"Методические указания по определению гетерофоса, этафоса и их метаболитов в биологическом материале, молоке, яйцах методом газожидкостной хроматографии" // Технорма.RU

Утверждены

Минздравом СССР

8 июня 1987 г. N 4339-87

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

ПО ОПРЕДЕЛЕНИЮ ГЕТЕРОФОСА, ЭТАФОСА И ИХ МЕТАБОЛИТОВ

В БИОЛОГИЧЕСКОМ МАТЕРИАЛЕ, МОЛОКЕ, ЯЙЦАХ МЕТОДОМ

ГАЗОЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ

Краткая характеристика препаратов. Характеристики гетерофоса, этафоса приведены в Унифицированной методике.

Характеристика метаболитов этафоса и гетерофоса приведена в таблице 28.

Таблица 28

ХАРАКТЕРИСТИКА МЕТАБОЛИТОВ ГЕТЕРОФОСА И ЭТАФОСА

┌───────────────────────┬─────────────────────┬──────────────┬────────────┐

│ Химическое название │ Структурная формула │Брутто-формула│Молекулярная│

│ │ │ │ масса │

├───────────────────────┼─────────────────────┼──────────────┼────────────┤

│O-Этил-O-фенилфосфат │C H O O │C H O P │202 │

│ │ 2 5 \ ││ │ 8 11 4 │ │

│ │ P -OH │ │ │

│ │ / │ │ │

│ │C H O │ │ │

│ │ 6 5 │ │ │

│ │ │ │ │

│O-Этил-S-пропилфосфат │C H O O │C H O PS │184 │

│ │ 2 5 \ ││ │ 5 13 3 │ │

│ │ P -SC H │ │ │

│ │ / 3 7 │ │ │

│ │ HO │ │ │

│ │ │ │ │

│O-Этил-O-фенил-S- │C H O O │C H O PS │232 │

│метилтиофосфат │ 2 5 \ ││ │ 9 13 3 │ │

│ │ P -SCH │ │ │

│ │ / 3 │ │ │

│ │C H O │ │ │

│ │ 6 5 │ │ │

│ │ │ │ │

│O-Этил-O-фенилтиофосфат│C H O O │C H O PS │218 │

│ │ 2 5 \ ││ │ 8 11 3 │ │

│ │ P -SH │ │ │

│ │ / │ │ │

│ │C H O │ │ │

│ │ 6 5 │ │ │

│ │ │ │ │

│O-Этил-0,2,4-дихлор- │ C H O O │C H O Cl PS │251,5 │

│фенилтиофосфат │ 2 5 \ ││ │ 8 9 3 2 │ │

│ │ P -SH │ │ │

│ │ / │ │ │

│ │2,4Cl C H O │ │ │

│ │ 2 6 3 │ │ │

│ │ │ │ │

│O-Метил-O-фенил-S- │ CH O O │C H O PS │246 │

│пропилтиофосфат │ 3 \ ││ │ 10 15 3 │ │

│ │ P -SC H │ │ │

│ │ / 3 7 │ │ │

│ │C H O │ │ │

│ │ 6 5 │ │ │

│ │ │ │ │

│O-Этил-O-метил-S- │C H O O │C H O PS │198 │

│пропилтиофосфат │ 2 5 \ ││ │ 6 15 3 │ │

│ │ P -SC H │ │ │

│ │ / 3 7 │ │ │

│ │ CH O │ │ │

│ │ 3 │ │ │

│ │ │ │ │

│O,O-Диметил-S-пропил- │ O │C H O PS │184 │

│тиофосфат │ ││ │ 5 13 3 │ │

│ │(CH O) P -SC H │ │ │

│ │ 3 2 3 7 │ │ │

│ │ │ │ │

│O-Этил-O-метилтиофосфат│C H O O │C H O PS │156 │

│ │ 2 5 \ ││ │ 3 9 3 │ │

│ │ P -SH │ │ │

│ │ / │ │ │

│ │ CH O │ │ │

│ │ 3 │ │ │

│ │ │ │ │

│O,O-Диметилтиофосфат │ O │C H O PS │142 │

│ │ ││ │ 2 7 3 │ │

│ │(CH O) P -SH │ │ │

│ │ 3 2 │ │ │

└───────────────────────┴─────────────────────┴──────────────┴────────────┘

Принцип метода. Методика основана на определении S-пропильных ФОП (гетерофоса, этафоса и десяти их метаболитов) методом ГЖХ. Указанные соединения извлекают из субстратов смесью ацетона и 0,1 н HCl (9:1), гетерофос из молока и яиц извлекают смесью ацетона с этанолом (3:1). Экстракты очищают перераспределением в системе жидкость - жидкость.

