"Постановка теста на цитопатогенность нейссерий в культуре клеток и определению их вирулентности на куриных эмбрионах. Методические рекомендации" // Технорма.RU

Утверждены

Минздравом РСФСР

ПОСТАНОВКА ТЕСТА НА ЦИТОПАТОГЕННОСТЬ НЕЙССЕРИЙ

В КУЛЬТУРЕ КЛЕТОК И ОПРЕДЕЛЕНИЮ ИХ ВИРУЛЕНТНОСТИ

НА КУРИНЫХ ЭМБРИОНАХ

МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Методические рекомендации составлены сотрудниками Казанского научно-исследовательского института эпидемиологии и микробиологии МЗ РСФСР.

В рекомендациях описаны методы постановки теста на цитопатогенность нейссерий в культуре клеток перевиваемого амниотического эпителия человека и определения их вирулентности на развивающихся куриных эмбрионах. Испытание исследуемых штаммов менингококков и других нейссерий по этим тестам может быть использовано для характеристики их вирулентности.

Рекомендации рассчитаны на врачей-бактериологов санитарно-эпидемиологических станций и сотрудников лабораторий научно-исследовательских и производственных учреждений, занимающихся бактериологической диагностикой менингококковой инфекции, изучением биологии менингококков и других нейссерий.

ВВЕДЕНИЕ

Отсутствие адекватной лабораторной модели менингококковой инфекции, простых чувствительных методов определения вирулентности менингококков и других нейссерий побуждает продолжать поиски в этом направлении.

Клеточные культуры, нашедшие широкое применение в лабораторной диагностике вирусных инфекций, в последние годы стали использоваться в качестве модели для исследования возбудителей бактериальных инфекций, в частности, менингококков. Исследование вирулентных свойств менингококков показало, что менингококки в клеточной культуре вызывают выраженный цитопатический эффект (ЦПЭ). В отличие от менингококков непатогенные нейссерии не обладают цитопатогенным действием.

Как известно, выделяемые от больных и носителей штаммы менингококков обнаруживают разную биологическую активность, судя по показателям общепринятых методов определения степени патогенности на лабораторных моделях (куриных эмбрионах, мышах, кроликах). По признаку цитопатогенности они также значительно колеблются. Как правило, штаммы менингококков от больных, особенно выделенные из ликвора, обнаруживают большую цитопатогенность по сравнению со штаммами от носителей. Установлена также существенная разница в степени цитопатогенности у менингококков и представителей группы непатогенных нейссерий.

Тест цитопатогенности нейссерий разработан на группе штаммов

менингококков из коллекции ГИСК им. Л.А. Тарасевича с известной

характеристикой их вирулентности по ЛД для куриных эмбрионов, а также

свежевыделенных штаммах менингококков от больных и носителей. Сопоставление

цитопатогенности эталонных и свежевыделенных штаммов менингококков с

тестированием вирулентности этих же штаммов на мышах по отеку лапки, по

питьевой пробе при интрацеребральном заражении мышей, а также их

вирулентностью на куриных эмбрионах выявило корреляцию цитопатогенности с

показателями вирулентности на животных.

Определение цитопатогенности изучаемых штаммов нейссерий на модели

чувствительной перевиваемой клеточной культуры можно проводить путем

титрования цитопатогенной дозы с расчетом ЦПД по результатам испытания 10

доз микробной взвеси с двукратным шагом. Определение ЦПД представляет

интерес особенно при научных исследованиях. Однако цитопатогенность

нейссерий можно оценить и без титрования ЦПД , с помощью двух

дифференцирующих доз микробной взвеси, что упрощает постановку теста и

делает его доступным для практических лабораторий.

Рекомендуемый тест на цитопатогенность нейссерий позволяет дифференцировать их на три группы по степени выраженности этого признака: высокоцитопатогенные, цитопатогенные и ацитопатогенные. По цитопатическому действию можно косвенно судить о вирулентности испытуемых штаммов нейссерий.

При сравнительном изучении штаммов менингококков, выделенных от больных и носителей в разные периоды эпидемического процесса менингококковой инфекции, установлено, что на фоне падения заболеваемости наблюдается тенденция к снижению цитопатогенности у выделенных штаммов возбудителя. Эти данные служат основанием для рекомендации теста на цитопатогенность в качестве одного из критериев биологической активности штаммов нейссерий, выделяемых в ходе бактериологического надзора.

Известен способ определения вирулентности менингококков на модели

развивающегося куриного эмбриона, основанный на определении с помощью

овоскопии погибших после заражения в аллантоисную полость (АП) эмбрионов и

вычислении ЛД . Для определения ЛД одного штамма менингококка проводят

50 50

титрование десяти доз микробной взвеси с 10-кратным шагом разведения.

Каждым разведением культуры в объеме 0,1 мл заражают по 5 - 10 эмбрионов

(Л.К. Касацкая, 1975).

В связи со сложностью приобретения больших партий куриных эмбрионов способ модифицирован; повышена его информативность и экономичность.

По предлагаемому способу степень вирулентности нейссерий определяют путем заражения куриных эмбрионов микробной взвесью в дозе 200 млн. микробных тел в 0,1 мл на хорионаллантоисную оболочку (ХАО) с регистрацией частоты гибели эмбрионов и тяжести патологоанатомических изменений при вскрытии через 24 ч инкубации при 37°.

