Утверждены

Минздравом СССР

11 июля 1988 г. N 4676-88

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

ПО ОПРЕДЕЛЕНИЮ ГИББЕРСИБА В ЛУКЕ, ЧЕСНОКЕ, КАРТОФЕЛЕ,

ОГУРЦАХ, КАБАЧКАХ, БАКЛАЖАНАХ, КАПУСТЕ, ГОРОХЕ, ФАСОЛИ,

ВИНОГРАДЕ МЕТОДОМ ТОНКОСЛОЙНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ <*>

--------------------------------

<*> Разработаны Е.Ю. Козловой, С.М. Обут (НИОХ СО АН СССР).

    Краткая  характеристика препарата. Натриевая соль гибберелловой кислоты

(гиббереллин   A )  -  основное  действующее  начало  препарата  гибберсиб.

                3

Молекулярная  масса  368. Брутто формула C  H  O Na. Гибберсиб представляет

                                          19 21 6

собой  гигроскопический порошок от желтого до коричневого цвета, получаемый

высушиванием на распылительной сушилке продуктов метаболизма гриба Fusarium

moniliforme.  Гибберсиб  является  смесью  натриевых  солей  гиббереллинов,

карбоновых кислот и карбоната натрия. Растворимость гибберсиба в воде 2 г/л

при  20 °C. Растворим в этиловом и метиловом спиртах, этилацетате, ацетоне.

Нерастворим в бензоле и гексане. Гибберсиб применяют в качестве стимулятора

роста растений.

Принцип метода. Определение основано на экстракции гиббереллинов из растительной массы этилацетатом с последующей тонкослойной хроматографией экстракта, обнаружении компонентов путем обработки пластинок 70-процентной серной кислотой, элюировании гиббереллина с пластинок и спектрофотометрировании элюата в области 250 - 270 нм.

    Метрологическая    характеристика    метода.    Диапазон   определяемых

концентраций  0,1 - 25 мг/кг. Предел обнаружения препарата на пластинках 10

мкг,  предел  определения  в  растительной  продукции  - 0,1 мг/кг. Среднее

значение определения стандартных количеств гиббереллина A  80%. Стандартное

                                                         3

отклонение  +/- 11%. Доверительный интервал среднего значения (при p = 95 и

n = 5) +/- 13%.

Избирательность метода. Определению не мешают неорганические компоненты препарата, карбоновые кислоты, другие гиббереллины, экстрактивные вещества из плодов, а также хлор- и фосфорсодержащие пестициды.

    Реактивы  и  растворы.  Этилацетат  ч.  Хлороформ. Метанол ч.д.а. Спирт

этиловый.  Кислота  хлороводородная  х.ч.,   7-процентный  водный  раствор.

Сульфат магния ч.,  прокаленный.  Аммиак водный технический, 0,5-процентный

водный  раствор.  Хлорид  натрия  х.ч.,  насыщенный  водный  раствор.  Вода

дистиллированная.  Серная  кислота  х.ч.,   70-процентный  водный  раствор.

Гиббереллин    кристаллический.     Стандартный    раствор     гиббереллина

кристаллического (A ) - 120 мг в 100 мл этилацетата. Срок хранения 1 мес. в

                   3

холодильнике. Пластинки "Силуфол" размером 5 х 15, 15 х 15 или 20 х 20 см.

    Приборы   и   посуда.   Спектрофотометр   СФ-16,  СФ-26.  Комплект  для

тонкослойной хроматографии типа АТХ-1. Центрифуга типа ЦЛС-31М. Ротационный

вакуумный  испаритель. Мясорубка бытовая или измельчитель тканей типа РТ-2.

Весы  аналитические.  pH-метр.  Пульверизатор  стеклянный. Микропипетки или

микрошприц.  Цилиндры  мерные.  Воронки.  Колбы.  Шаблон  для расчерчивания

пластинок на клиновидные полосы из оргстекла (рис. 4 - не приводится).

    Подготовка   к   определению.   Построение   градуировочного   графика.

Стандартные количества гиббереллина A  хроматографируют методом клиновидной

                                     3

хроматографии,  фотометрируют  в  условиях,  описанных  в  разделе "Условия

хроматографирования",  строят  график  зависимости  оптической плотности от

содержания  гиббереллина (табл. 64). Анализ начинают в день отбора проб или

на следующий день.

