется  в  виде  синего  пятна  на  желтом  фоне.  Величина  R   0,35;

                                                                   f

метаболиты   ФМ-6-1   и  ФД-1-1  в  малых  концентрациях  (до  10  мкг)  не

обнаруживаются, при больших концентрациях они могут проступать в виде более

светлых,  чем  фон, пятен. Величина R  ФМ-6-1 и ФД-1-1 соответственно равна

                                     f

0,61 и 0,93.

Обработка результатов анализа. Количественное определение трифумина и его метаболитов проводят путем сравнения интенсивности окраски и размера пятен проб с пятнами стандартных растворов на одной пластинке. Прямо пропорциональная зависимость площади пятен от концентрации препаратов (при одинаковом диаметре пятна, нанесенного на старте) наблюдается в пределах 0,2 - 5 мкг (пластинки "Алуфол", проявляющий реагент N 1); 1 - 20 мкг (пластинки "Силуфол", проявляющий реагент N 2). При больших концентрациях следует анализировать аликвотную часть экстракта параллельной пробы.

Концентрацию трифумина и его метаболитов (X, мг/кг) вычисляют по формуле:

                                       A

                                   X = -,

                                       P

где:

A - количество трифумина (или метаболита), найденное в хроматографируемой пробе, мкг;

P - навеска анализируемой пробы, г.

Требования безопасности. Соблюдать требования безопасности, принятые для работы с пестицидами и легковоспламеняющимися жидкостями.