Основанием для разработки модифицированного способа оценки вирулентности менингококков в опытах на куриных эмбрионах послужили результаты изучения патолого-анатомической картины вскрытия эмбрионов, погибших после заражения менингококками через 24 - 48 ч. Как выяснилось, инфекционный процесс на модели куриного эмбриона отражает клинику и патолого-анатомическую картину инфекционного процесса у больных генерализованными формами менингококковой инфекции. Специфичность патолого-анатомической картины менингококковой инфекции у куриных эмбрионов была подтверждена в опытах с возбудителями других инфекций. При заражении куриных эмбрионов, например, коринебактериями дифтерии и стафилококками наблюдалась иная картина. Это позволяет использовать развивающийся эмбрион в качестве модели при изучении менингококковой инфекции и определении вирулентности возбудителя.

1. ТЕСТ НА ЦИТОПАТОГЕННОСТЬ НЕЙССЕРИЙ НА КЛЕТОЧНОЙ КУЛЬТУРЕ

1.1. Методика приготовления культуры клеток

Наиболее подходящей клеточной моделью для исследования цитопатогенных свойств нейссерий, по нашим данным, является культура клеток перевиваемого амниотического эпителия человека (линии FL). Помимо происхождения ее из нормальной ткани человека, интенсивной пролиферативной активности и высокой чувствительности к менингококку эта клеточная линия имеет преимущества перед другими в отношении доступности и простоты культивирования в лаборатории. Культура перевиваемых амниотических клеток состоит из морфологически однородных, эпителиоидных, ясно контурированных клеток. Цитопатический эффект на этой культуре получается четким, легко читается при прижизненном наблюдении под малым увеличением микроскопа.

Для постановки теста на цитопатогенность менингококков и других нейссерий используют пробирочные культуры перевиваемых амниотических клеток, приготовленные из маточной линии клеток, постоянно поддерживаемой в лаборатории, или же полученные из вирусологических лабораторий. Клеточные культуры готовят по модифицированному методу (Г.Р. Газизова, 1981) с применением 3-процентного раствора альбуцида (растворимого сульфацил-натрия) вместо общепринятого фосфатно-буферного раствора (или раствора Хенкса) при пересевах перевиваемой клеточной культуры. Раствор альбуцида 3-процентный концентрации не повреждает клетки при ополаскивании монослоя, обладает антисептическим действием и тем самым обеспечивает профилактику микробной контаминации клеток в процессе приготовления клеточных культур, стимулирует процесс версенизации (и трипсинизации), способствует улучшению качества клеток.

Технология приготовления клеточных культур заключается в следующем. Вся работа с клеточными культурами проводится в асептических условиях в специальном боксе. Для приготовления пробирочных культур берут маточные матрасы с плотным монослоем клеток обычно 3 - 7-суточного возраста, сливают ростовую среду и ополаскивают 1 - 2 раза 3-процентным раствором альбуцида на основе 0,85-процентного раствора хлорида натрия. После этого монослой ополаскивают небольшим количеством 0,02-процентного раствора версена, наливают снова 3 - 5 мл того же раствора и оставляют в термостате до отторжения клеток со стекла (5 - 10 мин.). Использование раствора альбуцида и небольшого количества версена позволяют исключить этап центрифугирования клеточной взвеси, обычно применяемый для удаления версена, что также способствует улучшению качества монослоя. Затем в матрас наливают небольшое количество ростовой среды, осторожно встряхивают для получения однородной клеточной взвеси. Часть клеточной взвеси (не более 2/3) отливают из матраса в стерильный флакон для опыта. Стерильной пипеткой из флакона берут выемку 1 - 2 мл для определения концентрации взвеси клеток в камере Горяева. Делают по 2 подсчета клеток в 25 больших квадратах в верхней и нижней камерах, находят среднее число клеток в 25 больших квадратах и умножают на 10000. Например, в результате подсчета в верхней и нижней камерах получилось 40, 42, 38, 36 клеток. Находят среднюю, равную 39, и умножают на 10000, что равно 390000 клеток. Полученный результат будет соответствовать числу клеток в 1 мл. Исходя из этого результата, клеточную взвесь разводят ростовой питательной средой до требуемой концентрации. Оптимальная концентрация клеточной взвеси для получения односуточного монослоя клеток FL лежит в пределах 300000 - 400000 клеток на мл. Из одного матраса (1 л) с клеточной культурой можно получить около 100 пробирочных культур.

В качестве ростовой питательной среды наиболее приемлема стандартная среда 199 с добавлением 10-процентной сыворотки крупного рогатого скота без консерванта и антибиотиков в обычной концентрации (пенициллина 100 ед./мл и стрептомицина 50 ед./мл). При отсутствии или недостатке среды 199 культуры клеток можно адаптировать к среде, состоящей наполовину из среды 199 и 0,5-процентного раствора гидролизата лактальбумина или 5-процентного раствора гемогидролизата (Белорусского НИИЭМГ). В качестве поддерживающей среды используют среду 199 без добавления сыворотки и антибиотиков.

1.2. Методика постановки теста на цитопатогенность

нейссерий

Опыт проводят на 18 - 24 часовых пробирочных культурах клеток FL. Перед опытом необходимо просмотреть клеточные культуры под микроскопом при малом увеличении (ок. 10х, об. 8х) на полноценность монослоя и качество клеток. Для постановки теста пригодна культура со сформировавшимся монослоем прозрачных и морфологически нормальных клеток.

