"Методические указания по определению ронита и его метаболитов в биологических средах методами тонкослойной и газожидкостной хроматографии" // Технорма.RU

Утверждены

Минздравом СССР

8 июня 1989 г. N 4999-89

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

ПО ОПРЕДЕЛЕНИЮ РОНИТА И ЕГО МЕТАБОЛИТОВ

В БИОЛОГИЧЕСКИХ СРЕДАХ МЕТОДАМИ ТОНКОСЛОЙНОЙ

И ГАЗОЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ <*>

--------------------------------

<*> Разработаны Л.Г. Александровой (КНИИГТ и ПЗ).

Краткая характеристика препарата. Ронит - S,N-диэтил-N-

циклогексилтиокарбамат. Брутто-формула C H NOS. Молекулярная масса 215,4.

11 21

Светло-желтая маслянистая жидкость с т. кип. 145 - 146 °C при 1300 Па.

Хорошо растворим в большинстве органических растворителей. Растворимость в

воде при 22 °C 100 мг/л. Применяется в качестве гербицида в посевах свеклы.

Принцип метода. Метод основан на экстракции ронита из биологических сред органическим растворителем (хлороформ, гексан) и последующем определении методами тонкослойной (ТСХ) и (или) газожидкостной (ГЖХ) хроматографии. В методе ТСХ используется подвижная фаза на основе гексана, проявляющие реагенты - бромфеноловый синий с нитратом серебра, 2,6-дибром-N-хлорхинонимин или реактив Драгендорфа. В методе ГЖХ используют ТИД, неподвижные фазы SE-30, XE-60, DC-550.

Метрологическая характеристика метода. Метрологическая характеристика метода приведена в таблице 90.

Таблица 90

МЕТРОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА МЕТОДА ОПРЕДЕЛЕНИЯ

РОНИТА В БИОСРЕДАХ (n = 5 и p = 0,95)

┌────────────────┬─────┬──────────────┬────────┬───────────┬──────────────┐

│ Анализируемый │Метод│Нижний предел │Среднее │Стандартное│Доверительный │

│ объект │ │ обнаружения, │значение│отклонение,│ интервал │

│ │ │мкг/мл, мкг/г,│опреде- │ % │ среднего │

│ │ │ мкг/кв. см │ления, %│ │определения, %│

├────────────────┼─────┼──────────────┼────────┼───────────┼──────────────┤

│Желудочный сок, │ГЖХ │0,02 │91,9 │+/- 5,5 │+/- 6,8 │

│слюна │ТСХ │0,25 │81,2 │+/- 8,2 │+/- 10,2 │

│Желчь │ГЖХ │0,02 │86,8 │+/- 6,4 │+/- 7,9 │

│ │ТСХ │0,25 │77,6 │+/- 8,2 │+/- 0,2 │

│Моча │ГЖХ │0,0008 │92,8 │+/- 5,4 │+/- 6,7 │

│ │ТСХ │0,01 │85,0 │+/- 7,6 │+/- 9,4 │

│Кровь │ГЖХ │0,04 │89,8 │+/- 5,9 │+/- 7,3 │

│ │ТСХ │0,5 │85,4 │+/- 8,5 │+/- 10,5 │

│Кожа │ГЖХ │0,04 │90,1 │+/- 5,5 │+/- 6,9 │

│ │ТСХ │0,5 │83,4 │+/- 8,1 │+/- 10,1 │

│Смывы с │ГЖХ │0,002 │92,9 │+/- 5,15 │+/- 6,4 │

│поверхности кожи│ТСХ │0,03 │85,0 │+/- 7,16 │+/- 8,9 │

└────────────────┴─────┴──────────────┴────────┴───────────┴──────────────┘

Избирательность метода. Определению ронита не мешают пестициды, которые могут присутствовать в пробе: диазинон, эптам, метоксихлор, линдан.

Реактивы, растворы, материалы. Ронит х.ч. Ацетон х.ч. Гексан ч. Хлороформ х.ч. Натрия цитрат х.ч., 5-процентный водный раствор. Сульфат натрия безводный ч.д.а. Нитрат серебра х.ч., 0,5-процентный водно-ацетоновый раствор (1 часть воды + 3 части ацетона). Бромфеноловый синий х.ч. Лимонная кислота х.ч., 2-процентный раствор. Нитрат висмута основной ч. Йодид калия х.ч. Серная кислота х.ч., 40-процентный и 20-процентный растворы. Проявляющие реагенты: N 1 - бромфеноловый синий. Взвешивают 50 мг бромфенолового синего, растворяют в 10 мл ацетона и доводят объем раствора до 100 мл 0,5-процентным водно-ацетоновым раствором нитрата серебра. Срок хранения в холодильнике до 1 мес.; N 2 - 2,6-дибром-N-хлорхинонимин х.ч., 0,5-процентный раствор в гексане. Хранят в темной склянке в холодильнике до 1 мес.; N 3 - реактив Драгендорфа. Взвешивают 0,85 г нитрата висмута, приливают 40 мл воды и 10 мл 40-процентного раствора серной кислоты. К полученному раствору прибавляют раствор, содержащий 8 г йодида калия в 20 мл воды. Для опрыскивания хроматографических пластинок к 6 мл исходного раствора приливают 6 мл 20-процентной серной кислоты и 6 мл воды. Исходный раствор можно хранить в холодильнике несколько месяцев.

