"Методические указания по определению КМП и его метаболита МП в воде, почве, растительном и биологическом материале методом тонкослойной хроматографии" // Технорма.RU

Утверждены

Минздравом СССР

14 июля 1988 г. N 4661-88

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

ПО ОПРЕДЕЛЕНИЮ КМП И ЕГО МЕТАБОЛИТА МП В ВОДЕ,

ПОЧВЕ, РАСТИТЕЛЬНОМ И БИОЛОГИЧЕСКОМ МАТЕРИАЛЕ

МЕТОДОМ ТОНКОСЛОЙНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ <*>

--------------------------------

<*> Разработаны Ю.А. Бунятяном, М.С. Петросян (Филиал ВНИИГИНТОКС).

Препарат КМП рекомендуется для применения в сельском хозяйстве в качестве ингибитора нитрификации азотных удобрений на посевах риса, пшеницы, овощей, хлопчатника. МП - продукт разложения КМП.

Краткая характеристика препаратов. КМП - 1-карбамоил-3(5)-метилпиразол.

Брутто-формула C H N O. Молекулярная масса 125,1. Химически чистое

5 7 3

соединение - кремоватый порошок с резким запахом, т. пл. 127 °C. Хорошо

растворим в ацетоне, хлороформе, этаноле, растворимость в воде 6,5 мг/л.

При нагревании до 180 °C, а также при действии разбавленных кислот и

щелочей разлагается с образованием МП. КМП - среднетоксичное соединение,

ЛД для крыс составляет 1280 мг/кг. МП - 3(5)-метилпиразол. Брутто-формула

C H N . Молекулярная масса 82,1. Химически чистое соединение -

4 6 2

светло-желтая жидкость с пиридиноподобным запахом, плотностью

1,008 мг/куб. м при 20 °C, т. кип. 204 °C. Неограниченно смешивается с

водой и большинством органических растворителей. МП - среднетоксичное

соединение, ЛД для крыс составляет 240 мг/кг.

Принцип метода. Метод основан на извлечении КМП и МП из исследуемой пробы органическим растворителем, очистке экстрактов в кислой среде, реэкстракции препаратов в щелочной среде и хроматографическом разделении в тонком слое пластинок "Силуфол". Зоны локализации препарата и его метаболита обнаруживаются после предварительного облучения УФ-светом и обработки пластинок йод-крахмальным реагентом или реагентом Паули.

Метрологическая характеристика метода представлена в таблице 128.

Таблица 128

МЕТРОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА МЕТОДА (n = 20, p = 0,95)