Для испытания на цитопатогенность штаммы нейссерий берут после определения их видовой принадлежности в соответствии с действующими инструкциями. Для заражения культуры клеток используют 16 - 20-часовые культуры менингококка и других нейссерий, выращенных либо на жидкой среде, например, бульоне Хоттингера или средах на основе белковых гидролизатов с 20-процентной сывороткой, либо на 20-процентном сывороточном агаре, с которого делают смыв физиологическим раствором хлорида натрия (pH 7,2 - 7,4). Готовят взвеси нейссерий в концентрациях 40, 20 и 5 ед. по оптическому стандарту мутности ГИСК им. Л.А. Тарасевича (соответственно 4 - 2 - 0,5 млрд. микробных тел на 1 мл) в физиологическом растворе (pH 7,2 - 7,4) или в среде 199 (без сыворотки и антибиотиков).

Перед опытом ростовую питательную среду из пробирок с монослойной

клеточной культурой сливают. В опытные пробирки вносят приготовленные

испытуемые микробные взвеси в объеме 0,4 мл (по 2 пробирки на каждое

разведение взвеси). При этом конечные инфицирующие дозы на пробирку с

культурой клеток для каждого штамма нейссерий получаются соответственно

8 8 8

равными 16 х 10 , 8 х 10 и 2 х 10 микробных тел. В качестве контроля

оставляют 3 - 4 пробирки с незараженной культурой клеток, удалив ростовую

среду. После этого вносят теплую (37°) среду 199 без сыворотки и

антибиотиков в опытные пробирки в объеме 0,6 мл, в контрольные - по 1,0 мл.

Указанные испытуемые дозы микробных взвесей являются дифференцирующими,

поскольку позволяют по степени ответной цитопатической реакции

характеризовать вирулентность испытуемых нейссерий.

Опытные и контрольные клеточные культуры в пробирках инкубируют в наклонном положении под углом в 5° с клеточным пластом под слоем культуральной среды в термостате при 37° в течение 2-х суток, наблюдая за их состоянием через 24 и 48 часов под микроскопом при малом увеличении (ок. 10х, об. 8х). ЦПЭ оценивают по четырехкрестовой системе соответственно проценту погибших клеток: 25% +/- 10% (+), 50% +/- 10% (++), 75% +/- 10% (+++), 100% (++++). (Рис. - не приводится, табл. 1). Высокоцитопатогенные штаммы менингококков в максимальной дозе микробной взвеси уже через 6 - 12 часов вызывают гибель 50 - 75% клеток (++ и +++). Картина ЦПЭ сводится к следующему: оболочка поврежденных клеток становится изъеденной, появляется зернистость цитоплазмы, внутри клеток обнаруживаются микробы, погибшие клетки отслаиваются от стекла. По мере развития ЦПЭ количество поврежденных клеток нарастает, монослой разрежается вплоть до полного разрушения к 24 часам. Через 24 - 48 часов в пробирках с инфицированной клеточной культурой розовый цвет культуральной среды меняется на слаборозовый или желтый, макроскопически видна муть за счет взвешенных микробов, размножившихся в культуральной среде. При микроскопическом исследовании на поверхности клеточного пласта можно увидеть кучки и колонии нейссерий.

Таблица 1

ДЕГЕНЕРАТИВНЫЕ ИЗМЕНЕНИЯ КЛЕТОК FL В ЗАВИСИМОСТИ

ОТ ВЫРАЖЕННОСТИ ЦПЭ В ОТВЕТ НА ДИФФЕРЕНЦИРУЮЩИЕ ДОЗЫ

8 8

МИКРОБНЫХ ВЗВЕСЕЙ НЕЙССЕРИЙ 8 Х 10 И 2 Х 10

┌─────────┬─────────┬─────────┬───────────────────────────────────────────┐

│Степень │ Дозы │ ЦПЭ │ Морфологическая картина ЦПЭ на 24 ч │

│цитопато-│микробной├────┬────┤ │

│генности │ взвеси, │6 ч │24 ч│ │

│штамма │микр. тел│ │ │ │

├─────────┼─────────┼────┼────┼───────────────────────────────────────────┤

│ │ 8 │ │ │ │

│ВЦП │8 х 10 │++ │++++│Гибель всех клеток монослоя, отторжение их │

│ │ │ │ │от стенки пробирки, на стекле остаются │

│ │ │ │ │единичные мертвые уплотнившиеся клетки с │

│ │ │ │ │разрушенной цитоплазмой; культуральная │

│ │ │ │ │жидкость мутная за счет клеточного детрита │

│ │ │ │ │и нейссерий │

│ │ │+ │+++ │Гибель 75 +/- 10% клеток со значительным │

│ │ │ │ │разрушением и разрежением монослоя; среди │

│ │ │ │ │оставшихся клеток видны инфицированные │

│ │ │ │ │клетки с менингококками в цитоплазме и │

│ │ │ │ │погибающие сморщенные клетки; в культураль-│

│ │ │ │ │ной среде клеточный детрии и нейссерии │

│ │ 8 │ │ │ │

│ │2 х 10 │- │- │Гибели клеток нет, монослой, как в контроле│

│ │ 8 │ │ │ │

│ЦП │8 х 10 │- │++ │Гибель 50 +/- 10% клеток, монослой наполо- │

│ │ │ │ │вину сохранен, наряду со здоровыми клетками│

│ │ │ │ │встречаются и пораженные менингококками │

│ │ │- │+ │Гибель 25 +/- 10% клеток, монослой │

│ │ │ │ │незначительно разрежен, большая часть │

│ │ │ │ │клеток интактна, как в контроле │

│ │ 8 │ │ │ │

│ │2 х 10 │- │- │ЦПЭ нет, монослой клеток, как в контроле │

│ │ 8 │ │ │ │

│АЦП │8 х 10 │- │- │ЦПЭ нет, клетки, как в контроле │

│ │ 8 │ │ │ │

│ │2 х 10 │- │- │ЦПЭ нет, клетки, как в контроле │

└─────────┴─────────┴────┴────┴───────────────────────────────────────────┘

1.3. Оценка результатов

Результаты оценивают по степени ЦПЭ в ответ на дифференцирующие дозы.

