"Методические рекомендации по лабораторной диагностике легионеллеза (болезни легионеров)" // Технорма.RU

Утверждаю

Начальник Главного управления

карантинных инфекций

Минздрава СССР

В.П.СЕРГИЕВ

30 июня 1987 г. N 28-6/20

МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

ПО ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКЕ ЛЕГИОНЕЛЛЕЗА

(БОЛЕЗНИ ЛЕГИОНЕРОВ)

Методические рекомендации подготовлены сотрудниками Научно-исследовательского института эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи АМН СССР.

ВВЕДЕНИЕ

За более чем 10-летний период, прошедший со времени регистрации первой вспышки легионеллеза в июле 1976 г. в Филадельфии (США), многочисленные вспышки и спорадические случаи данного заболевания зарегистрированы в различных странах Европы и Америки. С 1979 года легионеллезная инфекция выявляется в СССР.

Аэрогенный путь заражения, тяжесть течения легионеллезной инфекции, высокая смертность (до 20%), широкое распространение возбудителя во внешней среде, особенно в индустриальных регионах требует разработки современных методов диагностики этой инфекции.

В Методических рекомендациях изложен комплекс серологических, бактериологических и экспресс-методов, совокупность которых обеспечивает быстроту и надежность постановки диагноза легионеллеза и является необходимой для проведения сероэпидемиологических обследований при эпидемиологической оценке территории страны в отношении распространения легионеллеза. Методические рекомендации предназначены для врачей-бактериологов противочумных станций и институтов, отделов особо опасных инфекций краевых, республиканских и областных СЭС, осуществляющих эпиднадзор за возбудителем легионеллеза в соответствии с Приказами Минздрава СССР N 1019 от 03.09.1984, N 1657 от 27.12.85.

I. СЕРОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ

1. Реакция непрямой иммунофлюоресценции (РИФ)

Наиболее широкое применение при диагностике легионеллеза нашел метод непрямой иммунофлюоресценции (РИФ). РИФ в непрямом варианте может быть рекомендован как основной серологический метод для определения антител в сыворотке крови людей с подозрением на легионеллез. Реакция иммунофлюоресценции является высокоспецифичной и достаточно чувствительной.

Техника постановки

На чистое обезжиренное предметное стекло наносят 3 отдельных небольших

капли легионеллезного антигена. В качестве антигена используют убитую

кипячением 2-суточную культуру L. pneumophila, выращенную на

угольно-дрожжевом агаре, содержащем L-цистеин (0,4 г/л) и пирофосфат

железа, растворимый (0,25 г/л) в атмосфере 5-процентного CO . В работе

используют антиген L. pneumophila штамм Philadelphia 1 в рабочем разведении

(40 бактериальных клеток в поле зрения в фазоконтрастном микроскопе). После

подсушивания антигена на воздухе в течение 10 - 15 минут препарат фиксируют

в ацетоне 15 минут и снова подсушивают в течение 2 - 3 минут на воздухе при

комнатной температуре. После фиксации препарата, антиген на стороне мазков

следует обвести стеклографом, что в дальнейшем препятствует слиянию капель

сыворотки в различных разведениях. Стекла с антигеном помещают во влажную

камеру (чашка Петри с увлажненной фильтровальной бумагой на дне) и

препараты с антигеном обрабатывают сывороткой больных в разведениях 1:32,

1:64, 1:128. Первое разведение сыворотки 1:8 делают в 0,5-процентном

растворе яичного желтка в забуференном физрастворе (pH - 7,2), последующие

двукратные разведения сыворотки проводят в забуференном физрастворе.

Препарат антигена с сывороткой инкубируют 30 минут при 37 °С во влажной

камере, после чего промывают 5 - 10 минут фосфатным буфером (ФСБ) pH = 7,2,

дистиллированной водой и высушивают на воздухе. Далее препарат обрабатывают

люминесцирующей сывороткой против глобулинов человека, взятой в рабочем

разведении. Инкубируют 30 минут при 37 °С во влажной камере, промывают 5 -

10 минут в ФСБ pH = 7,2, споласкивают дистиллированной водой, высушивают на

воздухе и наносят среду с глицерином, покрывают покровным стеклом. Такой

препарат готов для просмотра в люминесцентном микроскопе. При постановке

реакции иммунофлюоресценции необходимо делать положительный контроль

(антиген с положительной кроличьей легионеллезной сывороткой) и

отрицательный контроль (антиген с нормальной сывороткой).

Учет и оценка реакции

Препарат микроскопируют в падающем свете люминесцентного микроскопа ЛЮМАМ. Для микроскопии используют иммерсионный объектив 90 х (1,25) и окуляр 5 х 7 и нефлюоресцирующее иммерсионное масло.

