"Применение методов ионометрии и пламенной фотометрии для оценки питательных сред на содержание натрия, калия, кальция и хлора. Методические рекомендации" // Технорма.RU

Утверждаю

Заместитель Министра

В.Г.ПАНОВ

30 июня 1988 года

Согласовано

Заместитель Начальника

Главного управления

научных учреждений

А.М.НАУМЕНКО

30 июня 1988 года

ПРИМЕНЕНИЕ МЕТОДОВ ИОНОМЕТРИИ И ПЛАМЕННОЙ ФОТОМЕТРИИ

ДЛЯ ОЦЕНКИ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД НА СОДЕРЖАНИЕ НАТРИЯ,

КАЛИЯ, КАЛЬЦИЯ И ХЛОРА

МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Методы ионометрии и пламенной фотометрии позволяют быстро и точно определить содержание ионов натрия, калия, кальция и хлора в питательных средах. Второй метод определяет содержание макроэлементов, находящихся и в недиссоциированном состоянии, выявляет в средах дополнительные источники этих элементов.

При разработке питательных сред и их контроле необходимы сведения о минеральном составе питательных основ, отдельных ингредиентов ее, самих питательных сред. В действующих "Методических указаниях по применению физико-химических методов контроля питательных сред" МЗ СССР (М., 1977) приводится методика определения хлорида натрия. Настоящее дополнение составлено с целью расширения набора методик для аналитического контроля питательных сред, в частности, определения содержания отдельно натрия, калия, кальция, хлора. Определение этих элементов возможно с помощью методов потенциометрии с ионоселективными электродами и пламенной фотометрии. Применение этих методов в микробиологии мало освоено, в то время как они являются специфичными, информативными, простыми и доступными экспресс-методами.

Настоящие дополнения к методическим указаниям по определению химического состава (ПС) обоснованы результатами сравнительного изучения описанных методов с известным, используемым для определения хлорида натрия в питательных средах с помощью азотнокислого серебра и роданида аммония, выявляющего общее содержание хлорид-ионов в растворе независимо от присутствия одного соединения хлора или нескольких с катионами натрия, калия, магния и др. Возможность применения ионометрии и пламенной фотометрии для определения ионов натрия, калия, хлора и кальция в питательных средах изучена на наборе широко применяемых сред на основе перевара мяса по Хоттингеру и образцах экспериментальных сред.

Предлагаемые методики позволили определить присутствие ионов натрия, калия, хлора в средах и их компонентах, вести целенаправленное конструирование среды. С помощью этих двух методов получены количественные данные отдельно ионов натрия, калия, хлора, находящихся как в диссоциированном, так и в "связанном" состоянии.

1. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ИОНОВ НАТРИЯ И ХЛОРА МЕТОДОМ ИОНОМЕТРИИ

Ионометрия - раздел потенциометрии, использующей в качестве

аналитических детекторов ионоселективные электроды (ИСЭ). ИСЭ -

представляют собой электрохимические полуэлементы, для которых разность

потенциалов на границе раздела фаз "электрод-раствор" зависит от

концентрации определяемого иона в растворе. Катионочувствительные (Na )

стеклянные электроды селективны (по отношению к другим катионам), устойчивы

в редокс-системах, на них не воздействуют белки, они индифферентны к

анионам. Аниончувствительные электроды - индифферентны к катионам.

Для определения концентрации ионов с помощью ИСЭ используют прямую потенциометрию в среде с высокой ионной силой (методы градуировочного графика и стандартных добавок) и потенциометрическое титрование. Техника измерения аналогична измерению pH: необходимы потенциометр (pH-метр) и электрод сравнения. ИСЭ выпускает ЗИП в г. Гомеле и НПО "Аналитприбор", г. Тбилиси.

Определение ионов хлора и натрия методом

двойной стандартной добавки

Методика определения ионов хлора и натрия в сложных микробиологических питательных средах, содержащих высокие концентрации посторонних компонентов, основана на измерении потенциала селективного электрода до и после введения в анализируемый раствор двух идентичных порций (добавок) раствора с известной концентрацией определяемого иона.