Доза 2 х 10 вызывает гибель клеток при заражении только

высокоцитопатогенными ликворными менингококками. В ответ на заражение дозой

8 х 10 наблюдается разная степень ЦПЭ, соответственно которой выделены 3

группы штаммов нейссерий: высокоцитопатогенные (ВЦП), цитопатогенные (ЦП) и

ацитопатогенные (АЦП) (табл. 1). К ВЦП отнесены штаммы, вызывающие гибель

75 - 100% клеток монослоя через 24 - 48 ч после заражения дозой 8 х 10

(+++, ++++), к ЦП - гибель 25 - 50% клеток (+, ++), к АЦП - не вызывающие

гибель клеток (-). АЦП-штаммы менингококков могут давать ЦПЭ лишь в ответ

на дозу 16 х 10 (табл. 1). В таблице 2 приведен пример определения степени

цитопатогенности ряда штаммов менингококков по этой схеме.

Таблица 2

ПРИМЕР ОЦЕНКИ СТЕПЕНИ ЦИТОПАТОГЕННОСТИ ШТАММОВ

МЕНИНГОКОККОВ В ЗАВИСИМОСТИ ОТ ЦПЭ В ОТВЕТ

НА ДИФФЕРЕНЦИРУЮЩИЕ ДОЗЫ МИКРОБНОЙ ВЗВЕСИ

┌──────────────┬───────────────┬─────────────┬─────────┬─────────┐

│ Штаммы │ Концентрация │Доза микробн.│ ЦПЭ │Степень │

│менингококков,│микробн. взвеси│ взвеси ├────┬────┤цитопато-│

│ серогруппа │ │ │6 ч │24 ч│генности │

├──────────────┼───────────────┼─────────────┼────┼────┼─────────┤

│ │ │ 6 │ │ │ │

│C │40 ед. │16 х 10 │+ │++++│ │

│ 23252 │ │ 8 │ │ │ │

│ │20 ед. │8 х 10 │+ │++++│ВЦП │

│ │ │ 8 │ │ │ │

│ │5 ед. │2 х 10 │- │- │ │

│ │ │ 8 │ │ │ │

│A │40 ед. │16 х 10 │+ │++++│ │

│ 112 │ │ 8 │ │ │ │

│ │20 ед. │8 х 10 │- │+++ │ВЦП │

│ │ │ 8 │ │ │ │

│ │5 ед. │2 х 10 │- │- │ │

│ │ │ 8 │ │ │ │

│A │40 ед. │16 х 10 │- │+++ │ │

│ 138 │ │ 8 │ │ │ │

│ │20 ед. │8 х 10 │- │++ │ЦП │

│ │ │ 8 │ │ │ │

│ │5 ед. │2 х 10 │- │- │ │

│ │ │ 8 │ │ │ │

│A │40 ед. │16 х 10 │- │+++ │ │

│ 338 │ │ 8 │ │ │ │

│ │20 ед. │8 х 10 │- │+ │ЦП │

│ │ │ 8 │ │ │ │

│ │5 ед. │2 х 10 │- │- │ │

│ │ │ 8 │ │ │ │

│A │40 ед. │16 х 10 │- │++ │ │

│ 118 │ │ 8 │ │ │ │

│ │20 ед. │8 х 10 │- │- │АЦП │

│ │ │ 8 │ │ │ │

│ │5 ед. │2 х 10 │- │- │ │

│ │ │ 8 │ │ │ │

│B │40 ед. │16 х 10 │- │+ │ │

│ 258 │ │ 8 │ │ │ │

│ │20 ед. │8 х 10 │- │- │АЦП │

│ │ │ 8 │ │ │ │

│ │5 ед. │2 х 10 │- │- │ │

└──────────────┴───────────────┴─────────────┴────┴────┴─────────┘

Можно ускорить и повысить чувствительность теста, используя в опытах предварительно синхронизированные выдерживанием в рефрижераторе при +10 °С в течение 3-х часов клеточные культуры. После перенесения таких клеток в условия инкубации при 37 °С усиливается и синхронизируется их митотическая активность, что ускоряет развитие цитопатического эффекта при инфицировании вирулентными штаммами нейссерий. Заражение синхронизированных клеток и проведение опыта ведется, как описано выше, с несинхронизированной клеточной культурой. Чтение результатов проводят через 6 - 12 - 24 часа инкубации опытных и контрольных пробирок в термостате при 37 °С (табл. 3).