┌─────────────┬──────────┬─────────────┬────────┬───────────┬─────────────┐

│Анализируемый│Предел │ Диапазон │Среднее │Стандартное│Доверительный│

│ объект │обнаруже- │определяемых │значение│отклонение,│ интервал │

│ │ния, мг/кг│концентраций,│опреде- │ % │ среднего, % │

│ │или л │ мг/кг или л │ления, %│ │ │

├─────────────┴──────────┴─────────────┴────────┴───────────┴─────────────┤

│ КМП │

│ │

│Вода │0,01 │0,01 - 0,1 │93,0 │+/- 3,07 │+/- 1,40 │

│Почва │0,04 │0,04 - 0,4 │85,0 │+/- 1,77 │+/- 0,82 │

│Рис │0,04 │0,04 - 0,4 │90,2 │+/- 3,15 │+/- 1,47 │

│Пшеница │0,04 │0,04 - 0,4 │89,6 │+/- 2,96 │+/- 1,38 │

│Кукуруза │0,04 │0,04 - 0,4 │85,0 │+/- 1,41 │+/- 0,67 │

│Томаты │0,08 │0,08 - 0,4 │85,0 │+/- 1,47 │+/- 0,82 │

│Картофель │0,08 │0,08 - 0,4 │83,0 │+/- 1,99 │+/- 1,00 │

│Биосубстраты │0,2 │0,2 - 2,0 │89,0 │+/- 2,53 │+/- 1,04 │

│ │

│ МП │

│ │

│Вода │0,01 │0,01 - 0,1 │93,0 │+/- 3,07 │+/- 1,4 │

│Почва │0,04 │0,04 - 0,4 │89,0 │+/- 1,89 │+/- 0,78 │

│Рис │0,04 │0,04 - 0,4 │91,0 │+/- 5,3 │+/- 2,19 │

│Пшеница │0,04 │0,04 - 0,4 │90,4 │+/- 4,45 │+/- 1,34 │

│Кукуруза │0,04 │0,04 - 0,4 │89,0 │+/- 2,53 │+/- 1,04 │

│Томаты │0,08 │0,08 - 0,4 │85,0 │+/- 1,77 │+/- 0,82 │

│Картофель │0,08 │0,08 - 0,4 │81,1 │+/- 1,83 │+/- 0,76 │

│Биосубстраты │0,2 │0,2 - 2,0 │85,0 │+/- 1,77 │+/- 0,82 │

└─────────────┴──────────┴─────────────┴────────┴───────────┴─────────────┘

Избирательность метода. В предлагаемых условиях хроматографирования метод специфичен в присутствии близких по структуре и области применения таких соединений, как нитрапирин, 6-хлорпиколиновая кислота, ХГИ, ТМДИ, ГМДИ, АТГ, а также применяющихся на посевах риса - пропанид, базагран.

Реактивы и материалы. КМП х.ч. МП х.ч. Хлороформ х.ч. н-Гексан х.ч.

Этиловый спирт х.ч. Хлороводородная кислота концентрированная х.ч., 1 н.

Безводный сульфат натрия ч. Ацетон х.ч. Натрия гидроксид х.ч.,

20-процентный. Гидроксид калия х.ч., 10-процентный. Нитрит натрия х.ч.,

10-процентный. Кислота сульфаниловая безводная, ч.д.а. Калий

марганцовокислый х.ч., 3-процентный. Йодид калия х.ч., 1-процентный в.р.

Крахмал водорастворимый х.ч., 3-процентный. Фильтры бумажные обеззоленные

"синяя лента", предварительно промытые смесью хлороформ-ацетон (1:1).

Пластинки хроматографические "Силуфол" УФ размером 15 x 15 см.

254

Стандартные растворы КМП и МП, содержащие 1; 10 и 100 мкг/мл. Хранить в

холодильнике не более 3 мес.

Проявляющие реагенты: N 1 - сульфаниловая кислота диазотированная (реагент Паули). Приготовление соли диазония: 5 г сульфаниловой кислоты растворяют в 25 мл 10-процентного раствора гидроксида калия. Охлажденный раствор смешивают с 25 мл 10-процентного раствора нитрита натрия. Этот раствор по каплям при перемешивании прибавляют к охлажденной льдом хлороводородной кислоте (40 мл хлороводородной кислоты + 20 мл дистиллированной воды). Выпавший осадок отмывают на воронке Бюхнера спиртом и сушат на фильтре. При хранении в холодильнике в темной склянке соль устойчива 3 мес. Для опрыскивания готовят рабочий раствор - 1,5-процентный раствор диазониевой соли в 15-процентном растворе гидроксида натрия. Раствор готовят перед употреблением в количествах, необходимых для разового пользования; N 2 - йод-крахмальные реагенты: а - 1-процентный раствор йодида калия; б - 3-процентный раствор крахмала. Перед употреблением смешать растворы а, б и этанол в соотношении 2,5:2,5:1. Раствор для хлорирования. Смешивают равные объемы 3-процентного раствора перманганата калия и 25-процентного раствора хлороводородной кислоты. Готовят перед употреблением в количествах, необходимых для разового пользования.

Приборы, аппаратура, посуда. Ртутно-кварцевая лампа ПРК-2 или ПРК-4. Ротационный вакуумный испаритель. Колбы: мерные на 100 мл; конические на 100 и 250 мл; круглодонные на 100 мл. Воронки делительные и химические. Микропипетки на 0,1 и 0,2 мл. Цилиндры мерные на 50 и 100 мл. Камера хроматографическая. Пульверизаторы стеклянные. Камера для хлорирования (эксикатор).

Отбор проб. Отобранные пробы анализировать сразу.