В положительных случаях, т.е. когда исследуемая сыворотка содержит специфические антитела, после обработки данного препарата люминесцирующей сывороткой против глобулинов человека, выявляется специфическое яркое зелено-желтое свечение бактерий на темном фоне препарата. При специфической флюоресценции удается обнаружить более яркое свечение периферии бактериальной клетки и более слабое в ее центральной части. Для оценки интенсивности специфического свечения используют четырехкрестовую систему:

++++ - яркие сверкающие изумрудно-зеленые клетки, люминесцирующие по периферии, четко контрастирующие с темным телом клетки;

+++ - умеренная изумрудно-зеленая люминесценция периферии клетки;

++ - зеленое свечение всей клетки;

+ - едва заметная зеленая люминесценция всей клетки.

Положительным результатом считают флюоресценцию, оцениваемую на "++++" и "+++". За титр исследуемой сыворотки принимают последнее разведение, которое обеспечивает бактериальной клетке специфическое свечение, оцениваемое на "++++" и "+++". Разведение сыворотки, при котором отмечается слабое свечение бактериальной клетки, оцениваемое на "++" и "+", не учитывают.

Положительный контроль (препарат антигена с положительной кроличьей легионеллезной сывороткой) должен давать яркое специфическое свечение легионелл, в отрицательном контроле (препарат легионеллезный антиген с нормальной кроличьей сывороткой) свечение отсутствует полностью.

Большинство больных легионеллезом имеют выраженную сероконверсию с нарастанием титров антител в 4 - 128 раз в сыворотках реконвалесцентов, по сравнению с первой сывороткой, полученной в острый период заболевания. В случаях, когда проанализировать динамику изменения не представляется возможным, диагноз ставится по высокому уровню специфических антител (титр не менее 1:64). Появление специфических антител у отдельных больных может происходить уже к 6 - 7 дню от начала заболевания. Титры быстро возрастают на 2 - 3 неделе, достигая максимальных значений к 5 неделе от начала заболевания. В последующие месяцы титры уменьшаются. Необходимо учитывать возможность выявления перекрестных реакций сыворотки больных легионеллезом в РИФ с антигенами пситтакоза и лихорадки КУ. Однако титр антител в реакции с гомологичной культурой обычно бывает выше, чем с гетерологичной, что является основой для дифференциальной диагностики.

2. Реакция иммуноферментного анализа (ИФА)

Иммуноферментный анализ также применяется для специфического выявления легионеллезных антител в сыворотке больных.

Техника постановки реакции

В лунки полистиролового планшета вносят по 100 мкл растворимого антигена L. pneumophila в концентрации 1 - 10 мкг/мл в фосфатносолевом буфере (ФСБ) pH = 7,2. Планшеты инкубируют при температуре 37 °С в течение 2 часов или в течение 18 часов при +4 °С. Затем планшеты трижды отмывают в ФСБ с 0,05% твина 20, просушивают. В лунки сенсибилизированных планшетов вносят последовательно двукратные разведения исследуемых сывороток (или крови) в объеме 100 мкл. Разведения сывороток делают на ФСБ с 0,05% твина 20. Начальное разведение сывороток 1:100. Инкубация 1 час при 37 °С. Затем планшеты трижды отмывают по 5 минут ФСБ с 0,05% твина 20.

В лунки отмытого планшета вносят конъюгат в рабочем разведении в объеме

100 мкл (кроличьи иммуноглобулины к сывороточным глобулинам человека с

пероксидазой хрена производства НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи). Конъюгат разводят

тем же буфером с твином 20. После 1-часовой инкубации при 37 °С лунки

планшета тщательно отмывают от непрореагированного конъюгата. Затем в

лунки планшета вносят по 100 мкл свежеприготовленного

субстрат-индикаторного раствора, содержащего 0,04% О-фенилен-диамина в 0,1

М цитратно-фосфатном буфере pH = 6,0 в присутствии 0,006% H O . Инкубируют

2 2

30 минут в темноте при комнатной температуре. Реакцию останавливают равным

объемом 1 н раствора серной кислоты.

Учет результатов

Интенсивность окрашивания определяют визуально или спектрофотометрически при длине волны 492 нм. Результаты исследования считают положительными, если титр исследованной сыворотки превосходит титр отрицательного контроля более чем на 2 разведения при визуальном учете результатов реакции или оптическая плотность (ОП) исследованной сыворотки более чем в 2 раза превышает показания ОП отрицательного контроля при фотометрическом учете.

За положительные результаты принимают те сыворотки, которые давали титры к L. pneumophila 1:400 и выше.

II. БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ

Возбудитель редко удается выделить от больного. Для исследования берут материал бронхоскопии, плевральную жидкость, легочный экссудат. Описаны единичные случаи выделения возбудителя из мокроты, крови. Значительно чаще выделяют возбудитель из секционного материала (легочной ткани). При бактериологическом исследовании на легионеллез применяют посев на специальные питательные среды и биологическую пробу на чувствительных животных.