Таблица 3

ПРИМЕР ОЦЕНКИ СТЕПЕНИ ЦИТОПАТОГЕННОСТИ НЕЙССЕРИЙ

НА СИНХРОНИЗИРОВАННОЙ КУЛЬТУРЕ КЛЕТОК FL ПРИ ЗАРАЖЕНИИ

ДИФФЕРЕНЦИРУЮЩИМИ ДОЗАМИ МИКРОБНОЙ ВЗВЕСИ

┌──────────────┬────────────┬────────────┬─────────────┬─────────┐

│ Штаммы │Концентрация│ Доза │ ЦПЭ │Степень │

│менингококков,│ микробн. │ микробн. ├───┬────┬────┤цитопато-│

│ серогруппа │ взвеси │ взвеси │6 ч│12 ч│24 ч│генности │

├──────────────┼────────────┼────────────┼───┼────┼────┼─────────┤

│ │ │ 8 │ │ │ │ │

│C │40 ед. │16 х 10 │++ │+++ │++++│ВЦП │

│ 23252 │ │ 8 │ │ │ │ │

│ │20 ед. │8 х 10 │++ │+++ │++++│ │

│ │ │ 8 │ │ │ │ │

│ │5 ед. │2 х 10 │- │- │- │ │

│ │ │ 8 │ │ │ │ │

│A │40 ед. │16 х 10 │+ │++ │++++│ЦП │

│ 138 │ │ 8 │ │ │ │ │

│ │20 ед. │8 х 10 │+ │+ │+++ │ │

│ │ │ 8 │ │ │ │ │

│ │5 ед. │2 х 10 │- │- │- │ │

│ │ │ 8 │ │ │ │ │

│A │40 ед. │16 х 10 │- │+ │++ │АЦП │

│ 118 │ │ 8 │ │ │ │ │

│ │20 ед. │8 х 10 │- │- │- │ │

│ │ │ 8 │ │ │ │ │

│ │5 ед. │2 х 10 │- │- │- │ │

└──────────────┴────────────┴────────────┴───┴────┴────┴─────────┘

1.4. Постановка реакции нейтрализации

Специфичность ЦПЭ при заражении культуры клеток менингококками подтверждается реакцией нейтрализации с группоспецифическими противоменингококковыми сыворотками. При необходимости для контроля специфичности ЦПЭ ставится реакция нейтрализации с коммерческими специфическими сыворотками: сывороткой диагностической менингококковой группоспецифической агглютинирующей сухой (Ленинградского НИИВС или Ставропольского НИИВС), диагностической менингококковой преципитирующей группоспецифической сухой (Ставропольского НИИВС). Реакцию нейтрализации ставят следующим образом. Готовят смесь из равных объемов (по 1,0 мл) исследуемой суточной культуры менингококков известной серогруппы (микробная взвесь в концентрации 20 ед. на среде 199) с соответствующей группоспецифической сывороткой, предварительно разведенной средой 199 1:8 или 1:16. Смесь выдерживают 1 час при 37 °С, затем по 0,8 мл смеси вносят в 2 пробирки с клетками, предварительно освобожденные от ростовой среды, доливают в них по 0,2 мл среды 199 и помещают в термостат на 24 ч. При постановке опыта нейтрализации помимо контроля культуры клеток необходим контроль менингококковой сыворотки в рабочем разведении, которую вносят по 0,4 мл в две пробирки с клеточной культурой после удаления ростовой среды, затем добавляют поддерживающую среду до 1 мл. В пробирки с контролем культуры менингококка после удаления ростовой среды вносят 0,4 мл микробной взвеси в концентрации 20 ед. и 0,6 мл среды 199.

Через 24 ч инкубации в термостате в клеточных культурах, зараженных цитопатогенными штаммами (контроль культуры менингококка), наблюдается полная или частичная дегенерация при отсутствии дегенерации в опытных пробирках с нейтрализацией исследуемого штамма соответствующей группоспецифической сывороткой. В случае несоответствия серогрупп менингококка и сыворотки происходит лишь незначительное снижение степени дегенеративных изменений или эффект нейтрализации отсутствует. В пробирках с контролем клеток монослой сохраняется без изменений.

Учитывая циркуляцию среди населения значительного числа поли-, спонтанно- и неагглютинирующихся менингококков, реакцию нейтрализации следует проводить только со штаммами с установленной серогрупповой принадлежностью (после постановки в реакции агглютинации на стекле со специфическими менингококковыми сыворотками в соответствии с действующими инструкциями).

Следует подчеркнуть, что р. нейтрализации служит только для подтверждения специфичности ЦПЭ в качестве контроля к опыту проверки цитопатогенности штамма менингококка (для исключения неспецифического ЦПЭ). Поскольку тест на цитопатогенность для характеристики вирулентности исследуемых нейссерий проводится с чистой культурой идентифицированного штамма, то контроль специфичности ЦПЭ по реакции нейтрализации необязателен.

1.5. Определение степени цитопатогенности

испытуемых штаммов нейссерий по ЦПД

При необходимости более точной характеристики исследуемых штаммов

менингококков и других нейссерий по степени цитопатогенности проводят

титрование ряда доз микробной взвеси с двухкратным интервалом от 128 х 10

до 0,25 х 10 с учетом процента погибших клеток в ответ на каждую

испытуемую дозу. В качестве цитопатогенной дозы для характеристики степени

цитопатогенности исследуемых штаммов нейссерий наиболее приемлема ЦПД , то

есть доза, вызывающая гибель 50% клеток монослоя на 24 часа после

инфицирования. По результатам титрования изучаемых доз нейссерий (для

8 8

менингококков достаточны дозы от 16 х 10 до 0,25 х 10 ) производят расчет

ЦПД по Керберу по формуле (И.П. Ашмарин, А.А. Воробьев, 1962):

lg ЦПД = lg N - сигма (SUM L - 0,5),

50 i

где:

N - доза, дающая 100-процентную гибель клеток;

сигма - логарифм кратности разведений;

L - отношение числа погибших клеток от введения данной дозы микробной

взвеси к исходному числу клеток (т.е. доля погибших клеток);

i - порядковый номер дозы, начиная от наименьшей.

