"Методические указания по определению диазинона и фосфамида в биологических средах методами тонкослойной и газожидкостной хроматографии" // Технорма.RU

Утверждены

Минздравом СССР

8 июня 1987 г. N 4323-87 (фосфамид),

N 4324-87 (диазинон)

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

ПО ОПРЕДЕЛЕНИЮ ДИАЗИНОНА И ФОСФАМИДА В БИОЛОГИЧЕСКИХ СРЕДАХ

МЕТОДАМИ ТОНКОСЛОЙНОЙ И ГАЗОЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ

Краткая характеристика препаратов диазинон и фосфамид приведена в Унифицированной методике.

Принцип метода. Метод основан на экстракции диазинона и фосфамида из биологических сред органическими растворителями (хлороформ, ацетон), очистке полученных экстрактов и последующем определении методами ТСХ и ГЖХ.

Метод ТСХ предусматривает использование подвижной фазы на основе гексана, проявляющих реагентов - бромфенолового синего, хлорида палладия, 2,6-дибром-N-хлорхинонимина, нитрата серебра.

Метод ГЖХ предусматривает применение ТИД и ДЭЗ, неподвижных фаз SE-30 или XE-60.

Метрологическая характеристика метода приведена в таблице 34.

Таблица 34

МЕТРОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА МЕТОДА ОПРЕДЕЛЕНИЯ ДИАЗИНОНА

И ФОСФАМИДА В БИОСРЕДАХ (N = 5 И P = 0,95)

┌───────────────────┬─────────────┬────────────┬───────────┬─────────────┬─────┐

│ Анализируемый │Нижний предел│ Среднее │Стандартное│Доверительный│Метод│

│ объект │определения, │ значение │отклонение,│ интервал, │ │

│ │ мкг/мл, │определения,│ % │ % │ │

│ │ мкг/г, │ % │ │ │ │

│ │ мкг/кв. см │ │ │ │ │

├───────────────────┴─────────────┴────────────┴───────────┴─────────────┴─────┤

│ Диазинон │

│ │

│Желудочный сок, │0,05 │85,4 │+/- 3,9 │+/- 4,9 │ГЖХ │

│слюна │0,25 │78,5 │+/- 6,3 │+/- 7,8 │ТСХ │

│Желчь │0,05 │87,2 │+/- 4,1 │+/- 5,1 │ГЖХ │

│ │0,25 │80,0 │+/- 6,3 │+/- 7,8 │ТСХ │

│Моча │0,002 │95,3 │+/- 4,7 │+/- 5,8 │ГЖХ │

│ │0,05 │89,5 │+/- 6,8 │+/- 8,5 │ТСХ │

│Кровь │0,05 │90,3 │+/- 3,5 │+/- 4,3 │ГЖХ │

│ │0,25 │82,4 │+/- 7,3 │+/- 9,1 │ТСХ │

│Ткани внутренних │0,02 │91,7 │+/- 4,7 │+/- 5,8 │ГЖХ │

│органов, кожа │0,5 │88,5 │+/- 7,6 │+/- 9,5 │ТСХ │

│Смывы с поверхности│0,002 │95,6 │+/- 3,7 │+/- 4,6 │ГЖХ │

│кожи │0,31 │90,0 │+/- 8,4 │+/- 10,5 │ТСХ │

│ │

│ Фосфамид │

│ │

│Желудочный сок, │0,02 │88,6 │+/- 3,85 │+/- 4,8 │ГЖХ │

│слюна │0,25 │78,6 │+/- 6,3 │+/- 7,8 │ТСХ │

│Желчь │0,02 │92,0 │+/- 3,4 │+/- 4,2 │ГЖХ │

│ │0,25 │82,0 │+/- 7,4 │+/- 9,2 │ТСХ │

│Кровь │0,02 │95,2 │+/- 2,8 │+/- 6,0 │ГЖХ │

│ │0,25 │85,2 │+/- 6,8 │+/- 8,5 │ТСХ │

│Моча │0,0008 │95,1 │+/- 3,7 │+/- 4,6 │ГЖХ │

│ │0,01 │89,1 │+/- 6,7 │+/- 8,3 │ТСХ │

│Кожа │0,04 │91,1 │+/- 4,5 │+/- 5,6 │ГЖХ │

│ │0,5 │87,9 │+/- 7,6 │+/- 9,4 │ТСХ │

│Ткани внутренних │0,04 │90,3 │+/- 4,9 │+/- 6,1 │ГЖХ │

│органов │0,5 │80,3 │+/- 7,2 │+/- 8,9 │ТСХ │

│Смывы с поверхности│0,006 │95,2 │+/- 3,5 │+/- 4,3 │ГЖХ │

│кожи │0,03 │90,0 │+/- 7,2 │+/- 8,9 │ТСХ │

└───────────────────┴─────────────┴────────────┴───────────┴─────────────┴─────┘

Избирательность метода. Определению диазинона и фосфамида не мешают пестициды, которые могут присутствовать в пробе: циклоат, эптам, метоксихлор, линдан.