1. Посев на питательные среды

Возбудитель легионеллеза не растет на обычных питательных средах, в том числе очень богатых (мясо-пептонный агар, агар Хоттингера, триптически-соевый агар, среды на сердечно-мозговом экстракте и др.).

На шоколадном и кровяном агаре возможен слабый рост микроба в первой генерации при массовых посевах культуры.

Выделение возбудителя от больных проводят на специальных питательных средах, применяемых для культивирования легионелл с обязательным добавлением L-цистеина и растворимого пирофосфата железа. Наибольшее распространение получила угольно-дрожжевая среда. Хорошие результаты получены при замене дрожжевого экстракта на сернокислый гидролизат рыбокостной муки. При этом концентрация добавляемого в среду L-цистеина снижается в 2 раза. Для предотвращения пророста посторонней микрофлоры при исследовании контаминированного материала к среде добавляют антибиотики (полимиксин В 40 ед./мл + пенициллин 0,5 мкг/мл + амфотерицин Б 80 мкг/мл).

При подготовке к высеву жидкие образцы разводят 1:10 фосфатным буфером (pH - 7,2). Высевают разведенный и цельный образец в количестве 0,2 мл. При исследовании секционного материала кусочек ткани массой 1 г растирают в стерильной ступке пестиком и готовят 10-процентную суспензию ткани в фосфатном буфере (pH - 7,2). Приготовленную суспензию разводят 1:50 тем же буфером и высевают на среды.

Рост колоний из клинического материала наблюдается не ранее чем через 4 - 5 суток. Максимальное количество видимых колоний обычно вырастает на 8 - 10 сутки. При подозрении на рост легионелл колонии пересевают на ту же среду и на среду, не поддерживающую рост легионелл (контрольную среду). В качестве контрольной среды обычно используют агар Хоттингера или триптический соевый агар. Рост колоний во втором пассаже на угольно-дрожжевой или рыбно-костной среде при отсутствии роста на контрольной среде с большой долей вероятности позволяет заподозрить легионеллез и указывает на необходимость дальнейшей идентификации.

С целью получения чистой культуры возбудителя легионеллеза от биопробных морских свинок рекомендуется производить посев селезенки биопробного животного одновременно на 3 чашки со следующими средами:

1. Угольно-дрожжевой агар.

2. Угольно-дрожжевой агар с антибиотиками.

3. Агар Хоттингера.

Угольно-дрожжевая среда может быть заменена на рыбно-костную среду. При гибели животного от легионеллеза посев должен быть положительным на первых двух чашках. При гибели от другой инфекции рост возбудителя будет отмечаться на 1-ой и 3-ей чашке и отсутствовать во 2-ой.

Угольно-дрожжевая среда: дрожжевой экстракт - 10 г, активированный

уголь - 2 г, L-цистеин - 0,4 г, пирофосфат железа растворимый - 0,25 г,

K HPO - 0,85 г, K H PO - 1,0 г, агар - 17 г, дист. H O - 980 мл.

2 4 1 2 4 2

Все компоненты среды, кроме L-цистеина и пирофосфата железа, добавляют к 980 мл дист. воды, растворяют, доводят до кипения и автоклавируют 15 минут при температуре 121 °С. Среду охлаждают до 50 °С и добавляют свежеприготовленные растворы L-цистеина (0,4 г в 10 мл дист. воды) и пирофосфата железа (0,25 г в 10 мл дист. воды), профильтрованные через мембранные фильтры (с диаметром пор. 0,45 мкм). pH среды доводят до 6,9 при 50 °С добавлением 1 н KOH или 1 н HCl. Среду быстро разливают, слегка взбалтывая флакон для равномерного распределения активированного угля.

Разлитую среду можно хранить в чашках, помещенных в пластиковые или металлические контейнеры, в течение 2-х недель.

Рыбо-костная среда: готовится так же, как и угольно-дрожжевая, за исключением того, что в качестве питательной основы вместо дрожжевого экстракта используется сернокислый гидролизат рыбной кормовой муки - 10 г. Количество L-цистеина, добавляемого в среду, снижается до 0,2 г.

2. Биологическая проба

Биологическая проба является чувствительным методом обнаружения

легионелл в исследуемом материале. Для биологической пробы используют

морских свинок весом 250 - 300 г, которые заболевают и гибнут от

легионеллезной инфекции при внутрибрюшинном заражении суспензией,

3 4

содержащей 10 - 10 клеток бактерий. Через 12 - 48 часов у морских свинок

возникает лихорадочное заболевание с подъемом температуры до 39,5 - 41 °С,

прострацией и поражением глаз. При массивном заражении исследуемого

материала морские свинки гибнут на 3 - 4 сутки; при меньшей

инфицированности материала гибель затягивается до 5 - 8 суток. Срок

наблюдения за животными до 10 дней.