По нашим материалам, по степени цитопатогенности, выраженной в ЦПД ,

нейссерии можно подразделить на высокоцитопатогенные с ЦПД в пределах от

8 8 8 8

1 х 10 до 5 х 10 , цитопатогенные с ЦПД от 5,1 х 10 до 10 х 10 и

ацитопатогенные с ЦПД более 10,0 х 10 .

Пример. В таблице 4 приведены результаты титрования штамма менингококка

группы C N 1305 и штамма N. sicca N 253. Для штамма N 1305 доза N

соответствует дозе 2 х 10 , а lg N = 8,3010. Сумма величин L равна 1,625.

Подставив эти значения в формулу, получаем для штамма N 1305:

lg ЦПД = 8,3010 - 0,3 (1,625 - 0,5) = 7,9635,

ЦПД = anti lg 7,9635 = 0,92 х 10 микробных тел.

Оценка: штамм N 1305 - высокоцитопатогенный.

Аналогично для штамма N 253:

lg ЦПД = 10,1070 - 0,3 (2,0 - 0,5) = 9,6570,

ЦПД = anti lg 9,6570 = 45,3 х 10 микробных тел.

Оценка: штамм N 253 - ацитопатогенный.

Таблица 4

ПРИМЕР РАСЧЕТА ЦПД НЕЙССЕРИЙ

┌────────┬─────────┬───────────────────────┬─────────────────────┐

│ Дозы │ lg дозы │ N. meningitidis │ N. sicca N 253 │

│ 8 │ │ группы C N 1305 │ │

│(х 10 ) │ ├───────────┬───────────┼─────────┬───────────┤

│ │ │ % гибели │ L │% гибели │ L │

│ │ │ │ i │ │ i │

├────────┼─────────┼───────────┼───────────┼─────────┼───────────┤

│128 │10,1070 │100 │ │100 │1,0 │

│64 │9,8060 │100 │ │85,7 │0,875 │

│32 │9,5051 │100 │ │12,5 │0,125 │

│16 │9,2041 │100 │ │0 │0 │

│8 │8,9031 │100 │ │0 │ │

│4 │8,6021 │100 │ │0 │ │

│2 │8,3010 │100 │1,0 │0 │ │

│1 │8,0 │50 │0,5 │0 │ │

│0,5 │7,6990 │12,5 │0,125 │0 │ │

│0,25 │7,3979 │0 │0 │0 │ │

│ │SUM L │ │1,625 │ │2,0 │

│ │ i │ │ │ │ │

│ │lg ЦПД │ │7,9635 │ │9,6570 │

│ │ 50 │ │ │ │ │

│ │ │ │ 8 │ │ 8 │

│ │ЦПД │ │0,92 х 10 │ │45,3 х 10 │

│ │ 50 │ │ │ │ │

└────────┴─────────┴───────────┴───────────┴─────────┴───────────┘

Тест на цитопатогенность нейссерий рекомендуется для оценки вирулентности выделяемых штаммов наряду с прочими маркерами микробиологической характеристики менингококков в ходе эпидемиологического надзора за менингококковой инфекцией. Предложенный тест может быть использован в научно-исследовательских учреждениях, бактериологических лабораториях республиканских, областных санитарно-эпидемиологических станций, где имеются вирусологические отделения с лабораторией культур тканей.

2. МЕТОДИКА ОПРЕДЕЛЕНИЯ ВИРУЛЕНТНОСТИ НЕЙССЕРИЙ

НА КУРИНЫХ ЭМБРИОНАХ

2.1. Подготовка куриных эмбрионов к заражению

Для заражения берут 9 - 11-дневных эмбрионов кур породы "белый леггорн", просматривают с помощью овоскопа и простым карандашом отмечают границу воздушного мешка. Хорионаллантоисная оболочка (ХАО) развита неравномерно и более выражена на той стороне, где находится зародыш. На противоположной стороне большую часть занимает желточный мешок. На стороне, где ХАО хорошо развита, выбирают участок между кровеносными сосудами и отмечают карандашом место для пропиливания щели длиной 5 - 8 мм. Просмотренные и отмеченные таким образом яйца переносят в бокс. Для заражения на ХАО необходимы следующие инструменты и посуда: напильник (для вскрытия ампул), удобный для пропиливания щели в скорлупе, препаровальная игла или копье для прокалывания скорлупы, игла с загнутым концом для рассечения оболочки, резиновый баллончик для отсасывания воздуха, шприц с короткой иглой для введения культуры менингококков, анатомический глазной пинцет, стерильный парафин в пробирках, подставка для 1 - 2 яиц, спирт, 3-процентная йодная настойка.

Поверхность яйца над воздушным мешком и боковую поверхность с той стороны, где будет проводиться заражение, протирают кусочком стерильной ваты, смоченным в спирте, фламбируют и смазывают йодом. Затем препаровальной иглой или копьем прокалывают скорлупу над воздушной полостью. На отмеченном участке на боковой поверхности яйца напильником пропиливают в скорлупе щель длиной около 5 - 8 мм, не поранив лежащую под ней подскорлупную оболочку. Затем иглой, загнутой под прямым углом, осторожно надрывают подскорлупную оболочку таким образом, чтобы не ранить плотно прилегающую к ней ХАО. Для облегчения опускания ХАО вниз под давлением атмосферного воздуха лучше предварительно нанести на щель каплю физиологического раствора. О том, что произошло опускание ХАО, свидетельствует перемещение содержимого яйца, которое заполняет естественную воздушную полость, а также образование искусственной воздушной полости под щелью в скорлупе. Если ХАО не опускается, то с помощью маленького резинового баллончика медленно отсасывают воздух через отверстие естественного воздушного мешка, что способствует перемещению оболочки и содержимого яйца.