Анализ проводят с использованием натриевого (ЭСЛ-51Г-05) и хлоридного

(ЭМ-Cl 01) селективных электродов. Измерение сигнала индикаторного

электрода проводят на потенциометре типа pH-121 и других типов относительно

хлорсеребряного электрода сравнения (ЭВЛ-1МЗ), соединенного с исследуемым

раствором посредством электролитического моста, заполненного 3% гелем

агар-агара с 10% раствором KNO , при перемешивании раствора. Для

приготовления геля навески агар-агара (0,75 г) и KNO 2,5 г, помещают в

25 мл H O и смесь оставляют для набухания, затем при интенсивном

перемешивании доводят до кипения и горячий раствор заливают в трубку,

избегая появления пузырьков воздуха. Постоянство ионной силы в системе

осуществляется введением 2 М раствора нитрата аммония к исследуемому

раствору (рис. 1 - здесь и далее рисунки не приводятся).

Определение ионов Na

Подготовка электрода к работе.

Перед проведением серии анализов по определению ионов Na в питательных

средах Na - селективный электрод готовят к работе следующим образом:

-1

1) выдерживают электрод в 10 М растворе NaCl в течение суток для

приведения мембраны в рабочее состояние;

2) по точной навеске готовят исходный 1 М раствор NaCl (5,85 г в

100 мл), затем для калибровки электрода методом последовательного

разбавления получают рабочие растворы следующих концентраций:

Таблица 1

КАЛИБРОВОЧНЫЕ РАСТВОРЫ ДЛЯ НАТРИЕВОГО ЭЛЕКТРОДА

┌───────────────┬───────────┬───────────┬────────────┬───────────┐

│ │ -3 │ -2 │ -1 │ │

│Конц. NaCl, М │1 x 10 │1 x 10 │1 x 10 │1,0 │

├───────────────┼───────────┼───────────┼────────────┼───────────┤

│pNa = -lg a │3,02 │2,04 │1,11 │0,22 │

│ Na │ │ │ │ │

└───────────────┴───────────┴───────────┴────────────┴───────────┘

Примечание: Таблица приведена из технического описания и инструкции по эксплуатации "pH-метр - милли-вольтметр pH-121".

3) в каждом из приготовленных растворов, начиная с более разбавленного,

измеряют значение потенциала индикаторного электрода (Na ) относительно

электрода сравнения и строят график зависимости потенциала электрода (E)

натрий ионов (pNa) в координатах E - pNa;

4) определяют наклон (S) графика, имеющего вид прямой линии, по

E - E

1 2

соотношению S = -----------. Если S близко к теоретическому значению

pNa - pNa

1 2

(59,16), то электрод пригоден к работе. Проверка работы электрода и

построение градуировочного графика проводится один раз перед проведением

серийных анализов образцов с близким содержанием определяемых компонентов.

При постоянной эксплуатации электрода его характеристику достаточно

проверять один раз в месяц по двум значениям концентраций в средней области

градуировочного графика. При длительном хранении электрода подготовку его к

работе необходимо начинать с "замачивания" мембраны.

Градуировочный график необходим для приближенного определения

содержания ионов в исследуемом образце, а также для выбора концентрации и

величины вводимой добавки стандартного раствора.

Ход анализа.

Навеску сухой среды или точно измеренный объем исследуемой жидкой или

растопленной агаризованной питательной среды разбавляют дважды перегнанной

водой в мерной колбе, тщательно перемешивают. Размер навески и кратность

разбавления H O в мерной колбе подбирается в зависимости от содержания

ионов Na в исследуемом образце. В случае изучения агаризованной среды

используют для разбавления подогретую воду до 45 - 50 °C. Пипеткой отбирают

5 мл полученного раствора, помещают в стаканчик, прибавляют равный объем

2 М NH NO , погружают Na-селективный электрод. 2 М раствора нитрата аммония

4 3

добавляют к раствору исследуемого образца в измерительной ячейке для

поддержания постоянной ионной силы. Связь исследуемого раствора с раствором

электрода сравнения осуществляют посредством электролитического моста.

