Утверждены

Минздравом СССР

8 июня 1989 г. N 5018-89

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

ПО ОПРЕДЕЛЕНИЮ ОСТАТКОВ ГЛИНА (ХЛОРСУЛЬФУРОНА) В ЗЕРНЕ

И СОЛОМЕ ЗЕРНОВЫХ КОЛОСОВЫХ КУЛЬТУР, В СЕМЕНАХ И ПОЛОВЕ

ЛЬНА-ДОЛГУНЦА МЕТОДОМ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ

ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ <*>

--------------------------------

<*> Разработаны В.А. Калининым, Т.С. Калининой (ТСХА).

    Краткая  характеристика  препарата.  Глин - N-(4-метил-6-метокси-1,3,5-

триазинил-2)-N'-[2-метоксикарбонил фенилсульфонил]мочевина.    Общепринятое

название  - хлорсульфурон. Брутто-формула C  H  ClN O S. Молекулярная масса

                                           12 12   5 4

357,8.  Химически чистый глин представляет  твердое  белое  кристаллическое

вещество, т. пл. 174 - 178 °C. В виде сухой  пленки на стеклянной пластинке

он устойчив к УФ-свету, через 1 мес.  на ткани сухого растения  разрушается

на 30%, сухой почве - на 15% и в водном  растворе  - на 50%  под  действием

искусственного солнечного  света.  В  дистиллированной  воде  гидролизуется

медленно при pH от 5,7 до 7,0 и 20 °C, период полураспада  -  4 - 8 недель.

В  почве  фитотоксичные  остатки хлорсульфурона сохраняются до 2 лет,  хотя

период его полураспада составляет  4 -  6  недель.  В  растительных  тканях

препарат  быстро  распадается до нетоксичных  метаболитов. Хорошо растворим

в метиленхлориде, этилацетате, ацетонитриле, ацетоне,  растворимость в воде

зависит от pH и колеблется  от 27,9  до  300 мг/л.  Глин  малотоксичен  для

человека  и  теплокровных  животных.  Для  крыс  ЛД    >  5500 мг/кг.   Это

                                                   50

повсходовый гербицид,  эффективный  в  борьбе  с  двудольными  сорняками  в

посевах зерновых  культур  и  льна. Особо чувствительны к  этому  гербициду

сахарная  и  кормовая свекла, кукуруза, подсолнечник,  картофель.  Гербицид

разрешен для применения в посевах  льна-долгунца в виде 75-процентной сухой

текучей суспензии при норме расхода 13 - 20 г/га.

Принцип метода. Метод основан на определении глина с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии, с использованием фотокондуктивного детектора и колонки с силикагелем, после экстракции органическим растворителем и очистки экстракта перераспределением действующего вещества в двух несмешивающихся растворителях. Количественное определение проводится методом абсолютной калибровки.

Метрологическая характеристика метода. Метрологическая характеристика метода приведена в таблице 104.

Таблица 104

МЕТРОЛОГИЧЕСКИЕ ДАННЫЕ МЕТОДА

(n = 5, p = 0,95)

┌─────────────┬────────────┬─────────────┬────────┬────────────┬──────────┐

│Анализируемый│   Предел   │  Диапазон   │Среднее │Стандартное │Довери-   │

│   объект    │обнаружения,│определяемых │значение│отклонение, │тельный   │

│             │   мг/кг    │концентраций,│опреде- │     %      │интервал, │

│             │            │    мг/кг    │ления, %│            │%         │

├─────────────┼────────────┼─────────────┼────────┼────────────┼──────────┤

│Зерно        │0,01        │0,01 - 0,2   │83      │+/- 7,35    │+/- 9,31  │

│Солома       │0,05        │0,05 - 0,2   │78      │+/- 6,81    │+/- 7,03  │

│Полова льна  │0,05        │0,05 - 0,2   │81      │+/- 6,76    │+/- 7,52  │

│Семена льна  │0,01        │0,01 - 0,2   │80      │+/- 8,23    │+/- 10,2  │

└─────────────┴────────────┴─────────────┴────────┴────────────┴──────────┘

Избирательность метода. В предлагаемых условиях метод специфичен в присутствии пестицидов, применяемых при выращивании зерновых и льна-долгунца: 2,4-Д, 2М-4Х, байлетона, тилта, нурел-Д.

    Реактивы,  растворы.  Хлорсульфурон с содержанием действующего вещества

99,9%.  Ацетонитрил,   высушенный  над  безводным  Na SO    и  перегнанный.

