Утверждаю

Заместитель начальника Главного

санитарно-эпидемиологического

управления Минздрава СССР

А.И.ЗАИЧЕНКО

10 июля 1987 г. N 4387-87

ИНСТРУКЦИЯ

ПО ОПРЕДЕЛЕНИЮ ВИТАМИНА C В ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТАХ

Разработана в Институте питания АМН СССР лабораторией витаминизации пищевых продуктов.

Метод визуального титрования витамина С является наиболее простым, доступным и широко используется как в нашей стране, так и за рубежом для определения этого витамина в пищевых продуктах, не содержащих естественных пигментов, мешающих визуальному установлению конца титрования.

Метод прошел широкую апробацию в различных лабораториях научных и практических учреждений (лаборатории пищевых отделов СЭС, кафедр гигиены питания медицинских институтов, лабораторий различных отраслей пищевой промышленности), одобрен Минздравом СССР и рекомендован для практического использования Междуведомственной комиссией по составлению "Таблиц химического состава пищевых продуктов".

Принцип метода

Метод основан на способности аскорбиновой кислоты (АК) окисляясь количественно восстанавливать 2,6-дихлорфенолиндофенолят натрия. АК экстрагируют раствором метафосфорной кислоты и титруют 2,6-дихлорфенолиндофенолятом натрия до установления светло-розовой окраски. Дегидроаскорбиновую кислоту в АК восстанавливают цистеином, для отделения АК от редуцирующих соединений, присутствующих в пищевых продуктах, подвергающихся тепловой обработке и длительно хранившихся, экстракты обрабатывают формальдегидом при определении pH.

Оборудование

Потенциометр; термостат водяной на 37 °С; весы лабораторные общего назначения с наибольшим пределом взвешивания 200 г, поверочной ценой деления не более 0,5 мг; весы лабораторные общего назначения с наибольшим пределом взвешивания 500 г, поверочной ценой деления не более 50 мг; гомогенизатор.

Посуда

Ступка с пестиком; воронки фильтровальные диаметром 5 - 7,5 см; колбы мерные вместимостью 100, 500 и 1000 куб. см; колбы конические вместимостью 50 и 100 куб. см; микробюретки на 2 куб. см с ценой деления 0,01 куб. см; пипетки градуированные на 1, 2, 5 и 10 куб. см; цилиндры мерные на 100 и 200 куб. см; стаканы на 50 и 100 куб. см.

Реактивы

1. Аскорбиновая кислота (Госфармакопея СССР, X изд., ст. 6).

2. 2,6-дихлорфенолиндофенолят натрия.

3. Калий фосфорнокислый двузамещенный.

4. Метафосфорная кислота.

5. Натрий уксуснокислый.

6. Серная кислота, ос.ч.

7. Уксусная кислота ледяная.

8. L-цистеин HCl.

9. Формальдегид 36 - 38%.

10. Этилендиаминтетрауксусная кислота.

11. Бумага фильтровальная.

Приготовление реактивов

    1. Раствор метафосфорной кислоты 6% и 3%.  Растирают в ступке 60 г HPO

                                                                          3

и  растворяют  в  940 куб. см  дистиллированной  воды  без нагревания.  При

стоянии  раствор  HPO   медленно  гидролизуется  до  H PO ,  поэтому свежий

                     3                                3  4

раствор  готовят  еженедельно.  3% раствор  HPO  готовят  в день проведения

анализа из 6% раствора.                        3

2. Стандартные растворы аскорбиновой кислоты (АК) с массовой концентрацией 1 мг/куб. см и 0,1 мг/куб. см. Растворяют 0,1000 г АК в мерной колбе на 100 куб. см в 3% растворе метафосфорной кислоты и доводят тем же раствором кислоты до метки (раствор с массовой концентрацией 1 мг/куб. см). Для приготовления раствора 0,1 мг/куб. см 10 куб. см раствора АК с концентрацией 1 мг/куб. см вносят в мерную колбу вместимостью 100 куб. см и доводят до метки 3% раствором метафосфорной кислоты. Растворы неустойчивы, их приготовляют непосредственно перед применением.