Реактивы и растворы. Диазинон х.ч. или препаративная форма. Фосфамид х.ч. или 40(38)-процентный к.э. Ацетон х.ч. Гексан ч. Хлороформ х.ч. Натрия цитрат ч. Натрия сульфат безводный ч.д.а. Серебра нитрат х.ч., 0,5-процентный водно-ацетоновый раствор (1:3). Гидроксид натрия х.ч., 20-процентный раствор. Бромфеноловый синий ч.д.а. Кислота лимонная х.ч., 2-процентный раствор. Кислота хлороводородная х.ч., концентрированная и 0,1 н раствор. Хлорид палладия ч. Кальция сульфат безводный х.ч.

Проявляющие реагенты: N 1 - бромфеноловый синий (взвешивают 50 мг бромфенолового синего, растворяют в 10 мл ацетона и далее разбавляют до 100 мл раствором нитрата серебра. Срок хранения в холодильнике 1 мес.); N 2 - хлорид палладия (взвешивают 0,2 г хлорида палладия, вносят в колбу вместимостью 100 мл, приливают 2 капли концентрированной хлороводородной кислоты, помещают колбу в водяную баню при 60 - 70 °C на 10 - 15 мин. Периодически встряхивают до полного растворения содержимого колбы. Доводят объем раствора до 100 мл водой. Срок хранения реактива в холодильнике 1 мес.); N 3 - 2,6-дибром-N-хлорхинонимин х.ч., 0,5-процентный раствор в гексане; N 4 - нитрат серебра (взвешивают 1 г нитрата серебра и растворяют в 99 мл воды. Опрыскивают пластинки проявляющим реагентом N 4 после гидролиза 20-процентным раствором гидроксида натрия. Хранят реактив в холодильнике до 2 недель).

Для определения фосфамида подвижная фаза: хлороформ - ацетон - гексан (3:1:1) или гексан - ацетон (3:2), для определения диазинона - гексан - ацетон (2:1 или 3:1).

Стандартный раствор фосфамида, диазинона с содержанием 100; 10; 2 и 0,2 мкг/мл в гексане или ацетоне для ГЖХ, 100 мкг/мл в хлороформе - для ТСХ. Если стандартный раствор готовят из препаративной формы пестицида, то учитывают содержание действующего вещества, при необходимости фильтруют. Срок хранения стандартных растворов, содержащих 100 мкг/мл, до 1 мес. в холодильнике.

Азот, водород в баллонах с редукторами. Азот особой чистоты (содержание кислорода не более 0,003%).

Насадка хроматографической колонки: при использовании ТИД - хроматон N-AW-DMCS + 5% SE-30 (анализ фосфамида), хроматон N-AW-DMCS + 5% XE-60 (анализ диазинона); при использовании ДЭЗ или ДПР - хроматон N-AW-DMCS + 5% XE-60 (0,16 - 0,20 мм).

Оксид алюминия II степени активности для хроматографии. Сульфат кальция безводный ч.д.а.

Хроматографические пластинки "Силуфол" размером 15 x 15 см. Для приготовления хроматографических пластинок с оксидом алюминия 50 г оксида алюминия, просеянного через сито 100 меш, смешивают с 5 г безводного сульфата кальция и 75 мл воды, встряхивают до образования однородной массы; наносят тонким слоем на 10 стеклянных пластинок размером 9 x 12 см; сушат на воздухе 12 ч; хранят в эксикаторе.