2.2. Подготовка испытуемой культуры нейссерий

и заражение эмбрионов

Непосредственно перед заражением 16 - 20-часовую культуру нейссерий с сывороточного агара Хоттингера смывают теплым (37°) физиологическим раствором (pH 7,2 - 7,4) и готовят 2 млрд. микробную взвесь, соответствующую 20 ед. оптического стандарта мутности ГИСК им. Л.А. Тарасевича. Через отверстие в скорлупе с помощью шприца 2 млрд. микробную взвесь нейссерий вводят на ХАО в объеме 0,1 мл. Таким образом, доза для одного эмбриона составляет 200 млн. микробных тел. Эта дифференцирующая доза вызывает патолого-анатомические изменения органов и тканей эмбрионов разной тяжести в зависимости от вирулентности испытуемого штамма. Для заражения одним штаммом менингококков берут 5 эмбрионов. Контрольной группе 5 эмбрионов на ХАО вводят по 0,1 мл стерильного физиологического раствора. Отверстие в скорлупе заливают стерильным парафином. Яйца кладут на подставку в горизонтальном положении так, чтобы искусственная воздушная полость была все время наверху, и переносят в термостат для инкубации при 37 °С в течение 24 - 48 ч.

2.3. Вскрытие зараженных эмбрионов и оценка результатов

Яйцо для вскрытия помещают в чашку Петри или на салфетку, смоченную дезинфицирующим раствором. Стерильными ножницами срезают скорлупу по границе естественного воздушного мешка, обнажая таким образом ХАО. Отмечают изменения сосудов ХАО на месте заражения. Затем ХАО вскрывают, с помощью пинцета извлекают эмбрион на чашку Петри, определяют его жизнеспособность по подвижности и наличие спастически сокращенных мышц нижних конечностей.

Для подтверждения специфичности развивающегося инфекционного процесса и наличия менингококковой бактериемии у эмбриона делают контрольные посевы и мазки-отпечатки из органов по ходу вскрытия, производимого асептически.

Осматривают кожу, регистрируя наличие гиперемии, цианоза, геморрагической сыпи, кровоизлияний в коже и по ходу крупных сосудов на шее и конечностях. При осмотре головы отмечают увеличение полушарий мозга за счет отека мозга, определяемого по вытеканию капли мутного красновато-желтого ликвора при проколе оболочек мозга бактериологической петлей или пастеровской пипеткой. Той же петлей или пипеткой делают посев ликвора на чашку сывороточного агара. Одновременно делают посев крови. После этого отсепаровывают кожу на голове и обнажают мягкую мозговую оболочку для выявления кровоизлияний в мозге. Затем вскрывают ножницами брюшную и грудную полости и определяют состояние внутренних органов: гиперемию, отек печени и почек, остановку сердца в систоле желудочков. Одновременно делают посевы и мазки-отпечатки из этих органов.

Тяжесть поражения эмбриона оценивают путем сравнения патолого-анатомических изменений органов и тканей опытных эмбрионов с состоянием их у контрольных эмбрионов. При вскрытии опытных эмбрионов, зараженных нейссериями, выявляется одна из четырех форм по тяжести инфекционного процесса: бессимптомная, легкая, средняя, тяжелая, в соответствии с чем определяется степень вирулентности испытуемого штамма нейссерий (таблица 5). Контрольные эмбрионы при вскрытии живые, с хорошо развитыми сосудами ХАО, кожные покровы их и внутренние органы без изменений.

Таблица 5

ВЫРАЖЕННОСТЬ МЕНИНГОКОККОВОЙ ИНФЕКЦИИ КУРИНЫХ ЭМБРИОНОВ

В ЗАВИСИМОСТИ ОТ ВИРУЛЕНТНОСТИ ВОЗБУДИТЕЛЯ

Тяжелая форма	Средняя форма	Легкая форма	Бессимптомная форма
Гибель всех эмбрионов к 24 ч. Увеличение размеров тела погибших КЭ, связанное с отеком органов и тканей. Кожа резко гиперемирована, с цианотичным оттенком, полиморф- ная, разной величины сыпь, непра- вильной формы геморрагии в коже и по ходу крупных сосудов на шее и ногах, тромбоз сосудов ХАО; отек головного мозга, вытекание мутной жидкости при проколе оболочек мозга бактериологической петлей, кровоизлияния в мозг; спастические сокращенные мышцы конечностей (поджатые лапы со сведенными паль- цами); отек и гиперемия печени и почек; остановка сердца в систоле желудочков. Высев менингококков из крови и органов	Погибшие эмбрионы с тромбированными сосудами ХАО. На фоне гиперемиро- ванной кожи видна поли- морфная геморрагическая сыпь; отек головного мозга, инъекция сосудов и кровоизлияния на оболочках мозга; отек и гиперемия печени и по- чек; сердце в состоянии систолы желудочков, предсердия заполнены темной кровью. Высев менингококков из крови и органов	Большинство эмбрионов живы. При вскрытии сосуды ХАО без изме- нений; кожа светлая с одиночными мелкото- чечными кровоизлияни- ями: инъекция и одиночные кровоизлия- ния сосудов головного мозга; внутренние органы без изменений. Высев менингококков из крови и органов погибших и выживших эмбрионов	Эмбрионы живы. По внешнему виду и состоянию органов эмбрионы не отличаются от контрольной группы; из крови и органов высе- ваются типичные по всем свойст- вам менингококки
Высоковирулентный штамм	Умеренно вирулентный штамм	Слабовирулентный штамм	Авирулентный штамм

Обработанный материал (тушки эмбрионов, содержимое яиц, инфицированную вату, марлевые салфетки и пр.) засыпают хлорамином на сутки. Инфицированную посуду и инструменты обеззараживают кипячением в 3-процентном мыльном растворе.