3. Раствор 2,6-дихлорфенолиндофенолята натрия 0,04%. Растворяют 0,2 г 2,6-дихлорфенолиндофенолята натрия в 300 куб. см горячей свежекипяченой (в течение 30 мин.) дистиллированной воды, фильтруют через складчатый фильтр в мерную колбу вместимостью 500 куб. см и промывают фильтр горячей водой. После охлаждения раствор доводят до метки охлажденной свежекипяченой дистиллированной водой. Срок годности раствора при хранении в холодильнике - не более 2 дней.

Установка титра раствора 2,6-дихлорфенолиндофенолята натрия: в две конические колбы наливают по 9 куб. см 3% раствора метафосфорной кислоты и по 1 куб. см раствора АК с массовой долей 0,1 мг/куб. см и быстро титруют раствором 2,6-дихлорфенолиндофенолята натрия до светло-розовой окраски, не исчезающей в течение 10 - 15 с. Таким же образом титруют 10 куб. см 3% раствора метафосфорной кислоты (контроль на реактивы). Поправку к титру раствора вычисляют по формуле:

                             Т = 0,10 / (V - V ),

                                              1

    где:

    0,10 - количество АК в 1,0 куб. см стандартного раствора, мг;

    V   -   объем   раствора  2,6-дихлорфенолиндофенола,   затраченный   на

титрование стандартного раствора АК, куб. см;

    V  -  объем  2,6-дихлорфенолиндофенола,  затраченный  на  титрование 3%

     1

раствора метафосфорной кислоты, куб. см.

4. Раствор L-цистеина HCl с массовой концентрацией 50 мг/куб. см. Раствор приготовляют в день применения.

5. Ацетатный буфер (рН - 4,0). Растворяют 49,8 г уксуснокислого натрия в 70 куб. см дистиллированной воды и, добавляя ледяную уксусную кислоту (около 100 куб. см), потенциометрически доводят рН до 4,0.

6. Раствор серной кислоты: к 50 куб. см дистиллированной воды осторожно добавляют 50 куб. см концентрированной серной кислоты.

7. Раствор этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) с массовой концентрацией 15%.

8. Раствор двузамещенного фосфорнокислого калия с массовой концентрацией 45%.

Ход определения

Интервал определяемых концентраций АК составляет 0,05 - 0,12 мг в объеме экстракта (от 1,0 до 10 куб. см), взятого на титрование. Величину навески продукта и последующее разведение рассчитывают исходя из интервала указанных концентраций.

    Навеску  исследуемого  материала,  взятую из  средней пробы (1 - 50 г в

зависимости   от  предполагаемого  количества  витамина  С),   помещают   в

фарфоровый  стакан,  в  который  налито  30  -  50  куб.  см  6%  HPO ,   и

                                                                     3

гомогенизируют  полученный   гомогенат,   включая   мякоть,   количественно

переносят  в  мерную  колбу или цилиндр вместимостью 100  -  200  куб.  см,

доводят  до  метки  3%  HPO , перемешивают и фильтруют через фильтровальную

                           3

бумагу. При анализе сухих продуктов гомогенат после измельчения  настаивают

в течение 10 -  15 мин.  При  определении  витамина  С  в  жидких  объектах

необходимое количество материала отсеивают  или  отмеряют  в  мерную  колбу

вместимостью 100 куб. см и доводят до метки 3% HPO .

                                                  3

    Экстрагирование  проводят быстро, полученные экстракты сразу используют

для анализа.

    При экстрагировании АК  из  продуктов,  расфасованных  в  металлическую

тару,  или из продуктов с высоким содержанием железа, навеску образца  (1 -

25 г) гомогенизируют в 6% раствора HPO , переносят в  цилиндр  вместимостью

                                      3

100 куб. см, этим же раствором кислоты  и  доводят  объем  до  50  куб. см,

перемешивают. Через  10 мин.  прибавляют  30  куб.  см ацетатного буферного

раствора и  10  куб.  см раствора ЭДТА, доводят до метки 3% раствором HPO ,

                                                                         3

перемешивают и фильтруют.