Таблица 64

ШКАЛА СТАНДАРТОВ ДЛЯ ПОСТРОЕНИЯ ГРАДУИРОВОЧНОГО ГРАФИКА

┌─────────────────────────────────┬──────────────────────────────┐

│           Показатели            │Номер градуировочного раствора│

│                                 ├──────┬─────┬─────┬─────┬─────┤

│                                 │  1   │  2  │  3  │  4  │  5  │

├─────────────────────────────────┼──────┼─────┼─────┼─────┼─────┤

│Количество стандартного раствора,│0,05  │0,10 │0,20 │0,30 │0,40 │

│нанесенного на пластинку, мл     │      │     │     │     │     │

│Содержание A , мг                │0,060 │0,120│0,240│0,360│0,480│

│            3                    │      │     │     │     │     │

└─────────────────────────────────┴──────┴─────┴─────┴─────┴─────┘

    Примечание.  Концентрации  стандартного  раствора A  1200 мкг/мл, объем

                                                       3

раствора для элюирования с пластинок 5 мл.

Ход анализа. Экстракция. К 100 г измельченных на мясорубке плодов приливают 80 мл 0,5-процентного раствора аммиака, тщательно гомогенизируют встряхиванием и полученную массу осаждают на центрифуге в течение 5 - 7 мин. (4000 об./мин.). Надосадочную жидкость сливают, осадок промывают 30 мл раствора аммиака, снова осаждают, объединяют надосадочные жидкости и доводят pH 7-процентной соляной кислотой до 2,4 +/- 0,1. К этому раствору приливают 20 мл насыщенного раствора хлорида натрия и экстрагируют его в делительной воронке этилацетатом трижды порциями по 50 мл. Если при экстракции образуется коллоидный слой, его отделяют на центрифуге или разрушают коллоид этиловым спиртом, прибавляя последний в делительную воронку до растворения коллоидов, и отфильтровывают выпавшие при этом хлопья.

Этилацетатные экстракты объединяют, сушат над безводным сульфатом магния в течение 5 ч, отфильтровывают, выпаривают досуха с помощью ротационного вакуумного испарителя до постоянной массы с отсчетом до 0,0001 г. Затем сухой остаток растворяют в 3 мл этилацетата.

Условия хроматографирования. Стандартные пластинки "Силуфол" с помощью шаблона (см. рис. 4) расчерчивают на клиновидные полосы. Наносят на старт хроматограмм по 10 мкл проб (5 параллельных) и одну пробу стандартного раствора гиббереллина. Пластинки подсушивают на воздухе и хроматографируют в системе растворителей хлороформ-метанол (8:2). Элюирование проводят дважды в одном направлении, каждый раз пропуская фронт растворителя до края пластинки.

По окончании элюирования пластинки подсушивают под тягой и опрыскивают 1,5 - 2 мл 70-процентной серной кислоты.

    Рассматривают   хроматограммы   в   УФ-свете   при   254   нм,  обводят

флуоресцирующие   пятна,  соответствующие  гиббереллину  A ,  вырезают  их,

                                                          3

измельчают   и  заливают  5  мл  этилацетата,  оставляют  стоять  20  мин.,

периодически  взбалтывая.  Затем  осторожно сливают надосадочную жидкость и

измеряют  ее спектр в области 250 - 270 нм (через 5 нм) в кювете с толщиной

поглощающего слоя 1 см против холостой пробы. Находят максимум поглощения и

определяют   содержание   гиббереллина   A    в   анализируемой   пробе  по

                                          3

градуировочному графику.

    Обработка  результатов анализа. Содержание гиббереллина A  в плодах (X,

                                                             3

мг/кг) рассчитывают по формуле:

                                      AM

                                  X = --,

                                      mP

    где:

    A  -  содержание гиббереллина A , найденное по градуировочному графику,

                                   3

мг;

M - масса сухого экстракта, выделенного из навески плодов, мг;

m - количество сухого экстракта, нанесенного на пластинку, мг;

P - навеска плодов, взятая для экстракции, кг.

Требования безопасности. Выполняют правила безопасности, необходимые при работе в химической лаборатории.