Раствор перемешивают с помощью магнитной мешалки. Отсчет значений

потенциала E , мВ, по шкале прибора производят через 1 - 2 мин. после

погружения индикаторного электрода. Затем пипеткой вводят добавку V

ст

стандартного раствора C NaCl 1 М (чтобы изменением объема можно было

ст

пренебречь, вводимая добавка не должна превышать 0,5 мл, а концентрация

добавляемого раствора должна быть на 2 порядка больше исследуемого).

Фиксируют значение E , мВ, введение добавки стандартного раствора должно

вызвать изменение потенциала не менее, чем на 30 - 40 мВ. Затем вводят в

исследуемый раствор вторую идентичную добавку и измеряют E , мВ.

Расчет содержания анализируемого иона проводят следующим образом:

вычисляют разность значений потенциалов между первоначально измеренным

и после введения каждой добавки: E - E ; E - E , находят их отношение:

1 2 1 3

E - E

1 3

R = -------;

E - E

1 2

пользуясь табл. 3 определяют, какое значение A = -------- соответствует

ДЕЛЬТА C

вычисленному значению R;

преобразуют выражения относительно C = A x ДЕЛЬТА C;

C x V

ст ст

подставляют ДЕЛЬТА C = ---------,

пробы

C x V

ст ст

тогда C , Моль/л = A ---------,

х V

пробы

где:

C - концентрация стандартного раствора, используемого в виде добавки,

ст

моль/л;

V - объем добавки, мл;

ст

V - объем пробы, взятой для анализа, мл.

пробы

Конечный результат в г/л определяют с учетом разбавления исходного

образца:

C x M x V

х м.к

C = ------------- x 1000 г/л

иссл. V x 1000

иссл.

или величины навески, растворенной в мерной колбе,

C x M x V

х м.к

C = ------------- x 1000 г/л,

иссл. a x 1000

где:

V - объем мерной колбы, мл;

м.к

V - объем пробы, взятой для разбавления, мл;

иссл.

a - навеска образца, г;

M - мольная масса определяемого иона (Na = 23,0 г);

или в %:

C x M x V

х м.к

C = ------------- x 100%.

иссл. V x 1000

иссл.

Определение ионов Cl

Подготовка электрода к работе.

-3

1. Выдерживают хлорид-селективный электрод в 10 М растворе KCl в

течение суток для приведения мембраны в рабочее состояние.

2. По точной навеске готовят исходный раствор KCl 1 М растворением 7,45 г реактива в мерной колбе емкостью 100 мл.

3. Последовательным разбавлением в мерной колбе емкостью 25 мл готовят серию калибровочных растворов KCl следующих концентраций:

Таблица 2

КАЛИБРОВОЧНЫЕ РАСТВОРЫ ДЛЯ ХЛОРИДНОГО ЭЛЕКТРОДА

┌──────────────┬─────────┬─────────┬─────────┬─────────┬─────────┐

│ │ -1 │ -2 │ -3 │ -4 │ -4 │

│Конц. KCl, М │10 │10 │10 │5 x 10 │3 x 10 │

├──────────────┼─────────┼─────────┼─────────┼─────────┼─────────┤

│pCl = -lg a _│1,11 │2,04 │3,02 │3,30 │3,50 │

│ Cl │ │ │ │ │ │

└──────────────┴─────────┴─────────┴─────────┴─────────┴─────────┘

Примечание: Таблица приведена из паспорта электрода мембранного ЭМ-Cl-01.

Таблица 3

РАСЧЕТ АНАЛИЗА ПО МЕТОДУ ДВОЙНЫХ СТАНДАРТНЫХ ДОБАВОК

(ПО ДАННЫМ ФИРМЫ "ORION") <*>

--------------------------------

<*> Таблица приведена из Камман К. (Cammann K.). В кн.: Работа с ионоселективными электродами. М., Мир., 1980. С. 264.