Приборы и посуда. Газовый хроматограф с ТИД, ДЭЗ или ДПР. Ротационный вакуумный испаритель ИР-1М с набором колб или аналогичный аппарат для отгонки растворителей. Аппарат для встряхивания. Термостат. Колбы мерные, цилиндры. Пипетки, микропипетки. Воронки химические и делительные. Хроматографическая камера. Камера для опрыскивания пластинок. Пульверизатор стеклянный. Баня водяная. Стеклянные капилляры для нанесения проб на хроматографические пластинки. Стеклянные пластинки размером 9 x 12 см. Микрошприц МШ-10. Колонки стеклянные хроматографические длиной 1 м с внутренним диаметром 3 мм. Секундомер. Линейка измерительная. Лупа измерительная.

Ход анализа. Экстракция и очистка экстрактов. К 2 мл пробы слюны, желчи, желудочного сока приливают 0,5 мл воды, 3 мл хлороформа и осторожно встряхивают на холоде 30 мин. Отделяют органический слой. Экстракцию проводят еще дважды порциями растворителя по 3 мл. Экстракты объединяют, пропускают через слой безводного сульфата натрия (2 г), фильтруют. Отгоняют растворитель примерно до объема 0,2 - 0,5 мл.

К 50 мл мочи приливают 5 мл воды, 10 мл хлороформа и экстрагируют, осторожно встряхивая в течение 30 мин. Экстракцию проводят трижды порциями хлороформа по 10 - 20 мл. Органический слой отделяют, объединяют и далее поступают так же, как с пробами слюны.

Пробу крови (2 мл) отбирают в пробирку, смоченную 5-процентным раствором цитрата натрия. Приливают 4 мл хлороформа и осторожно встряхивают на холоде 20 мин. Органический слой отделяют, фильтруют, пропускают через безводный сульфат натрия. Экстракцию проводят дважды порциями растворителя по 4 мл. Далее поступают так же, как с пробами слюны.

Пробу кожи, тканей внутренних органов предварительно выдерживают в морозильнике 1 - 2 ч. Пробу массой 1 г тщательно измельчают, растирают в фарфоровой ступке, приливают 4 мл охлажденного ацетона и содержимое переносят в склянку с притертой пробкой. Встряхивают на холоде в течение 30 - 40 мин. Органический слой сливают, фильтруя через безводный сульфат натрия. Экстракцию повторяют еще дважды свежими порциями ацетона. Объединенный экстракт переносят в колбу для отгонки растворителей и отгоняют ацетон примерно до объема 0,2 - 0,5 мл. Остаток раствора подсушивают безводным сульфатом натрия.

Анализ методом ТСХ. Пробу 0,2 - 0,5 мл количественно наносят на хроматографическую пластинку, параллельно на эту же пластинку наносят стандартные растворы пестицида, содержащие 0,5 - 10 мкг. Помещают пластинку в хроматографическую камеру, куда предварительно (за 20 - 30 мин.) наливают подвижную фазу. После поднятия фронта растворителя на высоту 10 - 12 см пластинку извлекают из камеры и дают улетучиться следам растворителя. Затем применяют один из проявляющих реагентов. Если хроматографирование проводят на пластинках "Силуфол", то используют проявляющие реагенты N 1, 2, 3 (диазинон, фосфамид).

Через 15 - 20 мин. после опрыскивания пластинки проявляющим реагентом N 1 ее опрыскивают 5-процентным раствором лимонной кислоты. Пестициды и некоторые метаболиты окрашиваются в синий, темно-голубой, сине-зеленый цвет на светло-желтом фоне пластинки. Если применяют проявляющий реагент N 2, то сразу после опрыскивания фосфамид окрашивается в светло-коричневый цвет, иногда с желтоватым оттенком, а диазинон - в желтый цвет.

После опрыскивания проявляющим реагентом N 3 пластинку следует поместить в сушильный шкаф при 110 - 115 °C на 2 - 3 мин. На светлом фоне пластинки зоны локализации пестицидов и их фосфорорганических аналогов окрашиваются в ярко-красный и рубиново-желтый цвета соответственно, а других метаболитов - в розово-красный цвет.

Величина R фосфамида 0,55 - 0,6; кислородного аналога (P-O)

фосфамида - 0,2 - 0,25. Величина R диазинона - 0,45; его

метаболитов: диазоксона (P-O-диазинона) - 0,3; 2-изопропил-N-

метил-6-гидроксипиримидина - 0,1; 2-изопропил-6-

меркаптопиримидина - 0,6; тетраэтилпирофосфата - 0,7.