                              Определение АК

    В  две  конические  колбы вносят пипеткой от 1 до 10 куб. см экстракта,

доводят  объем  3%  раствором  HPO  до 10 куб. см и титруют раствором  2,6-

                                  3

дихлорфенолиндофенола  до  слабо-розового  окрашивания,  не  исчезающего  в

течение  10  -  15  с. Таким же образом титруют 10 куб. см 3% раствора HPO

                                                                          3

(контроль на реактивы - V ).

                         0

    При содержании в продукте редуцирующих соединений контрольное испытание

проводят  следующим  образом:  в  коническую  колбу помещают такой же объем

экстракта,  как при  определении АК, прибавляют равный ему объем ацетатного

буфера  и раствор  формальдегида в объеме, равном половине объема буферного

раствора,  перемешивают,  закрывают  колбу  пробкой, оставляют на 10 мин. и

титруют раствором 2,6-дихлорфенолиндофенола (V ).

                                              0

    Массовую долю АК в мг на 100 г продукта вычисляют по формуле:

                          Т х (V - V ) х V  х 100

                                    0     1

                      Х = -----------------------,                      (1)

                                  V  х а

                                   2

    где:

    Т - титр раствора 2,6-дихлорфенолиндофенола;

    V  - объем  2,6-дихлорфенолиндофенола, израсходованного  на  титрование

испытуемого раствора (среднее из двух параллельных определений), куб. см;

    V   -  объем  раствора  2,6-дихлорфенолиндофенола,  израсходованного на

     0

титрование при контрольном испытании, куб. см;

    V  -  общий объем экстракта, полученный при экстрагировании пробы, куб.

     1

см;

    V  - объем экстракта, взятый на титрование, куб. см;

     2

    а - масса навески, г;

    100 - пересчет на 100 г продукта.

Вычисление проводят до первого десятичного знака. За конечный результат принимают среднее арифметическое двух параллельных определений. Расхождение между двумя параллельными определениями не должно превышать 5% от среднего арифметического значения.

Определение общего содержания витамина С (аскорбиновая

кислота + дегидроаскорбиновая кислота) (АК + ДАК)

    В   коническую   колбу   наливают   2  -  20  куб.  см  экстракта  (для

проведения двух параллельных определений) (V ), доводят pH  до  7,2  -  7,4

                                            3

(потенциометрически)    45%   раствором   двузамещенного    фосфорнокислого

калия,  добавляют   раствор   цистеина   в  таком  количестве,  чтобы   его

массовая концентрация  приблизительно  в  300 раз превышала  предполагаемое

содержание ДАК,  и  ставят  колбу  в термостат  при температуре 37 °С на 30

мин. Массовую долю цистеина  в мг,  добавляемую  к  экстракту, рассчитывают

по формуле:

                       К х а х V  х 300   К х а х V  х 3

                                3                  3

                   Х = ---------------- = --------------,               (2)

                           100 х V              V

                                  1              1

    где:

    К - массовая концентрация АК в продукте,  определенная по  формуле (1),

мг на 100 г продукта;

    V  - объем  экстракта,  взятый  на восстановление  ДАК  в АК,  куб. см;

     3

остальные обозначения те же, что в формуле (1).

    После  термостатирования   раствор   быстро   охлаждают   до  комнатной

температуры, доводят  потенциометрически  рН  раствора до 0 - 0,5 раствором

серной  кислоты  и  измеряют  объем  (V ). К  части  раствора  (с примерной

                                       4

массовой   концентрацией  АК  0,1  мг)  (V )  прибавляют  формальдегид   до

                                          2

получения  массовой  доли  3%,  закрывают  колбу  пробкой  и  через  8 мин.

титруют раствором  2,6-дихлорфенолиндофенола до слабо-розового окрашивания,

не исчезающего в течение 10 - 15 с.

    Массовую долю витамина С в мг на 100 г продукта вычисляют по формуле:

                        Т х V х V  х V  х 100

                                 1    4

                    Х = ---------------------,                          (3)

                             V  х V  х а

                              2    3

    где:

    V  - объем раствора после доведения рН до 0 - 0,5, куб. см;

     4

    остальные обозначения те же, что в формулах (1) и (2).

Вычисление проводят до первого десятичного знака. За результат принимают среднее арифметическое двух параллельных определений. Расхождение между двумя параллельными определениями не должно превышать 8% от среднего арифметического значения.