Оксид алюминия II степени активности для хроматографии. Сульфат кальция безводный ч.д.а. (или гипс медицинский). Хроматографические пластинки "Силуфол" размером 15 x 15 см. Приготовление хроматографических пластинок с оксидом алюминия: 50 г оксида алюминия, просеянного через сито 100 меш, смешивают с 5 г безводного сульфата кальция и 75 мл воды, встряхивают до образования однородной массы. Наливают тонким слоем на 10 стеклянных пластинок размером 9 x 12 см или на 7 - 8 пластинок размером 12 x 15 см. Этанол х.ч. Подвижная фаза: гексан-эфир (3:1) для оксида алюминия; гексан-бензол (7:12), гексан-ацетон (4:1) или гексан-эфир (2:1) для пластинок "Силуфол". Азот, водород в баллонах с редукторами. Насадка хроматографической колонки: хроматон N-AW-DMCS (0,16 - 0,20 мм) с 5% SE-30 либо с 5% XE-60 или 5% DC-550. Бензол х.ч. Диэтиловый эфир х.ч. Вата гигроскопическая, обезжиренная. Приготовление стандартного раствора ронита в хлороформе и гексане с содержанием действующего вещества 100 мкг/мл. Вначале готовят исходный раствор. Для этого взвешивают мерную колбу с небольшим количеством растворителя на аналитических весах. Затем вносят несколько капель пестицида и снова взвешивают. Разница в навеске соответствует массе растворенного вещества. Вычисляют содержание пестицида в 1 мл после доведения растворителем объема раствора в колбе до метки. Из исходного раствора готовят соответствующим разбавлением раствор, содержащий 100 мкг/мл препарата, а из него для ГЖХ - растворы, содержащие 10; 2 и 0,2 мкг/мл препарата.

Приборы, аппаратура, посуда. Ротационный вакуумный испаритель с набором колб. Газовый хроматограф с ТИД. Аппарат для встряхивания. Термостат. Колбы: мерные; грушевидные (для отгонки растворителей). Цилиндры. Пипетки, микропипетки. Стаканы, склянки химические на 50 - 100 мл. Воронки: химические, делительные. Насадка для перегонки с водяным паром (рис. 7 - не приводится). Хроматографическая камера. Пульверизатор стеклянный. Баня водяная. Стеклянные капилляры для нанесения на хроматографические пластинки. Стеклянные пластинки размером 9 x 12 см или 12 x 15 см. Микрошприцы на 10 мкл. Колонки хроматографические длиной 1 м, внутренним диаметром 3 мм. Секундомер. Линейка и лупа измерительная. Микроизмельчитель тканей РТ-2.

Ход анализа. Экстракция и очистка экстрактов. К 2 мл пробы из желудочного сока, желчи, слюны приливают 0,5 мл дистиллированной воды, 3 мл гексана (анализ методом ГЖХ) или 3 мл хлороформа (анализ методом ТСХ) и встряхивают в делительной воронке на холоде в течение 30 - 40 мин. Органический слой отделяют, экстракцию проводят еще дважды свежими порциями растворителя. Порции органического растворителя объединяют, обезвоживают безводным сульфатом натрия, отгоняют при комнатной температуре до объема растворителя 1 мл для ГЖХ и 0,2 - 0,5 мл для ТСХ.

Пробу крови (1 мл) отбирают в пробирку, смоченную нитратом натрия, приливают 3 мл гексана или хлороформа и встряхивают в течение 30 - 40 мин. Далее поступают так, как описано выше.

К 20 - 50 мл пробы мочи приливают 2 - 5 мл воды, 5 - 10 мл гексана или хлороформа и экстрагируют, осторожно встряхивая в течение 40 мин. Далее поступают так, как описано выше.

Пробу кожи предварительно выдерживают в морозильнике 1 - 2 ч. Затем пробу массой 1 г тщательно измельчают, приливают 4 мл хлороформа или гексана и встряхивают в течение 50 - 60 мин. Органический слой отделяют. Экстракцию повторяют еще дважды свежими порциями растворителя. Объединенный экстракт сушат безводным сульфатом натрия и далее поступают так, как описано выше.

Смыв с поверхности кожи проводят ватным тампоном, смоченным дистиллированной водой или этанолом. Тампон помещают в склянку, приливают 20 мл воды так, чтобы весь тампон был покрыт водой. Встряхивают в течение 60 мин. Экстракт сливают, отжимают вату. Промывают вату свежей порцией воды. К объединенному водному экстракту приливают 10 мл гексана (или хлороформа) и экстрагируют перемешиванием растворов в течение 30 - 40 мин. Органический слой отделяют так, как описано выше.