                                                     2  4

н-Гексан.  Хлороводородная  кислота  х.ч.,  1 н  водный  раствор.   Кислота

уксусная  ледяная.  Метиленхлорид  перегнанный х.ч. Фосфат натрия безводный

ч.д.а.  Хлорид  натрия.  Гидроксид натрия,  1 н  водный раствор.  Метиловый

спирт для хроматографии.  Изопропиловый  спирт х.ч.  Хлороформ медицинский.

Циклогексан для хроматографии. Гелий. Подвижная фаза для ВЭЖХ: смесь 750 мл

циклогексана,  125  мл  изопропанола,  125  мл  метанола,  1 мл смеси 10 мл

ледяной  уксусной  кислоты  с  1  мл  дистиллированной  воды.  Раствор  для

кондиционирования  колонки для ВЭЖХ:  400 мл  изопропанола + 100 мл ледяной

уксусной  кислоты  +  10 мл  дистиллированной воды. Буферный раствор pH 10:

1,42 г безводного Na HPO  и 40 г NaCl растворяют в 400 мл воды,  доводят pH

                    2   4

до 10 путем добавления по каплям 1 н  NaOH  при  непрерывном  помешивании и

фиксируя  pH с помощью иономера.  Охлаждающая смесь: 33 г NaCl растворяют в

100 мл воды и добавляют лед до насыщения.

Приборы, аппаратура, посуда. Жидкостный хроматограф с фотокондуктивным детектором, например хроматограф "Waters", модель 510, с детектором Tracor, модель 965, и стальной колонкой длиной 30 см с сорбентом на основе силикагеля с удельной поверхностью 300 кв. м/г и размером частиц 10 мкм, силасорб-300 (ЧСФР, "Хемапол") или мю-порасил ("Waters"). Мельница лабораторная. Ротационный испаритель. Водоструйный насос. Иономер. Воронки: Бюхнера фарфоровые диаметром 70 мм; делительные на 150 мл. Концентраторы грушевидные (конические) на шлифах (N 19). Пипетки мерные на 0,2; 1,0; 5,0; 10 и 25 мл. Стаканы стеклянные на 100 и 600 мл. Колбы: мерные на 25; 50 и 100 мл; Бунзена на 800 мл.

Подготовка к определению. Хранение проб. Отобранные пробы подсушивают до стандартной влажности и хранят в сухом, хорошо вентилируемом помещении. Срок хранения до 6 мес. Перед анализом сухую пробу размалывают на лабораторной мельнице до размера частиц не менее 1 мм.

Кондиционирование хроматографической колонки. Перед началом работы хроматографа раствор для кондиционирования колонки и подвижную фазу дегазируют 2 ч, пропуская через растворы гелий. Операцию повторяют ежедневно в течение 1 ч перед началом анализа, не выключая прибора. При добавлении новой жидкой фазы дегазирование проводят в течение 2 ч. Готовую колонку устанавливают в термостат хроматографа и стабилизируют при 35 °C, пропуская через нее в течение 4 ч раствор для кондиционирования колонки со скоростью 0,5 мл и затем еще 4 ч подвижную фазу для ВЭЖХ с той же скоростью. Эту операцию проводят ежедневно перед началом ввода проб в ночное время с использованием таймеров (реле времени). Нарушение данного режима приводит к резкой потере чувствительности.

Приготовление стандартных растворов. Стандартный раствор N 1 с концентрацией хлорсульфурона 1 мг/мл готовят следующим образом: взвешивают 50 мг хлорсульфурона с точностью +/- 0,02 г, переносят навеску в мерную колбу на 50 мл метиленхлоридом и доводят объем раствора до метки этим же растворителем. Методом последовательного разбавления в метиленхлориде готовят стандартный раствор N 2 концентрацией 100 мкг/мл. Растворы N 1 и N 2 можно хранить в холодильнике не менее 1 мес. Ежедневно из раствора N 2 готовят стандартный раствор N 3 в метиленхлориде с концентрацией хлорсульфурона 1 мкг/мл. Для калибровки хроматографа ежедневно готовят рабочие стандартные растворы с концентрацией хлорсульфурона 0,05; 0,1; 0,2; 0,4; 0,6 мкг/мл, внося пипеткой соответствующее количество раствора N 3 в мерные колбы, упаривая метиленхлорид досуха током азота и доводя объем раствора до метки подвижной фазой. Хроматографируют по 20 мкл каждого рабочего раствора, измеряют высоту пика (или площадь) и строят график зависимости высоты пика от концентрации хлорсульфурона.

