Утверждены

Минздравом СССР

8 июня 1987 г. N 4345

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

ПО ОПРЕДЕЛЕНИЮ БАЗАГРАНА В РЫБЕ

МЕТОДОМ ТОНКОСЛОЙНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ

Краткая характеристика препарата дана в Методических указаниях. ДСД 0,002 мг/кг.

    Принцип  метода.  Метод  основан  на  извлечении  базаграна из

измельченной  мышечной  ткани  рыбы  органическими растворителями,

очистке  экстракта  и  хроматографировании в тонком слое пластинок

"Силуфол"   УФ   .   Подвижной  фазой  служит  смесь  органических

              254

растворителей.  Проявление  хроматограмм  можно  осуществить двумя

способами:  1  -  термическое разложение базаграна, диазотирование

нитритом   натрия   в   солянокислой   среде,  азосочетание  солей

фенилдиазония  с  1-нафтолом;  2  - активация базаграна УФ-светом,

хлорирование и взаимодействие с о-толидином.

Метрологическая характеристика метода. Минимально детектируемое количество 1 мкг. Нижний предел определения 0,05 мг/кг. Среднее значение определения 95%. Стандартное отклонение +/- 2,5%. Доверительный интервал среднего при p = 0,95 и n = 5 +/- 4,9%.

Избирательность метода. Определению базаграна не мешают арезин, диурон, линурон, монурон, пропанид, солан, фалоран, применяемые на зерновых культурах.

    Реактивы  и  растворы.  Ацетон  х.ч.  Бензол  х.ч.  Гексан  ч.

Этиловый спирт 96-процентный.  Перманганат калия.  Хлороводородная

кислота х.ч.  Сульфат натрия безводный. Пластинки "Силуфол"  УФ

                                                               254

размером 150 x 150 мм. Силикагель АСК. о-Толидин ч. Хлороформ х.ч.

Этилацетат х.ч. Нитрит  натрия х.ч. Диэтиловый эфир (для наркоза).

Фармакопея  СССР.  Стандартный   раствор  базаграна  в  ацетоне  с

содержанием 100 мкг/мл. Проявляющие   реагенты:   N  1  (к  смеси,

состоящей из 46 мл дистиллированной воды и 4 мл  концентрированной

хлороводородной кислоты, прибавляют  1  г нитрита  натрия); N 2 (в

50 мл дистиллированной воды растворяют 3 г едкого кали, прибавляют

0,5  г  1-нафтола);   N  3 -  насыщенный  раствор   о-толидина   в

этилацетате.  В  холодильнике  растворы  хранятся  продолжительное

время.

Приборы, посуда. Ротационный вакуумный испаритель. Водяная баня. Воронки: Бюхнера на 50, 100 мл; делительные на 100, 250, 500 мл. Камера для опрыскивания. Камера для хроматографирования. Колбы: мерные на 50, 100 мл; конические на 100, 250, 500 мл. Лампа ртутно-кварцевая ОКН-11. Микрошприц на 10 мкл. Пластинки стеклянные размером 15 x 15 или 20 x 20 см. Пипетки различной вместимости. Прибор для встряхивания. Цилиндры мерные на 10, 25, 50, 100, 250, 500 мл. Гомогенизатор или измельчитель тканей. Пульверизаторы стеклянные. Стеклянная хроматографическая колонка (диаметр x высота) 20 x 400 мм.

    Подготовка  к  определению.  Подготовка  пластинок.  Пластинки

"Силуфол"  УФ    активируют при температуре 130 - 140 °C 20 мин. в

             254

сушильном шкафу. Подготовка хроматографических колонок для очистки

экстрактов  от примесей. В нижнюю часть хроматографической колонки

размером  20 - 400 мм помещают 500 мг ваты, обезжиренной гексаном.

Затем  засыпают  в  колонку  силикагель  АСК  (70  мл) и уплотняют

силикагель  постукиванием  по  колонке.  Колонку  промывают  50 мл

н-гексана   или   петролейного   эфира   и   прошедший  через  нее

растворитель  отбрасывают.  После этого колонка готова для очистки

экстрактов из проб рыбы.