Если хроматографирование проб, содержащих фосфамид, проводят

на пластинках с оксидом алюминия с использованием в качестве

подвижного растворителя хлороформа, то применяют проявляющий

реагент N 4. После улетучивания следов хлороформа пластинку

обрабатывают 20-процентным раствором гидроксида натрия, а после

подсушивания слоя - проявляющим реагентом N 4. Пластинку помещают

в сушильный шкаф при 105 °C на 5 мин.; фосфамид и его кислородный

аналог проявляют в виде серо-черных пятен. Величина R фосфамида

0,4; кислородного аналога - 0,1 - 0,15.

Анализ методом ГЖХ. Экстракцию диазинона и фосфамида из биологических проб (желчь, желудочный сок, кровь, моча, кожа, ткани внутренних органов) проводят так же, как для определения методом ТСХ. Полученные экстракты при комнатной температуре упаривают до сухого остатка. К сухому остатку приливают 1 мл гексана или ацетона и аликвотную часть пробы (2 - 5 мкл) вводят в хроматограф (табл. 35).

Таблица 35

УСЛОВИЯ ГАЗОХРОМАТОГРАФИЧЕСКОГО АНАЛИЗА

┌──────────────────────────┬───────────────────────┬──────────────────────┐

│ Характеристики │ ТИД │ ДЭЗ │

├──────────────────────────┼───────────────────────┼──────────────────────┤

│Насадка │Хроматон + 5% SE-30 │Хроматон + 5% XE-60 │

│ │(фосфамид) │ │

│ │Хроматон + 5% XE-60 │ │

│ │(диазинон) │ │

│Температура, °C: │ │ │

│ колонки │180 │180 │

│ испарителя │230 │220 - 230 │

│ детектора │- │190 │

│Расход, мл/мин. │ │ │

│ азота │20 - 25 │40 - 60 │

│ │ │(азот особой чистоты) │

│ водорода │20 │- │

│ воздуха │200 - 240 │240 (для ДПР) │

│ │ -12 │ -12 │

│Чувствительность шкалы │50 x 10 │(20...50) x 10 │

│электрометра, А │ │ │

│Минимально детектируемое │0,2 │0,5 (фосфамид), │

│количество, нг │ │2 (диазинон) │

└──────────────────────────┴───────────────────────┴──────────────────────┘

Примечание. Режим работы изотермический. Длина колонки 1 м, диаметр 3 мм. Время выхода, мин.: фосфамида 2,1 - 4,8; фосфорорганического аналога фосфамида 1,5 - 5,6; диазинона 1,5 - 2,8; диазоксона - 3,1.

Обработка результатов анализа. Анализ методом ТСХ. С помощью промасленной миллиметровой бумаги измеряют площадь пятен пестицида на хроматограмме пробы и стандартных растворов. Можно построить градуировочный график зависимости площади пятна от концентрации и по графику найти концентрацию фосфамида в хроматографируемой пробе. Для расчета можно использовать формулу. Измеряют площадь того пятна на хроматограмме стандарта, которое по размерам наиболее близко к пятну на хроматограмме пробы.

Анализ методом ГЖХ. Количественную обработку результатов анализа проводят методом абсолютной калибровки. Для этого строят градуировочный график зависимости площади от концентрации, вводя в хроматограф по 2 - 5 мкл стандартных растворов фосфамида и диазинона, содержащих 0,2 - 20 мкг/мл. По градуировочному графику находят концентрацию пестицидов в хроматографируемой пробе. При анализе проб параллельное определение проводят не менее трех раз. Для расчета можно воспользоваться формулой, измерив площадь пика на хроматограмме стандарта, наиболее близкого по размерам к пику на хроматограмме пробы, и полученные величины подставить в формулу.

Расчет количества пестицидов в пробе (X, мкг/г, мкг/мл) проводят по формуле:

CS V

пр

X = ------,

S V P

ст 1

где:

C - количество пестицида на хроматограмме стандарта, мкг;

S - площадь пятна (ТСХ) или пика (ГЖХ) на хроматограмме

ст

стандарта, кв. мм;

S - площадь пика (ГЖХ) или пятна (ТСХ) на хроматограмме

пр

пробы, кв. мм;

V - общий объем экстракта пробы, мл;

V - хроматографируемый объем экстракта пробы, мл;

P - навеска или объем пробы, г или мл.

Требования безопасности. Необходимо соблюдать правила безопасности при работе в химической лаборатории с ядовитыми веществами, электронагревательными приборами и сжатыми газами.