┌───────┬────────────┬┬───────┬────────────┬┬───────┬────────────┐

│ R │ C ││ R │ C ││ R │ C │

│ │ x ││ │ x ││ │ x │

│ │A = --------││ │A = --------││ │A = --------│

│ │ ДЕЛЬТА C││ │ ДЕЛЬТА C││ │ ДЕЛЬТА C│

├───────┼────────────┼┼───────┼────────────┼┼───────┼────────────┤

│1,270 │0,100 ││1,520 │0,694 ││1,670 │1,598 │

│1,280 │0,113 ││1,525 │0,714 ││1,675 │1,643 │

│1,290 │0,126 ││1,530 │0,735 ││1,680 │1,691 │

│1,300 │0,140 ││1,535 │0,756 ││1,685 │1,738 │

│1,310 │0,154 ││1,540 │0,778 ││1,690 │1,787 │

│1,320 │0,170 ││1,545 │0,801 ││1,695 │1,840 │

│1,330 │0,186 ││1,550 │0,823 ││1,700 │1,894 │

│1,340 │0,203 ││1,555 │0,847 ││1,705 │1,948 │

│1,350 │0,221 ││1,560 │0,870 ││1,710 │2,006 │

│1,360 │0,240 ││1,565 │0,896 ││1,715 │2,066 │

│1,370 │0,260 ││1,570 │0,920 ││1,720 │2,126 │

│1,380 │0,280 ││1,575 │0,946 ││1,725 │2,190 │

│1,390 │0,302 ││1,580 │0,973 ││1,730 │2,256 │

│1,400 │0,325 ││1,585 │1,000 ││1,735 │2,326 │

│1,410 │0,349 ││1,590 │1,029 ││1,740 │2,397 │

│1,420 │0,373 ││1,595 │1,056 ││1,745 │2,470 │

│1,430 │0,399 ││1,600 │1,086 ││1,750 │2,549 │

│1,440 │0,427 ││1,605 │1,116 ││1,755 │2,629 │

│1,450 │0,455 ││1,610 │1,147 ││1,760 │2,711 │

│1,460 │0,485 ││1,615 │1,179 ││1,765 │2,801 │

│1,470 │0,516 ││1,620 │1,213 ││1,770 │2,892 │

│1,475 │0,532 ││1,625 │1,245 ││1,775 │2,985 │

│1,480 │0,548 ││1,630 │1,280 ││1,780 │3,088 │

│1,485 │0,565 ││1,635 │1,315 ││1,785 │3,193 │

│1,490 │0,582 ││1,640 │1,353 ││1,790 │3,301 │

│1,495 │0,600 ││1,645 │1,391 ││1,795 │3,416 │

│1,500 │0,618 ││1,650 │1,430 ││1,800 │3,536 │

│1,505 │0,637 ││1,655 │1,469 ││1,805 │3,664 │

│1,510 │0,655 ││1,660 │1,510 ││1,810 │3,797 │

│1,515 │0,675 ││1,665 │1,554 ││1,815 │3,939 │

└───────┴────────────┴┴───────┴────────────┴┴───────┴────────────┘

Калибровочные таблицы 1 и 2 указывают область концентраций, в которой работает данный электрод. Таблицы дают конкретные значения концентраций калибровочных растворов, которые необходимы для проверки работы электродов.

4. В каждом из приготовленных растворов, начиная с более разбавленного,

измеряют значение потенциала. Для этого калибровочный раствор помещают в

стаканчик, погружают хлорид-селективный электрод. Электрод сравнения

помещают в другой стаканчик с насыщенным раствором KNO . Оба раствора

соединяют электролитическим ключом, электроды подключают к клеммам

измерительного прибора.

5. По значениям E, измеренным в растворах с различной концентрацией

KCl, строят график зависимости E, мВ - pCl. Находят крутизну электродной

E - E

1 2

характеристики S = -----------; если соблюдается прямолинейная зависимость

pCl - pCl

1 2

E от pCl и значение S близко к теоретическому (59,16), электрод пригоден к

работе.

Ход анализа.

Методика проведения анализа по определению содержания Cl -ионной

аналогична описанной ранее. Молярная масса (М) определяемого иона Cl =

35,5 г. В качестве стандартного раствора используют 1 М KCl.

Если образец сухой, то берется навеска среды и растворяется в мерной

колбе определенного объема. Величина навески и кратность разбавления водой

подбирается в каждом конкретном случае в зависимости от содержания ионов

+ -

Na или Cl в образце. При этом руководствуются тем, что потенциал,

измеренный в исследуемом растворе, должен лежать на среднем участке

калибровочного графика. Работа в этой области чувствительности электрода

дает наиболее точные результаты. В качестве примера приведем методики

анализа жидкого образца (бульона) и сухой пробы питательной среды.