Определение методом ГЖХ проводят на хроматографе, снабженном ТИД и ДПР. Используют неподвижные фазы SE-30 на хроматоне N-AW-HMDS и 3% OV-101 на инертоне-супер. Для разделения пестицидов и их метаболитов определение проводят в изотермическом режиме при двух температурах - 190 и 127 °C.

Метрологическая характеристика метода приведена в таблице 29.

Таблица 29

МЕТРОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА

МЕТОДА ОПРЕДЕЛЕНИЯ ГЕТЕРОФОСА, ЭТАФОСА И ИХ МЕТАБОЛИТОВ

┌────────────────────┬─────────┬─────────────────┬────────┬───────┬────────────┐

│ Вещество │Исследуе-│ Нижний предел │Среднее │Относи-│Доверитель- │

│ │мый │ обнаружения, │значение│тельное│ный интервал│

│ │объект │ мг/кг │опреде- │стан- │среднего при│

│ │ │ │ления, %│дартное│p = 0,95, │

│ │ │ │ │откло- │n = 5, +/- %│

│ │ │ │ │нение │ │

├────────────────────┼─────────┼─────────────────┼────────┼───────┼────────────┤

│Гетерофос │Молоко │0,002 │70 │6,7 │8,3 │

│-"- │Яйца │0,002 │65 │6,3 │7,8 │

│-"- │Биологи- │0,001 - 0,01 <**>│79 │8,3 │10,3 │

│ │ческие │ │ │ │ │

│ │субстраты│ │ │ │ │

│ │<*> │ │ │ │ │

│Этафос │То же │0,005 - 0,05 │83 │12,2 │15,1 │

│Метаболиты │ │ │ │ │ │

│O-Этил-O-фенилфосфат│-"- │0,001 - 0,01 │74 │13,5 │16,8 │

│O-Этил-S-пропил- │-"- │0,005 - 0,05 │79 │13,6 │16,9 │

│тиофосфат │ │ │ │ │ │

│O-Этил-O-фенил-S- │-"- │0,005 - 0,05 │81 │8,1 │10,1 │

│метилтиофосфат │ │ │ │ │ │

│O-Этил-O-фенилтио- │-"- │0,05 - 0,5 │70 │3,8 │4,7 │

│фосфат │ │ │ │ │ │

│O-Этил-0-2,4-ди- │-"- │0,01 - 0,1 │74 │11,1 │13,7 │

│хлорфенилтиофосфат │ │ │ │ │ │

│O-Метил-O-фенил-S- │-"- │0,01 - 0,1 │78 │4,3 │5,3 │

│пропилтиофосфат │ │ │ │ │ │

│O-Этил-O-метил-S- │-"- │0,01 - 0,1 │84 │10 │12,4 │

│пропилтиофосфат │ │ │ │ │ │

│O,O-Диметил-S- │-"- │0,005 - 0,05 │80 │5,5 │6,8 │

│пропилтиофосфат │ │ │ │ │ │

│O-Этил-O-метилтио- │-"- │0,05 - 0,5 │81 │10,9 │13,5 │

│фосфат │ │ │ │ │ │

│O,O-Диметилтиофосфат│-"- │0,05 - 0,5 │78 │13,8 │17,1 │

└────────────────────┴─────────┴─────────────────┴────────┴───────┴────────────┘

--------------------------------

<*> Расчет проведен суммарно для различных органов (печень, почки, мозг и др.).

<**> Приведены нижние пределы обнаружения в исследуемых объектах в зависимости от взятой навески (2 - 20 г).

Избирательность метода. Определению могут мешать ФОП, имеющие близкие времена удерживания.

Реактивы и растворы. Ацетон ч. Хлороводородная кислота ч., 0,1 н водный раствор. н-Гексан ч., х.ч. Спирт этиловый, ректиф. Сульфат натрия безводный свежеприготовленный. Вода дистиллированная.