Ход анализа. Экстракция и очистка экстрактов. Пробу воды (100 мл) помещают в коническую колбу, прибавляют безводный сульфат натрия до насыщения и экстрагируют КМП и МП хлороформом трижды порциями по 50; 30 и 30 мл. Объединенные экстракты фильтруют в перегонные колбы через фильтр "синяя лента" и слой безводного сульфата натрия (1 - 2 г) и отгоняют растворитель на ротационном испарителе при температуре не более 30 °C до объема 0,1 - 0,2 мл. Остаток количественно с помощью хлороформа наносят на хроматографическую пластинку.

Навеску (25 г) измельченной и просеянной почвы трижды экстрагируют ацетоном порциями по 50 мл. Объединенные экстракты фильтруют через фильтр "синяя лента" и слой безводного сульфата натрия (1 - 2 г) и отгоняют растворитель досуха на ротационном испарителе при температуре не выше 30 °C. К сухому остатку прибавляют 10 мл 1 н раствора хлороводородной кислоты, тщательно ополаскивают колбу и переносят в коническую колбу на 100 мл через фильтр "синяя лента". Колбу еще дважды по 10 мл промывают 1 н раствором хлороводородной кислоты и сливают в ту же колбу. Объединенный экстракт хлороводородной кислоты подщелачивают 20-процентным раствором гидроксида натрия до pH 9, затем прибавляют безводный сульфат натрия до насыщения (10 - 12 г) и экстрагируют КМП и МП хлороформом трижды по 15 - 20 мл. Далее поступают аналогично анализу воды.

Измельченную пробу растительного материала (рис, пшеница, кукуруза, картофель, томаты) (25 г) экстрагируют хлороформом трижды по 50 мл. Растворитель фильтруют в перегонную колбу через фильтр "синяя лента" и слой безводного сульфата натрия. Далее поступают аналогично анализу почвы.

Экстракцию из биологического материала (кровь, печень, легкие, почки, сердце, селезенка, мозг, моча, кал) проводят следующим образом. Измельченную пробу (5 г или 5 мл) трижды экстрагируют хлороформом по 15 - 20 мл. Объединенный экстракт фильтруют в перегонную колбу через фильтр "синяя лента" и слой безводного сульфата натрия. Далее поступают аналогично анализу почвы.

Условия хроматографирования. После отгонки растворителя пробы с помощью хлороформа количественно наносят на пластинки "Силуфол" на расстоянии 1 см от нижнего края пластинки. Справа и слева от пробы наносят стандартные растворы КМП и МП (в одну точку), содержащие известные количества препаратов. Развитие хроматограммы проводят в системе гексан-ацетон (5:3). После поднятия фронта растворителя на 14 см пластинку проветривают на воздухе до полного удаления растворителей. Затем пластинку подвергают облучению УФ-светом и течение 35 - 40 мин. и обрабатывают из пульверизатора проявляющими реагентами N 1 или N 2.

1. Опрыскивание рабочим раствором реагента Паули (на одну пластинку расходуется 1,5 - 2 мл реагента). Зоны локализации КМП и МП обнаруживаются в виде красных пятен на белом фоне. Окраска пятен МП устойчива в течение нескольких дней, КМП - 5 - 10 мин. Предел обнаружения на пластинке составляет для КМП 2 мкг; МП - 0,5 мкг.

2. После УФ-облучения пластинки помещают в камеру с раствором для

хлорирования на 3 мин., оставляют пластинку на воздухе до полного удаления

запаха хлора (около 15 мин.) и обрабатывают из пульверизатора

йод-крахмальным проявляющим реагентом. Зоны локализации обнаруживаются в

виде синих пятен на светлом фоне. Окраска пятен устойчива в течение 3 дней.

Предел обнаружения на пластинке составляет для КМП 0,1 мкг, для МП 1 мкг.

Величины R составляют для КМП 0,55 +/- 0,02, для МП 0,35 +/- 0,02.

Обработка результатов анализа. Количественную оценку проводят путем сравнения площадей и интенсивности окраски пятен проб и стандартных растворов. Содержание КМП и МП в анализируемой пробе (X, мг/кг или л) определяют по формуле:

X = -,

где:

A - количество КМП, МП, найденное путем сравнения со стандартами, мкг;

P - навеска или объем анализируемой пробы, г или мл.

Требования безопасности. Соблюдать все необходимые требования безопасности при работе в химических лабораториях.