В большинстве случаев животные погибают от легионеллеза с характерными патологическими изменениями. При вскрытии обнаруживается перитонит со скудным фибринозным экссудатом, резкая гиперемия париетальной брюшины с инъекцией сосудов. Печень и селезенка увеличены с фибринозным налетом на капсуле. В селезенке встречаются мелкие очаги некроза. Наиболее характерным следует считать развитие пневмонии без резко выраженного инфильтративного воспалительного процесса, некробиоз септальных клеточных элементов, нередко с некрозом альвеолярных перегородок и без поражения крупных сосудов. Характерны также набухание и десквамация мезотелия плевры.

В мазках-отпечатках из селезенки и легких при окраске по Романовскому - Гимза обнаруживают, как правило, значительное количество легионелл, а при посеве на угольно-дрожжевой агар десятипроцентной суспензии селезенки морских свинок в 0,05 М фосфатном буфере (pH = 7,0) через 48 - 72 часа появляется рост культуры. Если в отпечатках из органов присутствует малое число клеток возбудителя (5 клеток в поле зрения микроскопа), то посев на среды может быть отрицательным. В этом случае рекомендуется ввести 10-процентную суспензию селезенки морских свинок в желточные мешки 5-, 6-дневных куриных эмбрионов в количестве 0,3 - 0,4 мл. Желточные мешки куриных эмбрионов, погибших на 4 - 6 день после заражения (на 1 - 3 сутки эмбрионы погибают от посторонней микрофлоры), содержат значительное количество возбудителя (50 - 100 клеток в поле зрения микроскопа), выявляемого окраской по Романовскому - Гимза или прямой иммунофлюоресценцией.

3. Идентификация возбудителя

Предварительную идентификацию легионелл осуществляют на основании морфологии и окраски бактерий в мазках по Граму (Легионелла - грамотрицательная палочка длиной 2 - 3 мк, иногда до 10 мк), специфического свечения в реакции прямой иммунофлюоресценции, а также отсутствия роста на контрольных средах. Окончательная идентификация в настоящее время возможна только в референс-центре - НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи (с помощью биохимических тестов, газово-жидкостной хроматографии и гибридизации ДНК).

III. МЕТОДЫ ЭКСПРЕСС-ДИАГНОСТИКИ

Серологическая диагностика не позволяет окончательно подтвердить диагноз ранее 2 недель от начала болезни. Выделение культуры L. pneumophila также длительно во времени и сопряжено с определенными трудностями. Среди методов экспресс-диагностики наибольшее распространение получила прямая иммунофлюоресценция. Иммуноферментный метод и коагглютинации значительно расширяют возможности лабораторной диагностики легионеллеза, т.к. включают широкий спектр исследуемого материала (моча, мокрота) и сокращают время анализа.

1. Реакция прямой иммунофлюоресценции

Метод прямой флюоресценции - наиболее распространенный метод для быстрого определения легионеллезного антигена. Этот метод обладает высокой специфичностью и чувствительностью. Прямой иммунофлюоресцентный метод позволяет обнаружить возбудитель L. pneumophila в отпечатках из свежих и замороженных кусочков легких, в гистологических срезах, плевральном экссудате, мокроте, материале бронхоскопии, а также при идентификации выделенных культур.

Техника приготовления препаратов

На предметное стекло наносят каплю исследуемого материала (или делают отпечаток органов) и делают тонкий мазок, т.к. в слишком густом мазке не удается отметить свечение отдельных клеток. Препарат подсушивают на воздухе при комнатной температуре и фиксируют в ацетоне в течение 15 минут. Границу исследуемого материала, нанесенного на предметное стекло, отмечают стеклографом с обратной стороны препарата. Препараты хранят при +4 °С до обработки люминесцирующей сывороткой.

Техника постановки реакции

На поверхность фиксированного и высушенного мазка, помещенного во влажную камеру (чашки Петри с кусочком смоченной в воде фильтровальной бумаги), наносят каплю "рабочего разведения" легионеллезной люминесцирующей сыворотки. Окраску препарата производят 20 минут при температуре 37 °С. Затем мазки промывают 10 - 15 минут в фосфатном буфере pH = 7,2, дистиллированной водой, высушивают на воздухе, наносят глицериновую среду, покрывают покровным стеклом и просматривают в люминесцентном микроскопе.

"Рабочее разведение" люминесцирующей сыворотки рекомендуется готовить по мере надобности.