Неподвижная фаза - 5% SE-30 на хроматоне N-AW-HMDS (0,16 -

0,20 мм), 3% OV-101 на инертоне-супер (0,16 - 0,20 мм). Азот

особой чистоты, содержание O не более 0,003%. Водород. Основные

стандартные растворы гетерофоса, этафоса и их метаболитов в

н-гексане по 1000 мкг/мл. Хранят в холодильнике 6 мес. Рабочие

стандартные растворы гетерофоса, этафоса и метаболитов в н-гексане

по 10 мкг/мл. Хранят в холодильнике в течение двух недель. Готовят

серию стандартных растворов.

Приборы и посуда. Газовый хроматограф с ТИД и ДЭЗ марки "Цвет", "Газохром" и др. Микроизмельчитель тканей РТ-2 или мясорубка. Прибор для отгонки растворителей (ротационный вакуумный испаритель) типа ИР-1М. Микрошприцы на 10 мкл (МШ-10). Колбы: конические со шлифом и пробками вместимостью 100, 250 и 500 мл; круглодонные со шлифом для отгонки растворителей; мерные вместимостью 50 и 100 мл. Делительные воронки на 50, 100 и 250 мл. Воронки химические. Пробирки мерные со шлифом вместимостью 5 и 10 мл. Пипетки на 1, 5 и 10 мл. Микропипетки на 0,1 мл.

Подготовка к определению. Для проведения клинических исследований на содержание гетерофоса и этафоса отбирают 100 мл суточной мочи, 2 мл крови.

Подготовка хроматографической колонки для ГЖХ. Колонку заполняют общепринятым в хроматографии способом, кондиционируют 48 ч при температуре на 20 °C выше рабочей температуры колонки.

Ход анализа. Экстракция и очистка экстракта. Исследуемые органы и ткани (печень, почки, селезенка, легкие, головной мозг, мясо) измельчают в микроизмельчителе тканей или мясорубке. Отбирают 2 - 20 г средней пробы (для пищевых продуктов навеска 20 г), заливают в зависимости от взятой навески 15 - 250 мл смеси ацетона с 0,1 н хлороводородной кислотой (9:1) и оставляют на 1 ч, периодически перемешивая пробу стеклянной палочкой и встряхивая. Затем растворитель сливают в делительную воронку, фильтруя через вату. Заливают пробу новой порцией смеси и экстрагируют еще 30 мин. Экстракты объединяют. Пробу промывают смесью дважды порциями по 5 - 10 мл и смывы присоединяют к экстракту. В делительную воронку приливают 50 мл дистиллированной воды, перемешивают и добавляют 50 мл н-гексана. Осторожно встряхивают в течение 5 мин. Отделяют верхний н-гексановый слой, сливая его через безводный сульфат натрия (7 - 10 г), насыпанный на фильтр, вложенный в воронку. Из нижнего водного слоя экстрагируют ФОП н-гексаном еще два раза порциями по 40 мл, объединяя экстракты с первым. Упаривают экстракт на ротационном вакуумном испарителе при температуре бани 40 - 45 °C примерно до 1 мл. Переносят остаток в мерную пробирку со шлифом, ополаскивая колбу небольшими порциями (по 0,3 - 0,4 мл) н-гексана. Доводят объем в пробирке н-гексаном точно до 2 мл, перемешивают и аликвоту хроматографируют.

К 2 - 5 мл цельной крови, собранной в стаканы вместимостью 50 - 100 мл, прибавляют при непрерывном перемешивании стеклянной палочкой безводный сульфат натрия до образования сухой массы (20 г). Затем приливают 30 - 40 мл диэтилового эфира и 10 мин. перемешивают пробу с эфиром. Сливают эфир в колбу для отгонки растворителей, фильтруя через фильтр "красная лента". Экстракцию повторяют еще раз. Эфирные экстракты объединяют, упаривают на ротационном испарителе при температуре бани 20 - 25 °C до объема 1 - 2 мл. Остаток упаривают досуха при комнатной температуре. К сухому остатку в колбе прибавляют 1 мл н-гексана и аликвоту хроматографируют.

Пробу мочи (20 мл) переносят в делительную воронку, разбавляют 20 мл дистиллированной воды, перемешивают и прибавляют 20 мл диэтилового эфира. Осторожно встряхивают 5 мин. и дают отстояться. Отделяют верхний эфирный слой, сливая его через безводный сульфат натрия. Операцию экстрагирования повторяют дважды. Объединенные экстракты переносят в колбу для отгонки растворителей и далее поступают так же, как при экстракции из крови.