Ход анализа. Экстракция. Ткани подвергают деструкции, затем 20 г гомогената заливают в конической колбе с притертой пробкой диэтиловым эфиром (ацетоном, хлороформом или этилацетатом). Экстракцию базаграна проводят трижды в течение 1,5 ч при встряхивании порциями по 50 мл растворителя. Экстракты объединяют и фильтруют через воронку с бумажным фильтром, заполненным на 2/3 безводным сульфатом натрия. Растворитель отгоняют и испаряют на водяной бане при температуре 60 °C.

Сухой остаток растворяют в 10 мл ацетона и вносят его в колонку с силикагелем АСК. После впитывания экстракта в сорбент пестицид элюируют 110 мл смеси бензола с гексаном в соотношении 3:8 пропорциями по 25 - 30 мл. Через 10 мин. после впитывания последней порции растворителя сорбент отжимают с помощью груши. Элюат отгоняют или испаряют.

    Хроматографирование.  Сухой остаток после очистки экстрактов и

испарения растворителя растворяют 0,3 мл ацетона. В зависимости от

количества  базаграна  в  пробе  на  пластинку  наносят  либо весь

раствор,  либо  аликвотную  его  часть. Пробу наносят на пластинку

"Силуфол"  УФ     с  помощью  шприца или пипетки в одну точку так,

             254

чтобы  диаметр  пятна не превышал 1 см. Справа и слева от пробы на

расстоянии 2 см наносят стандартные растворы, содержащие близкие к

определяемому  количества  базаграна  (2;  5; 10 мкг). Пластинку с

нанесенным раствором помещают в камеру для хроматографирования, на

дно  которой  за 30 мин. наливают подвижный растворитель: гексан -

ацетон (1:1), гексан - ацетон (1:3) или хлороформ - этиловый спирт

(9:1).  После  того  как  фронт растворителя поднимается на 10 см,

пластинку  вынимают  из  камеры и оставляют на несколько минут для

испарения растворителя.

Для обнаружения базаграна на пластинках "Силуфол" можно использовать два альтернативных способа:

1. Пластинку помещают в сушильный шкаф, нагретый до 180 °C, и выдерживают 30 - 40 мин. Извлеченные из шкафа пластинки после охлаждения опрыскивают проявляющим реагентом N 1 и затем N 2. При наличии базаграна появляются пятна красного цвета.

    2.   После   высушивания  пластинки  на  воздухе  ее  облучают

УФ-светом 20 - 25 мин., затем помещают в камеру, насыщенную парами

хлора.  Для  получения  паров  хлора  на  дно  эксикатора наливают

насыщенный  водный  раствор  перманганата  калия  и такой же объем

концентрированной  хлороводородной  кислоты.  Через  10  - 15 мин.

пластинку  вынимают,  оставляют  на  воздухе  15 мин. для удаления

избытка  хлора и затем опрыскивают насыщенным раствором о-толидина

в  этилацетате. Базагран обнаруживается в виде сиренево-фиолетовых

пятен  на  светлом фоне с R  0,52 в системе гексан - ацетон (1:1),

                           f

0,75  -  в  системе  гексан  -  ацетон  (1:3)  и  0,57 - в системе

хлороформ - этиловый спирт (9:1).

Обработка результатов анализа. Количественно препарат определяют путем сравнения площади пятен. Измеряют площади с помощью миллиметровой бумаги. Пропорциональная зависимость между площадью пятна и концентрацией препарата наблюдается в интервале 1 - 10 мкг препарата.

Содержание базаграна в анализируемой пробе (X, мг/кг) рассчитывают по формуле:

                                 AS

                                   2

                             X = ---,

                                 PS

                                   1

    где:

    A - количество базаграна в стандартном растворе, мкг;

    S ,  S  - площади пятен соответственно стандартного раствора и

     1    2

пробы, кв. мм;

    P - масса исследуемой пробы, г.

Требования безопасности. Соблюдаются требования безопасности, обычно рекомендуемые для работы с органическими растворителями. При работе с кварцевой лампой необходимо пользоваться светозащитными очками.