Учет и оценка результатов

Мазки микроскопируют в падающем свете люминесцентного микроскопа ЛЮМАМ. Для микроскопа используют иммерсионный объектив 90 х (1,25) и окуляры 5 х 7 и нефлюоресцирующее иммерсионное масло. Для получения яркого свечения бактерий необходимо тщательно центрировать осветительную систему микроскопа и подбирать соответствующие светофильтры. Наличие в препарате клеток бактерий следует контролировать с помощью фазово-контрастного устройства.

В положительных случаях после обработки данного препарата специфической легионеллезной люминесцирующей сывороткой в люминесцентном микроскопе обнаруживается специфическое изумрудно-зеленое свечение легионеллезных бактерий.

Степень яркости люминесценции бактерий, "окрашенных" люминесцирующими антителами, принято обозначать в крестах (см. выше). Специфическим считается свечение с яркостью "++++" и "+++", свечение с яркостью "++" и "+" принято считать неспецифическим. Обнаружение светящегося ореола хотя бы у 3 - 5 клеток в каждом поле зрения свидетельствует о наличии в исследуемом материале L. pneumophila.

Отрицательный результат свидетельствует об отсутствии микроорганизма или о содержании в исследуемом материале в низкой концентрации, не выявляемой иммунофлюоресцентным методом при прямом исследовании без подращивания или обогащения.

При исследовании различных препаратов необходимо иметь в качестве контроля мазок, приготовленный из 500 млн. взвеси легионеллезных бактерий, обработанных люминесцирующей сывороткой.

Несмотря на то, что "рабочее разведение" сыворотки указано на этикетке ампулы, для каждой сыворотки его следует устанавливать опытным путем, т.к. оно может меняться в зависимости от конкретных условий микроскопирования препаратов.

С этой целью в ряде пробирок делают кратные (1:2, 1:4, 1:8 и т.д.) разведения люминесцирующей сыворотки, используя при этом физиологический раствор pH = 7,2. Каждым разведением сыворотки обрабатывают заранее приготовленный, фиксированный и подсушенный препарат с мазком из 500 млн. взвеси легионеллезных бактерий. Дальнейшая обработка препаратов идет по ранее описанной (для прямого варианта РИФ) методике. "Рабочим разведением" сыворотки считается то наибольшее разведение, при котором выявляется специфическое сверкающее зелено-желтое свечение бактериальной клетки на темном фоне препарата.

2. Реакция иммуноферментного анализа (ИФА)

для определения легионеллезного антигена

Реакция иммуноферментного анализа (ИФА) позволяет определить легионеллезный антиген в клиническом материале (моча, мокрота, бронхиальные смывы) при экспериментальных и клинических исследованиях.

Техника постановки реакции

В лунки полистироловых планшетов вносят по 100 мкл легионеллезных

иммуноглобулинов в концентрации 20 - 30 мкг/мл в карбонат-бикарбонатном

буфере (КББ) pH = 9,5. Планшеты инкубируют при температуре 37 °С в течение

2 часов или в течение 18 часов при +4 °С. Затем планшеты трижды отмывают

ФСБ с 0,05% твина 20, просушивают. В лунки сенсибилизированных планшетов

вносят разведения исследуемого материала (антигена) в объеме 100 мкл.

Разведения антигена делают на ФСБ с 0,05% твина 20. Инкубация 1 час при 37

°С. Затем планшеты трижды отмывают по 5 минут ФСБ с 0,05% твина 20. В лунки

отмытого планшета вносят конъюгат (легионеллезные иммуноглобулины с

ферментом пероксидазы хрена). Конъюгат разводят тем же буфером с твином 20

("рабочее разведение" конъюгата указано на этикетке). После 1-часовой

инкубации при 37 °С лунки планшета тщательно отмывают от

непрореагировавшего конъюгата. Затем в лунки планшета вносят по 100 мкл

свежеприготовленного субстрат-индикаторного раствора, содержащего 0,04%

О-фенилендиамина в 0,1 М цитратно-фасфатном буфере pH = 6,0 и присутствии

0,006% H O . Инкубируют 30 минут в темноте при комнатной температуре.

2 2

Реакцию останавливают равным объемом 1 н раствора серной кислоты.

Учет результатов

Реакцию учитывают визуально или фотометрически по изменению окраски субстрата в опытных лунках. Появление желто-оранжевого окрашивания в лунках с антигенсодержащими пробами при его отсутствии в контрольных отрицательных пробах свидетельствует о положительной реакции. При фотометрическом учете результатов при 492 нм проба считается положительной, если ОП опыта в 2 раза и более превышает ОП контроля. В качестве отрицательных контролей обязательны контроль субстрата и контроль сорбции конъюгата.

Специфичность анализа подтверждается реакцией торможения, избытком легионеллезных антител и реакцией с гетерологичными антигенами грамотрицательных бактерий.