Из 10 г (мл) средней пробы молока, яиц, органов и тканей гетерофос извлекают 50 мл смеси ацетона с этанолом (3:1). Экстрагируют при встряхивании в течение 20 мин., после чего экстракты помещают в морозильную камеру холодильника на 1 ч. Пробы фильтруют через бумажный фильтр в колбы для отгонки либо в фарфоровые чашки, промывают посуду и фильтр 20 мл экстрагирующей смеси. Фильтрат концентрируют под вакуумом на ротационном испарителе (температура бани 40 °C) или упаривают в фарфоровых чашках на водяной бане при температуре 40 °C в слабом токе теплого воздуха до объема 1 - 2 мл. Остатки фильтруют через бумажный фильтр в делительные воронки. Колбы для отгонки или фарфоровые чашки тщательно ополаскивают 10 мл смеси этанола с водой (1:3), фильтруют в те же делительные воронки, добавляют 25 мл дистиллированной воды и встряхивают 0,5 - 1 мин. Из водно-спиртового раствора гетерофос трижды экстрагируют гексаном порциями по 30 мл в течение 2 - 3 мин. при встряхивании. Объединенный гексановый экстракт сушат безводным сульфатом натрия, помещают в колбы для отгонки или в фарфоровые чашки и концентрируют до объема 0,5 мл. Оставшийся растворитель отгоняют досуха при комнатной температуре. Сухой остаток растворяют в 5 мл этилового спирта и аликвотную часть (2 - 3 мкл) хроматографируют.

Условия хроматографирования. Хроматограф марки "Цвет" с ТИД и

ДПР. Колонка стеклянная спиральная длиной 1 м с диаметром 3 мм,

заполненная хроматоном N-AW-HMDS (0,16 - 0,20 мм) с 5% SE-30 либо

инертоном-супер N (0,16 - 0,20 мм) с 3% OV-101. Рабочая шкала

-10

электрометра при работе с ТИД 2 x 10 А, при работе с ДПР 20 x

-12

10 A. Скорость протяжки диаграммной ленты 240 мм/ч. При работе

на ТИД расход газа-носителя (азота) 22 мл/мин., водорода - 14 - 17

мл/мин., воздуха - 400 мл/мин. При работе на ДПР расход

газа-носителя (азота) 60 мл/мин., расход на продувку детектора 150

мл/мин. Температура (°C): испарителя - 210, детектора - 230,

колонки - 190 и 127.

Время удерживания и пределы обнаружения исследуемых соединений при указанных условиях определения методом ГЖХ приведены в таблице 30.