Пример оценки степени патогенности нейссерий на куриных эмбрионах (КЭ) приведен в таблице 6.

Таблица 6

ПРИМЕР ОЦЕНКИ ВИРУЛЕНТНОСТИ МЕНИНГОКОККОВ

ПО МОДИФИЦИРОВАННОМУ СПОСОБУ НА КУРИНЫХ ЭМБРИОНАХ

┌─────────────────────────────────────────────────────────────────────────────────────────────────────┐

│ Патолого-анатомические признаки менингококковой инфекции куриных эмбрионов │

├──────┬───────┬───────┬─────┬─────┬───────────────────┬──────┬──────┬──────┬──────┬────────┬─────────┤

│Штамм │Отноше-│Спасти-│Гипе-│Отек │ Кровоизлияния │Гипе- │Гипе- │Оста- │Высевы│ Форма │Оценка │

│менин-│ние по-│ческое │ремия│мозга├────┬────┬─────┬───┤ремия │ремия │новка │менин-│ МИ по │вирулент-│

│гокок-│гибших │сокра- │тушки│ │ в │ в │по │на │и отек│и отек│сердца│гокок-│тяжести │ности │

│ка │КЭ к │щение │ │ │мозг│кожу│ходу │ХАО│печени│почек │в сис-│ков │ │штамма │

│ │общему │мышц │ │ │ │ │сосу-│ │ │ │толе │ │ │ │

│ │числу │конеч- │ │ │ │ │дов │ │ │ │желу- │ │ │ │

│ │опытных│ностей │ │ │ │ │ │ │ │ │дочков│ │ │ │

├──────┼───────┼───────┼─────┼─────┼────┼────┼─────┼───┼──────┼──────┼──────┼──────┼────────┼─────────┤

│А-125 │0/5 │- │- │- │- │- │- │- │- │- │- │+/- │бессимп-│авиру- │

│ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │томная │лентный │

│М-20 │1/5 │- │- │+/- │+/- │+ │+ │- │- │- │+ │+ │легкая │слабови- │

│ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │рулентный│

│1469 │3/5 │- │+ │+ │+ │+ │+/- │- │+/- │+ │+/- │+ │средняя │умеренно │

│ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │вирулент-│

│ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ный │

│1298 │5/5 │+ │+ │+ │+ │+ │+ │+ │+ │+ │+ │+ │тяжелая │высокови-│

│ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │рулентный│

└──────┴───────┴───────┴─────┴─────┴────┴────┴─────┴───┴──────┴──────┴──────┴──────┴────────┴─────────┘

В случае изучения одного и того же штамма нейссерий на модели культуры клеток и на модели КЭ при сопоставлении результатов надо учитывать следующее. В связи с тем, что при оценке степени патогенности менингококков на КЭ используется 10 дифференциальных признаков патолого-анатомической картины, вызываемой изучаемым штаммом, удается выявить 4 степени поражения - тяжелая, средняя, легкая и бессимптомная формы инфекции. Соответственно им на куриных эмбрионах представляется возможным установить 4 степени вирулентности исследуемых штаммов нейссерий. На модели культуры клеток умеренно- и слабоцитопатогенные штаммы нейссерий дают обычно близкие результаты, поэтому они объединены в одну группу цитопатогенных штаммов, которые достоверно отличаются от высокоцитопатогенных и ацитопатогенных штаммов. Отсюда штаммы, оказавшиеся при испытании на КЭ умеренно- или слабовирулентными, соответствуют цитопатогенным штаммам по результатам оценки на клеточной модели, соответственно высоковирулентные на КЭ - высокоцитопатогенным, авирулентные - ацитопатогенным.

Способ определения степени вирулентности нейссерий на куриных эмбрионах рекомендуется для применения в научно-исследовательских учреждениях.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Рекомендуемые тесты для определения степени патогенности менингококков и других нейссерий пополняют ограниченный набор способов тестирования этой группы микроорганизмов. Тест на клеточной модели прост в исполнении, экономичен, может быть легко освоен и использован в научно-исследовательской работе и бактериологами крупных городских, областных, республиканских санитарно-эпидемиологических станций.

Показатель цитопатогенности дает объективную количественную характеристику биологической активности циркулирующих среди населения менингококков и других нейссерий и может быть полезен при оценке вирулентности выделяемых от больных и носителей штаммов менингококков в ходе эпидемиологического надзора за менингококковой инфекцией.

Тест оценки вирулентности на куриных эмбрионах, в отличие от общепринятых тестов на белых мышах, обладает тем преимуществом, что в значительной мере воспроизводит патолого-анатомические нарушения организма, характерные для генерализованной формы менингококковой инфекции.

Оба метода прошли апробацию в Казанском НИИ эпидемиологии и микробиологии, на кафедре микробиологии Удмуртского медицинского института.