Ход анализа. Экстракция и очистка экстракта. Навеску измельченного зерна (50 г) или соломы (10 г) помещают в стакан на 600 мл, заливают 150 мл этилацетата и гомогенизируют в течение 10 мин. при скорости 1000 об./мин. Экстракт декантируют в воронку Бюхнера с фильтром и фильтруют под вакуумом. Экстракцию повторяют дважды порциями по 150 мл этилацетата. Объединенный экстракт (общий объем 450 мл) упаривают досуха на ротационном испарителе при температуре 35 °C, обмывая колбу Бунзена этилацетатом. Сухой остаток в концентраторе растворяют в 10 мл метиленхлорида, добавляют 25 мл буферного раствора (pH 10), и метиленхлорид полностью отгоняют на ротационном испарителе. Недопустимы капли метиленхлорида в водном растворе! Концентратор с водным буфером помещают в ледяную баню с температурой 10 °C на 20 мин. Охлажденный раствор быстро фильтруют в делительную воронку и промывают его тремя порциями хлороформа по 25 мл и двумя - циклогексана по 25 мл. Органические растворители отбрасывают. Водную фазу переносят в стакан и подкисляют 1 н хлороводородной кислотой до pH 2, фиксируя pH на иономере. Подкисленный раствор переносят в делительную воронку (чистую), обмывая стакан хлороформом, и экстрагируют хлорсульфурон из водной фазы тремя порциями по 25 мл хлороформа. Хлороформ упаривают досуха на ротационном испарителе при температуре 35 °C. Сухой остаток растворяют в 5 мл подвижной фазы и хроматографируют.

Навеску измельченных семян льна-долгунца (50 г) помещают в стакан на 100 мл, заливают 150 мл ацетонитрила и гомогенизируют в течение 10 мин. Экстракт декантируют в воронку Бюхнера с фильтром и фильтруют под вакуумом. Повторяют экстракцию еще дважды по 150 мл ацетонитрила. Объединенный экстракт упаривают до объема 50 мл на ротационном испарителе при температуре 35 °C и переносят в делительную воронку, обмывая концентратор 10 мл ацетонитрила. Промывают экстракт 3 раза порциями по 50 мл н-гексана, гексан отбрасывают, а ацетонитриловый экстракт упаривают на ротационном испарителе досуха. Сухой остаток в концентраторе растворяют в 10 мл метиленхлорида, добавляют 25 мл буферного раствора (pH 10) и метиленхлорид полностью отгоняют на ротационном испарителе. Концентратор с водным буфером помещают в ледяную баню с температурой минус 10 °C на 20 мин. Охлажденный раствор быстро фильтруют в делительную воронку и промывают его тремя порциями хлороформа по 25 мл и двумя циклогексана по 25 мл. Органическую фазу отбрасывают. Водную фракцию переносят в стакан, подкисляют 1 н хлороводородной кислотой до pH 2, фиксируя pH на иономере. Подкисленный раствор переносят в делительную воронку (чистую), обмывая стакан хлороформом, и экстрагируют хлорсульфурон из водной фазы хлороформом, тремя порциями по 25 мл. Из полученного раствора с помощью ротационного вакуумного испарителя полностью удаляют растворитель. Сухой остаток растворяют в 5 мл подвижной фазы и хроматографируют.

Условия хроматографирования. Жидкостный хроматограф "Waters", модель 510, с программатором температуры и фотокондуктивным детектором "Тракор", модель 365. Шкала аттенюатора 1 x 5 или 1 x 2. Скорость движения ленты самописца 300 мм/ч. Колонка стальная, длина 30 см, внутренний диаметр 3 мм. Неподвижная фаза - мю-порасил ("Waters"). Температура колонки 35 °C. Скорость потока подвижной фазы 0,5 мл/мин. Объем пробы, вводимой в колонку, 20 мкл. Абсолютное время удерживания хлорсульфурона 11 мин. Линейность детектирования сохраняется в пределах 2 - 20 нг. Каждую анализируемую пробу вводят 2 раза и вычисляют среднюю высоту пика. Образцы, дающие пики, большие, чем стандартный раствор (1,0 мкг/мл), разбавляют.

Обработка результатов анализов. Содержание глина (X, мг/кг) рассчитывают методом абсолютной калибровки по формуле:

                                    S  AV

                                     пр

                                X = -----,

                                     S P

                                      с

    где:

    S , S   - высоты пиков соответственно стандарта и образца, мм;

     с   пр

    A - концентрация стандартного раствора, мкг/мл;

    V - объем экстракта, подготовленного для хроматографирования, мл;

    P - масса анализируемого образца, г.

Требования безопасности. Необходимо соблюдать общепринятые правила безопасности при работе с органическими растворителями, токсичными веществами, электронагревательными приборами и сжатыми газами.