Анализ бульона на содержание Cl -ионов

1 мл пробы растворяем в мерной колбе емкостью 10 мл. Отбираем 5 мл,

помещаем в стаканчик, прибавляем 5 мл 2 М NH NO , погружаем индикаторный

4 3

электрод. Исследуемый раствор соединяем с электродом сравнения посредством

электролитического ключа. Электроды подключаем к клеммам прибора pH-121.

Измеряем значение потенциала E . Делаем две идентичные добавки (V )

1 ст

стандартного C 1 М KCl по 0,3 мл, каждый раз измеряя значения потенциала

ст

E и E .

2 3

Результаты измерений заносим в таблицу:

┌─────────────────────────────┬──────────────────────────────────┐

│ V мл KCl 1 М │ E, мВ │

├─────────────────────────────┼──────────────────────────────────┤

│- │236 │

│0,3 │196 │

│0,3 │179 │

└─────────────────────────────┴──────────────────────────────────┘

Производим вычисления:

E - E = 236 - 196 = 40 мВ,

1 2

E - E = 236 - 179 = 57 мВ,

1 3

E - E

1 3 57

R = ------- = -- = 1,42.

E - E 40

1 2

По таблице 3 находим, что R = 1,42 соответствует значение

A = -------- = 0,373; подставляем значение ДЕЛЬТА C и решаем относительно:

ДЕЛЬТА C

C x V

ст ст 1 x 0,3

C = A ---------; C = 0,373 x ------- = 0,011 моль/л.

х V х 10

иссл.

Учитывая разбавление исходной пробы (V ), выразим результат

м.к

определения Cl ионов в г/л:

C x M _ x V

х Cl м.к 0,011 x 35,5 x 10

C = ---------------- = ----------------- = 3,9 г/л

иссл. V 1

иссл.

или в %:

C x M _ x V

х Cl м.к

C = ---------------- x 100% = 0,39%.

иссл. V x 1000

иссл.

Анализ сухой пробы питательной среды

Навеску пробы <*> 0,65 г растворяем в мерной колбе емкостью 10 мл.

Отбираем 5 мл раствора, помещаем в стаканчик, прибавляем 5 мл 2 М NH NO .

4 3

Дальнейший ход анализа аналогичен описанному выше.

--------------------------------

<*> Навеску берут в соответствии с рецептурой из расчета на 100 мл изучаемой среды.

Приводим результаты измерений:

┌─────────────────────────────┬──────────────────────────────────┐

│ V мл KCl 1 М │ E, мВ │

├─────────────────────────────┼──────────────────────────────────┤

│- │266 │

│0,4 │231 │

│0,4 │216 │

└─────────────────────────────┴──────────────────────────────────┘

Производим вычисления:

E - E = 266 - 231 = 35 мВ,

1 2

E - E = 266 - 216 = 50 мВ,

1 3

E - E

1 3 50

R = ------- = -- = 1,43.

E - E 35

1 2

По таблице 3 находим, что R = 1,43 соответствует значение

A = -------- = 0,399; подставляем значение ДЕЛЬТА C и решаем относительно:

ДЕЛЬТА C

C x V

ст ст 1 x 0,4

C = A ---------; C = 0,399 x ------- = 0,016 моль/л.

х V х 10

иссл.

Учитывая величину навески (a, г) и объем колбы (V ), используемый для

м.к

ее растворения, выразим результат определения Cl ионов в г/л:

C x M _ x V

х Cl м.к 0,016 x 35,5 x 10

C = ---------------- = ----------------- = 8,7 г/л

иссл. a 0,65

или в %:

C x M _ x V

х Cl м.к 0,016 x 35,5 x 10

C = ---------------- x 100% = ----------------- x 100% = 0,87%.