Таблица 30

ВРЕМЯ УДЕРЖИВАНИЯ ПРИ РАЗЛИЧНЫХ ТЕМПЕРАТУРАХ,

ПРЕДЕЛЫ ОБНАРУЖЕНИЯ И КОНЦЕНТРАЦИИ РАБОЧИХ РАСТВОРОВ

ГЕТЕРОФОСА, ЭТАФОСА И ИХ МЕТАБОЛИТОВ

┌───┬─────────────────┬──────┬──────────────┬───────┬────────────┬─────────┐

│ N │ Исследуемое │Темпе-│ Время │Относи-│Концентрация│Нижний │

│п/п│ соединение │ратура│ удерживания │тельное│ рабочего │предел │

│ │ │колон-├───────┬──────┤время │ раствора │обнаруже-│

│ │ │ки, °C│ ТИД │ ДПР │удержи-│<*>, мкг/мл │ния, нг │

│ │ │ │ │ │вания │ ├────┬────┤

│ │ │ │ │ │ │ │ТИД │ДПР │

├───┴─────────────────┴──────┴───────┴──────┴───────┴────────────┴────┴────┤

│ Фаза - 5% SE-30 на хроматоне N-AW-HMDS, температура испарителя 210 °C │

│ │

│1 │Гетерофос │190 │3 мин. │- │1 │0,2 │0,1 │- │

│ │ │ │36 с │ │ │ │ │ │

│ │-"- │127 │25 мин.│- │1 │2,0 │1,0 │- │

│2 │Этафос │190 │10 мин.│4 мин.│2,95 │5,0 │1,2 │0,1 │

│ │ │ │36 с │30 с │ │(0,1) <**> │ │ │

│ │Метаболиты │ │ │ │ │ │ │ │

│1 │O-Этил-O- │190 │1 мин. │- │0,42 │1,0 │0,2 │- │

│ │фенилфосфат │ │30 с │ │ │ │ │ │

│2 │O-Этил-S- │190 │54 с │- │0,25 │0,5 │0,1 │- │

│ │пропилфосфат │ │ │ │ │ │ │ │

│ │То же │127 │6 мин. │- │- │- │- │- │

│ │ │ │15 с │ │ │ │ │ │

│3 │O-Этил-O-фенил-S-│190 │2 мин. │- │0,62 │0,5 │0,1 │- │

│ │метилтиофосфат │ │12 с │ │ │ │ │ │

│4 │O-Этил-O- │190 │2 мин. │- │0,80 │3,0 │1,0 │- │

│ │фенилтиофосфат │ │48 с │ │ │ │ │ │

│5 │O-Этил-0,2,4- │190 │5 мин. │3 мин.│1,46 │5,0 │1,2 │0,2 │

│ │дихлорфенил- │ │18 с │24 с │ │(1) <**> │ │ │

│ │тиофосфат │ │ │ │ │ │ │ │

│6 │O-метил-O-фенил- │190 │1 мин. │- │0,53 │1,0 │0,2 │- │

│ │S-пропилтиофосфат│ │54 с │ │ │ │ │ │

│ │ │190 │3 мин. │ │0,85 │ │ │ │

│7 │O-Этил-O-метил- │127 │4 мин. │- │0,19 │0,5 │0,2 │- │

│ │S-пропилтиофосфат│ │42 с │ │ │ │ │ │

│8 │O,O-Диметил- │127 │3 мин. │- │0,14 │0,5 │0,1 │- │

│ │S-пропилтиофосфат│ │30 с │ │ │ │ │ │

│9 │O-Этил-O- │127 │2 мин. │- │0,09 │2,0 │2,0 │- │

│ │метилтиофосфат │ │12 с │ │ │ │ │ │

│10 │O,O-Диметил- │127 │1 мин. │ │0,07 │2,0 │1,0 │- │

│ │тиофосфат │ │42 с │ │ │ │ │ │

│ │

│ Фаза - 3% OV-101 на инертоне-супер, температура испарителя 225 °C │

│ │

│1 │Гетерофос │190 │2 мин. │- │- │0,1 │0,02│- │

│ │ │ │42 с │ │ │ │ │ │

└───┴─────────────────┴──────┴───────┴──────┴───────┴────────────┴────┴────┘

--------------------------------

<*> Для удобства работы можно приготовить смеси, в которых концентрация каждого соединения соответствует его концентрации, указанной в таблице для рабочих растворов. Смесь I: гетерофос, метаболиты N 1, 2, 3, 4, 6. Смесь II: гетерофос, метаболит N 5. Смесь III: метаболиты N 7, 8, 9, 10.

<**> В скобках указана концентрация раствора при работе с ДПР.

Обработка результатов анализа. Количественное определение проводят методом абсолютной калибровки. Для этого до и после анализа проб вводят в хроматограф по 3 - 5 мкл рабочих стандартных растворов. Измеряют высоту пиков и вычисляют среднее арифметическое из пяти определений. Если при введении в хроматограф аликвотной части (3 - 5 мкл) конечного экстракта пробы получаются слишком большие пики или происходит "зашкаливание", пробу разбавляют н-гексаном. Для определения гетерофоса и всех его метаболитов каждую пробу следует анализировать при двух температурах колонки (190 и 127 °C), используя соответствующие стандарты.

Содержание пестицида или его метаболитов в пробе (X, мг/кг, мг/л) рассчитывают по формуле:

AV H VK

2 1

X = -------,

H V P

2 1

где:

A - количество пестицида или метаболита в стандартном

растворе, введенном в хроматограф, мкг/мл;

V - объем стандартного раствора, введенного в хроматограф,

мкл;

H - высота пика стандартного раствора, введенного в

хроматограф, мм;

H - высота пика исследуемого раствора, мм;

V - объем экстракта, введенного в хроматограф, мкл;

V - объем анализируемого экстракта, мл;

P - навеска или объем анализируемой пробы, г (мл);

K - поправочный коэффициент, составляющий для мяса, молока и

яиц 1,2; 1,4; 1,5 соответственно.

Требования безопасности. Соблюдают общепринятые правила безопасности при работе с органическими растворителями и токсичными веществами.