3. Реакция коагглютинации

Реакция коагглютинации (РКА) является чувствительным и специфичным методом для определения антигенов бактерий в пробах различного происхождения.

В качестве исследуемого материала может служить моча, слюна, экстракт из биопсийного или аутопсийного материала, суспензии органов животных, выделенные штаммы бактерий.

Техника постановки

Для приготовления стафилококкового реагента используют культуру золотистого стафилококка Cowan 1, выращенную в течение 18 часов на агаре, содержащем перевар Хоттингера (1,5 г аминного азота в 1 л). Стафилококки смывают фосфатно-солевым буфером (ФСБ) pH = 7,2 и центрифугируют при 2000 об./мин. в течение 30 минут. Из осадка готовят 10-процентную взвесь, к которой добавляют 0,5-процентный раствор формальдегида, встряхивают в течение 2 час. при температуре 37 °С и трижды отмывают ФСБ при центрифугировании. Осадок ресуспендируют в ФСБ до получения 10% взвеси с 0,1-процентным раствором азида натрия. При необходимости вместо приготовления препарата по описанной методике можно использовать коммерческий стафилококковый реагент, содержащий белок А сухой производства НИИЭМ им. Пастера, г. Ленинград.

Для приготовления 10 мл коагглютинирующего диагностикума смешивают 100 мкл разведения специфической сыворотки в ФСБ (разведение подбирают экспериментально в реакции коагглютинации. Для этого в качестве исследуемого образца используют разведения известного антигена. Рабочее разведение сыворотки соответствует максимальному титру сыворотки, не снижающему чувствительности реакции) с 1 мл 10-процентной взвеси стафилококкового реагента. После встряхивания при комнатной, температуре в течение 10 - 15 мин. объем доводят до 10 мл ФСБ.

Постановку реакции осуществляют на полистироловых планшетах для иммунологических реакций (U-образные лунки).

Испытуемую пробу раститровывают двукратно в ФСБ петлями на аппарате Такачи или микропипетками в объеме 50 мкл в два ряда лунок. В один ряд добавляют в каждую лунку по 25 мкл стафилококкового коагглютинирующего диагностикума, в другой ряд 1-процентную взвесь стафилококкового реагента (контроль). Планшеты тщательно встряхивают и помещают во влажную камеру при температуре 37 °С на 2 часа, затем - на 10 - 15 часов при комнатной температуре.

Учет результатов

++++ - агглютинат заполняет всю лунку;

+++ - агглютинат заполняет более 50% лунки;

++ - агглютинат заполняет менее 50% лунки;

+ - агглютинат образует узкую зону по окружности осадка, стафилококковый осадок на дне лунки перемещается при изменении положения планшета.

- отсутствие агглютината, стафилококковый осадок перемещается при изменении положения планшета.

За положительный результат принимают пробы с разницей в титрах между рядом лунок с диагностикумом и контрольным, реагирующих на "+" не менее четырех.

РКА используют для определения видоспецифического белкового антигена (токсина) легионелл и группоспецифического липополисахаридного антигена. В процессе приготовления диагностикума необходимо использовать соответствующую сыворотку (к токсину или группо-специфическому антигену). Проведение РКА в том и другом случае идентично, за исключением того, что при определении липополисахаридного антигена для разрушения перекрестно реагирующих антигенов легионелл образцы необходимо прогреть при 100 °С - 10 минут.

IV. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Выявление спорадических и групповых случаев легионеллезной инфекции, изучение иммуноструктуры населения свидетельствует о заметном распространении данного заболевания на территории нашей страны. Относительно слабая изученность возбудителя и отсутствие практического опыта работы с ним большинства врачей-бактериологов обуславливают особую тщательность исследований при диагностике легионеллеза и осторожность при постановке окончательного диагноза. В настоящее время на практике используют три основные группы методов лабораторной диагностики:

1. Серологический анализ.

2. Бактериологические методы.

3. Обнаружение возбудителя и его антигенов экспресс-методами.

Серологические методы, прежде всего непрямая иммунофлюоресценция и РПГА, получили наибольшее распространение для диагностики легионеллеза в связи с их простотой, оснащенностью необходимым оборудованием и реактивами для реакций практических лабораторий; доступностью материала для исследований. Нарастание диагностических титров к возбудителю легионеллеза в любых 2-х из 3-х рекомендуемых серологических реакций с высокой степенью надежности подтверждает диагноз. К недостаткам метода относится ретроспективный характер диагностики в связи с необходимостью отбора 2-й сыворотки на 2 - 3-ю неделю заболевания.

Бактериологические методы, безусловно, являются главными для окончательного ответа о наличии вспышки легионеллезной инфекции. Однако применение их на практике требует специальной подготовки персонала. Выделение культуры и ее предварительная идентификация занимает не менее 10 - 14 дней.