Ход анализа при ТСХ. Пробу 0,2 - 0,5 мл количественно наносят на

хроматографическую пластинку, параллельно на эту же пластинку наносят

стандартные растворы ронита, содержащие 0,5 - 10 мкг. Помещают в

хроматографическую камеру, куда предварительно наливают подвижную фазу.

После поднятия фронта растворителя на высоте 10 - 12 см пластинку извлекают

из камеры и дают улетучиться следам растворителей. Затем применяют один из

проявляющих реагентов. Если хроматографирование проводят на пластинках

"Силуфол", то используют проявляющие реагенты N 1 или N 2. После

опрыскивания проявляющим реагентом N 1 пластинку сразу же помещают в

термостат при температуре 60 - 80 °C на 15 мин. Затем обрабатывают

2-процентным раствором лимонной кислоты. На желтом фоне пластинки зона

локализации ронита окрашивается в синий цвет. Если пластинку опрыскивают

проявляющим реагентом N 2, то пластинку после этого следует поместить в

термостат при 110 - 115 °C на 3 - 5 мин. Зона локализации ронита и его

метаболитов - сульфоксида и сульфона - окрашивается в лимонно-желтый цвет.

Величина R ронита 0,56, сульфоксида - 0,18, сульфона - 0,35. Проявляющий

реагент N 3 применяют при хроматографировании на пластинках с оксидом

алюминия. В этом случае тотчас после опрыскивания реагентом зона

локализации ронита окрашивается в красно-коричневый цвет, а его

метаболитов - в голубовато-сиреневый (ЦГА), вишнево-красный (ДЦГА),

экстрактивных веществ биосред - в желтый. Величина R ронита 0,75,

ЦГА - 0,1, ДЦГА - 0,4.

Ход анализа при ГЖХ. Вводят в хроматограф 2 - 5 мкл из 1 мл очищенного гексанового экстракта. Условия газохроматографического определения приведены в таблице 91.

Таблица 91

УСЛОВИЯ ХРОМАТОГРАФИРОВАНИЯ НА РАЗЛИЧНЫХ КОЛОНКАХ

┌─────────────────────────────┬─────────────┬────────────┬────────────────┐

│ Параметры │ I колонка │ II колонка │ III колонка │

│ │ 5% SE-30 │ 5% XE-60 │ 5% DC-550 │

├─────────────────────────────┼─────────────┴────────────┴────────────────┤

│Носитель │Хроматон N-AW-DTCS (0,16 - 0,20 мм) │

│Детектор │ТИД │ТИД │ТИД │

│Колонка - длина/диаметр, м/мм│1/3 │1/3 │1/3 │

│Температура, °C: │ │ │ │

│ колонки │160 │140 │160 │

│ испарителя │210 │200 │200 │

│Расход газа, мл/мин.: │ │ │ │

│ азота │20 │20 │20 │

│ водорода │15 │15 │15 │

│ воздуха │200 │400 │400 │

│ │ -12 │ -12 │ -12 │

│Чувствительность шкалы │50 x 10 │50 x 10 │100 x 10 │

│электрометра, А │ │ │ │

│Минимально детектируемое │0,2 │2 │2 │

│количество, нг │ │ │ │

│Время удерживания, мин. │4,8 │7,1 │15,9 │

└─────────────────────────────┴─────────────┴────────────┴────────────────┘

Обработка результатов анализа. Определение методом ТСХ. С помощью промасленной миллиметровой бумаги измеряют площадь пятен на хроматограмме пробы и стандартных растворов, наиболее близких по размерам к пробе. Содержание ронита (X, мкг/мл или мкг/г) рассчитывают по формуле:

X = -,

где:

A - количество вещества на хроматограмме пробы, найденное путем сравнения со стандартом, мкг;

P - масса пробы, мл, г.

Определение методом ГЖХ. Количественную оценку результатов проводят методом абсолютной калибровки. Для этого вводят в хроматограф стандартные растворы ронита (2 - 5 мкл), содержащие 0,2 - 20 мкг/мл. Строят градуировочный график зависимости "площадь пика - концентрация" и по нему находят концентрацию ронита в хроматографируемой пробе. Можно воспользоваться формулой, в которую вводят площадь пика на хроматограмме стандарта, наиболее близкого по размерам к пробе. При анализе проб параллельное определение каждой пробы проводят не менее 3 раз.

Расчет концентрации пестицида в исследуемой биологической пробе (X, мкг/мл или мкл/г) проводят по формуле:

C S V

ст пр 1

X = --------,

S VP

ст

где:

C - концентрация пестицида на хроматограмме стандарта, мкг;

ст

S - площадь пика на хроматограмме пробы, кв. мм;

пр

S - площадь пика на хроматограмме стандарта, кв. мм;

ст

V - общий объем экстракта пробы, мл;

V - хроматографируемый объем экстракта, мл;

P - масса или объем пробы, г или мл.

Требования безопасности. Необходимо соблюдать требования безопасности при работе с ядовитыми веществами, электронагревательными приборами и сжатыми газами.