иссл. a x 1000 0,65 x 1000

2. ОПРЕДЕЛЕНИЕ НАТРИЯ, КАЛИЯ И КАЛЬЦИЯ

МЕТОДОМ ПЛАМЕННОЙ ФОТОМЕТРИИ

Пламенная фотометрия является разновидностью эмиссионного спектрального анализа, широко применяется в клинических лабораториях для определения щелочных и щелочно-земельных металлов в биологических средах и тканях. Метод основан на измерении интенсивности излучения соответствующих элементов. Анализируемый раствор в виде мелких брызг (аэрозоля) с помощью распылителя вводят в пламя горелки. Излучение определяемого элемента отделяют посредством светофильтров (монохроматора) от других и направляют на фотоэлемент. Возникающий при этом фототок измеряют микроамперметром. Количественное определение натрия, калия и кальция в растворах проводят на пламенном фотометре - ФПЛ-1, функциональная схема которого представлена на рис. 2. Метод надежнее химического, особенно при определении малых концентраций и одновременном присутствии нескольких элементов. Нижний предел определения: а) натрия и калия - 0,5 мг/л, для кальция - 5,0 мг/л. Верхний предел всех элементов составляет 100 мг/л, расход анализируемого раствора до 5 мл/мин. Продолжительность измерения 30 секунд.

Приборы и реактивы: пламенный фотометр ФПЛ-1, стандартные растворы калия, натрия и кальция, мерные колбы вместимостью 50 и 100, градуированные пипетки на 1,0 и 5,0 мл, испытуемые вещества, дистиллированная вода.

В случае определения содержания элементов в сухих средах берут навеску

в соответствии с рецептурой из расчета на 100 мл среды и разводят

бидистиллированной водой. Агаризованные среды перед исследованием

расплавляются, в случае необходимости могут дополнительно разводиться

подогретой бидистиллированной водой (t 45 - 55 °C).

Анализируемый раствор в виде аэрозоля с помощью распылителя вводится в

пламя горелки. Наилучшие показатели получаются при величине внутренних

конусов пламени 3 - 4 мм и голубовато-зеленом их цвете (рис. 3).

Прямая пропорциональность между интенсивностью спектральной линии и

концентрацией анализируемого раствора наблюдается лишь при определенных

концентрациях и зависит от природы спектральной линии и пламени.

Возникающий фототок, регистрируемый микроамперметром, является функцией

концентрации определяемого элемента. Для выделения спектральной линии

измеряемого элемента применяются интерференционные светофильтры со

следующими длинами волн в максимуме пропускания: для измерения эмиссии

натрия, калия и кальция лямбда соответственно равно 589 +/- 5; 768 +/- 5

max

и 622 +/- 5 нм.

Определение натрия, калия и кальция

Для каждого элемента готовится разбавлением исходного раствора дистиллированной водой серия стандартных растворов в мерных колбах вместимостью 50 мл. Исходный стандартный раствор NaCl и KCl содержит 200 мг/л натрия и 200 мг/л калия соответственно. Исходный стандартный раствор хлорида кальция содержит 1,0 г/л кальция. Эти растворы используются для приготовления пяти более разбавленных растворов (табл. 4).

Таблица 4

ПРИГОТОВЛЕНИЕ СТАНДАРТНЫХ РАСТВОРОВ

┌────────────────────────────────────────────────────┬────┬───┬───┬───┬───┐

│Порядковые номера разведенных стандартных растворов │1 │2 │3 │4 │5 │

│Объем исходного стандартного раствора, мл │0,25│0,5│1,0│1,5│2,0│

│Содержание натрия, калия, мг/л │1 │2 │4 │6 │8 │

│Содержание кальция, мг/л │5 │10 │20 │30 │40 │

└────────────────────────────────────────────────────┴────┴───┴───┴───┴───┘

Фотометрирование начинают с раствора, имеющего наибольшую концентрацию, чтобы избежать отклонения стрелки микроамперметра за пределы шкалы. Затем последовательно переходят от меньшей концентрации к большей. По полученным данным строят график зависимости i = f(C), где i - сила фототока (мА), f - функция, (C) - концентрация (мг/л).

Перед фотометрированием анализируемых растворов распылитель и газовую горелку тщательно промывают дистиллированной водой в течение 2 - 3 мин., анализируемые растворы фотометрируют и по графику i = f(C) находят искомые концентрации с учетом разбавления питательных сред.

Методические дополнения составлены сотрудниками:

Казанского химико-технологического института им. С.М. Кирова;

Казанского научно-исследовательского института эпидемиологии и микробиологии.