Частота выделения культуры из материала аутопсии и бронхоскопии по сравнению с прямой иммунофлюоресценцией этих же образцов не превышает 40%. Работа с материалом, зараженным или подозрительным на зараженность возбудителем легионеллеза, проводится на основании "Инструкции о противоэпидемическом режиме работы с материалом, зараженным или подозрительным на зараженность возбудителями инфекционных заболеваний 1 - 2 групп" (Саратов, 1979 г.). В связи с вышеуказанным эффективность применения бактериологических методов на практике пока не велика.

Из высокочувствительных и специфичных методов экспресс-диагностики наибольшее распространение получила прямая иммунофлюоресценция. Однако спектр исследуемого материала тот же, что и при выделении культуры, редко позволяет поставить диагноз в первые дни заболевания. Иммуноферментный метод и коагглютинация позволяет обнаружить легионеллезный антиген в моче больных уже на 3 - 5 день болезни. Внедрение данных экспресс-методов позволит значительно ускорить постановку диагноза и своевременно начать этиотропную терапию. При вспышках легионеллеза необходимо сопоставление результатов лабораторной диагностики с клинико-эпидемиологическими данными. Антигены для серологической диагностики легионеллеза предоставляются по запросам учреждений противочумной системы, санитарно-эпидемиологической службы, опорных баз центров экологического и серологического контроля инфекционной заболеваемости на территории СССР. Выпуск диагностикумов для экспресс-диагностики легионеллеза запланирован на предприятии по производству бакпрепаратов НИИЭМ им Н.Ф. Гамалеи АМН СССР с 1988 года. Материал от больных с подозрением на легионеллез и неидентифицированные легионеллезные штаммы могут быть направлены в НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи АМН СССР для подтверждения диагноза по следующему адресу: 123098, Москва, ул. Гамалеи, 18, Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи АМН СССР.

Приложение N 1

СБОР И ТРАНСПОРТИРОВКА МАТЕРИАЛА ОТ БОЛЬНЫХ ЛЕГИОНЕЛЛЕЗОМ

1. Сбор сывороток

Для получения сыворотки у больных берут в стерильные пробирки кровь из вены в количестве 3 - 5 мл в первые дни и на 14 - 21 день болезни (не ранее 10 дня). После свертывания крови, сгусток отслаивается от стекла стерильной пастеровской пипеткой и помещают на 12 - 16 часов при 4 °С при комнатной температуре. Отделившуюся сыворотку отсасывают в стерильную пробирку и запаивают в ампулы, и хранят при +4 °С.

2. Мочу больных на 3 - 7 день болезни в количестве 3 - 5 мл собирают в стерильную пробирку, плотно закрытую резиновой пробкой, и помещают для кратковременного хранения при +4 °С. Для длительного хранения материал замораживают.

3. Плевральный экссудат, материал бронхоскопии, полученный стерильно до 10-го дня болезни в количестве от 0,5 до 5 мл, помещают в стерильную пробирку, плотно закрытую резиновой пробкой, и хранят при +4°С.

4. При сборе секционного материала образцы пораженных участков легочной ткани, печени и селезенки (по 2 - 3 кусочка размером 1 х 1 см) вырезают обработанными 70-процентным спиртом и прожженными в пламени спиртовки инструментами, помещают в стерильные пробирки или флаконы, плотно закрывают резиновыми пробками.

Поверхность пробирок и флаконов обрабатывают дезинфицирующим раствором (70-процентный спирт, 1-процентный формалин, 2-процентный хлорамин). Транспортировку материалов осуществляют в жестяных коробках с крышками или металлических биксах в возможно короткие сроки. Для кратковременного хранения материал помещают при +4 °С. Длительное хранение материала (до 1 года) возможно лишь при температуре -70 °С.

Приложение N 2

1. Приготовление фосфатно-солевого буфера (ФСБ).

40 мл основного раствора (27,4 г/л NaH PO , 7,87 г/л NaH PO ) смешивают

2 4 2 4

с 8,5 г NaCl, добавляют дистиллированной воды до 1 л, проверяют pH, которая

должна быть 7,2, стерилизуют при 120 °С в течение 20 минут.

2. Приготовление 0,5-процентной среды яичного желтка.

Берут стерильной пипеткой 10 мл содержимого желточного мешка свежего куриного яйца и суспендируют их в 100 мл фосфатного буфера, добавляют 0,05% азида натрия, полученный 10х раствор хранят при +4 °С.

Для приготовления рабочего 0,5-процентного раствора 10-процентный раствор разводят фосфатным буфером pH - 7,2 в 20 раз.

3. Среда с глицерином.

Берут 9 частей глицерина и 1 часть фосфатно-буферного раствора рН =

8,5. Фосфатно-буферный раствор делают путем соединения 10 частей раствора

N 1 и 1 части раствора N 2. Раствор N 1 делают путем соединения K HPO -

2 4

1,161 г, NaCl - 0,85 г и H O - 100 мл. Раствор N 2 делают путем соединения

KH PO - 0,907 г, NaCl - 0,85 г и H O - 100 мл.

2 2

4. Карбонат - бикарбонатный буфер 0,05 моль/л pH = 9,5 (буфер присоединения).

Буфер делают путем соединения.

NaHCO - 0,24 г, Na CO - 0,7 г и 200 мл H O.

3 2 3 2

5. Буфер цитратный 0,1 моль/л, pH = 5,5 (буфер для субстрата).

Буфер делают путем соединения лимонной кислоты 0,234 г, Na HPO х 12

2 4

H O - 0,9 г, H O - 62,5 мл, добавить 0,3 мл 3-процентной перекиси водорода.

2 2

6. Субстрат - индикаторный раствор.

25 мг ортофенилендиамина растворить в 62,5 мл 0,1 моль/л цитратного буфера pH = 5,5. Непосредственно перед использованием, после растворения ортофенилендиамина добавить 0,3 мл 3-процентной перекиси.

Приложение N 3

СПИСОК НЕОБХОДИМОГО ЛАБОРАТОРНОГО ОБОРУДОВАНИЯ

1. Термостат 37 °С.

2. Холодильник +4 °С.

3. Потенциометр.

4. Микроскоп люминесцентный.

5. Весы технические.

6. Весы аналитические.

7. Автоматические пипетки-дозаторы.

8. Дистиллятор.

9. Планшеты для иммунологических реакций Ленинградского завода "Медполимер", ТУ 64-2-278-79.

10. Предметные стекла.

11. Петли для титрования.

СПИСОК ИССЛЕДУЕМЫХ РЕАКТИВОВ

┌───┬───────────────────────────────────────┬─────────────────┬───────────┐

│ N │ Наименование реактивов │ N ГОСТа или ТУ │ Примечание│

│п/п│ │ │ │

├───┼───────────────────────────────────────┼─────────────────┼───────────┤

│1. │Натрий хлористый │ГОСТ 4233-77, хч │ │

│2. │Натрий фосфорнокислый однозамещенный │ГОСТ 245-76, чда │ │

│3. │Натрий фосфорнокислый двузамещенный │ГОСТ 4172-76, хч │ │

│4. │Натрий углекислый │ГОСТ 83-79, чда │ │

│5. │Натрий двууглекислый │ГОСТ 4201-79, чда│ │

│6. │Серная кислота │ГОСТ 4204-77, ч │ │

│7. │Ацетон │ТУ 2603-79, чда │ │

│8. │Твин 20 │ │ │

│9. │Ортофенилендиамин │ТУ 609-691-76 │г. Харьков │

│10.│Бычий сывороточный альбумин (БСА) │ТУ 60910-342-75 │Бел. НИИЭМ │

│11.│Пергидроль 30-процентный │ГОСТ 10929-76, хч│ │

│12.│Глицерин │ГОСТ 6259-75 │ │

│13.│Лимонная кислота │3652-69 │ │

└───┴───────────────────────────────────────┴─────────────────┴───────────┘

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ ДИАГНОСТИКУМОВ

1. Люминесцирующая сыворотка против глобулинов человека сухая кроличья производства НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи, г. Москва.

2. Антитела диагностические против иммуноглобулинов человека, меченные пероксидазой, сухие, производства НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи, г. Москва.

3. Тест-система иммуноферментная для определения легионеллезного антигена производства НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи с 1988 г.

4. Иммуноглобулины легионеллезные диагностические люминесцирующие производства НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи с 1989 г.

5. Антиген корпускулярный L. pneumophila 1, 2, 3 серотипа, опытно-экспериментальные серии НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи (отпускается по заказам лабораторий, занимающихся диагностикой легионеллеза. Образец заявки имеется в Приложении).

6. Стафилококковый реагент, содержащий белок А, сухой, производства НИИЭМ им. Пастера, г. Ленинград.

Приложение N 4

НАПРАВЛЕНИЕ

___________________________________________________________________________

(название лечебно-профилактического учреждения)

просит исследовать от больных _____________________________________________

(наименование образцов)

и идентифицировать выделенные штаммы ______________________________________

(откуда выделены штаммы)

для подтверждения диагноза легионеллезной инфекции. Предварительный диагноз

установлен на основании ___________________________________________________

(метод диагностики, результаты диагностики)

Подпись

ЗАЯВКА

на легионеллезный диагностикум

___________________________________________________________________________

(название лечебно-профилактического учреждения)

просит предоставить антиген для серологической диагностики легионеллеза

в реакции _______________ в количестве _____ ампул для анализа _____ проб.

Подпись