"Методические указания по определению сумилекса в биологических средах методом газожидкостной хроматографии" // Технорма.RU

Утверждены

Минздравом СССР

8 июня 1987 г. N 4322-87

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

ПО ОПРЕДЕЛЕНИЮ СУМИЛЕКСА В БИОЛОГИЧЕСКИХ СРЕДАХ

МЕТОДОМ ГАЗОЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ <*>

--------------------------------

<*> Разработаны Л.Г. Александровой (КНИИГТиПЗ).

Краткая характеристика препарата дана в Методических указаниях N 2797-83.

Принцип метода. Метод основан на экстракции сумилекса из биологических сред органическими растворителями (хлороформ, гексан, ацетон), очистке экстракта и последующем определении препарата методом газожидкостной хроматографии с ДЭЗ или ДПР.

Метрологическая характеристика метода приведена в таблице 137.

Таблица 137

МЕТРОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ГАЗОХРОМАТОГРАФИЧЕСКОГО

МЕТОДА ОПРЕДЕЛЕНИЯ СУМИЛЕКСА В БИОСРЕДАХ (n = 5 и p = 0,95)

┌────────────────────────┬────────────┬────────────┬───────────┬──────────┐

│ Анализируемый объект │ Нижний │ Среднее │Стандартное│Довери- │

│ │ предел │ значение │отклонение,│тельный │

│ │определения,│определения,│ % │интервал │

│ │ мкг/мл │ % │ │среднего, │

│ │ или мкг/г │ │ │% │

├────────────────────────┼────────────┼────────────┼───────────┼──────────┤

│Желудочный сок │0,05 │95,4 │+/- 3,4 │+/- 4,2 │

│Слюна │0,05 │95,4 │+/- 3,4 │+/- 4,8 │

│Желчь │0,05 │90,2 │+/- 4,1 │+/- 5,1 │

│Моча │0,002 │96,3 │+/- 3,4 │+/- 4,2 │

│Кровь │0,05 │90,8 │+/- 4,4 │+/- 5,5 │

│Ткани внутренних органов│0,05 │89,9 │+/- 5,2 │+/- 6,4 │

└────────────────────────┴────────────┴────────────┴───────────┴──────────┘

Избирательность метода. Определению сумилекса не мешают пестициды, которые применяют для обработки тех же сельскохозяйственных культур, что и сумилекс (например актеллик, метафос, офунак и др.).

Реактивы, растворы. Сумилекс х.ч. Ацетон х.ч, Гексан ч. Хлороформ х.ч. Цитрат натрия х.ч. Сульфат натрия безводный, ч.д.а. Стандартный раствор сумилекса с содержанием 100 мкг/мл в гексане. Для этого взвешивают 10 мг х.ч. препарата или 20 мг 50-процентного с.п. и растворяют в гексане в колбе на 100 мл. Хранят в холодильнике до 1 мес. Рабочие растворы с содержанием сумилекса 0,5; 5 и 10 мкг/мл готовят соответствующим разбавлением исходного стандартного раствора. Азот особой чистоты.

Насадка хроматографической колонки: хроматон N-AW-DMCS с 5% SE-30 (товарная форма), зернение 0,16 - 0,2 мм.

Приборы, посуда. Газовый хроматограф с ДЭЗ или ДПР. Ротационный вакуумный испаритель с набором колб. Аппарат для встряхивания. Измельчитель тканей. Колбы мерные, грушевидные. Цилиндры. Пипетки, микропипетки. Стаканы, склянки химические вместимостью 50 - 100 мл. Воронки химические и делительные. Баня водяная. Микрошприцы МШ-10, цена делений 0,2 мкл. Колонка стеклянная хроматографическая длиной 1 м, внутренним диаметром 3 мм. Секундомер. Линейка и измерительная лупа.

Ход анализа. Экстракция и очистка экстрактов. К 2 мл пробы слюны, желчи, желудочного сока приливают 0,5 мл дистиллированной воды и 3 мл гексана. Осторожно встряхивают на холоду в течение 30 - 40 мин. Отделяют органический слой. Экстракцию повторяют еще дважды по 2 мл гексана. Экстракты объединяют, пропускают через безводный сернокислый натрий (2 г), который помещают на фильтр. Измеряют объем полученного раствора.

К 20 - 50 мл мочи приливают 2 - 5 мл воды и 10 мл гексана. Осторожно встряхивают в течение 30 мин. Органический слой отделяют, экстракцию проводят еще дважды по 5 мл гексана. Экстракты объединяют, фильтруют и пропускают через безводный сульфат натрия (5 г). Растворитель отгоняют до объема 10 мл. Аликвотную часть полученного раствора (2 - 5 мкл) вводят в хроматограф.

Пробу крови (1 - 2 мл) собирают в пробирку, смоченную 5-процентным раствором цитрата натрия. Приливают 4 мл хлороформа и встряхивают на холоду в течение 30 мин. Далее поступают так, как описано для желчи. Полученный осушенный экстракт отгоняют примерно до 0,1 - 0,2 мл. Остаток испаряют при комнатной температуре. К сухому остатку приливают 1 мл гексана и в хроматограф вводят 2 - 5 мкл раствора.

Пробу тканей внутренних органов массой 1 - 2 г измельчают и заливают 4 - 5 мл хлороформа или ацетона. Экстрагируют на холоду, встряхивают 30 - 40 мин. Органический слой отделяют. Экстракцию повторяют еще дважды по 3 - 4 мл растворителя. Экстракты объединяют, фильтруют, пропускают через безводный сульфат натрия (1,5 - 2 г). Отгоняют растворитель примерно до 0,1 - 0,2 мл. Остаток испаряют при комнатной температуре досуха. К сухому остатку приливают 1 мл гексана и в хроматограф вводят 2 - 5 мкл раствора.

Условия газохроматографического анализа. ДЭЗ или ДПР. Режим работы -

изотермический. Колонка (длина 1 м, внутренний диаметр 3 мм). Насадка -

хроматон N-AW-DMCS с 5% SE-30. Температура, °C: колонки - 180, испарителя -

220, детектора - 190. Расход азота особой чистоты 45 мл/мин. Продувка

детектора 6 л/ч, воздуха 240 мл/мин. Чувствительность шкалы электрометра

-12 -12

20 x 10 - 50 x 10 А. Минимально детектируемое количество 0,5 нг.

Время удерживания 6 мин.

Обработка результатов анализа. Количественную обработку результатов анализа проводят методом абсолютной калибровки. Для этого в хроматограф вводят стандартные растворы сумилекса, содержащие 0,5; 1; 2; 5; 8; 12; 15 и 20 мкг/мл (по 5 определений). По средним данным строят градуировочный график зависимости "площадь пика - концентрация". По градуировочному графику находят концентрацию сумилекса в хроматографируемой пробе. При анализе проб параллельно проводят не менее 3 определений. Для расчета можно воспользоваться формулой, куда вводят площадь пика на хроматограмме стандарта, наиболее близкого по размерам к пику на хроматограмме пробы. Содержание сумилекса в исследуемой биологической пробе (X, мкг/мл или мкг/г) определяют по формуле:

C S V

ст пр

X = -------,

S V P

ст 1

где:

C - количество сумилекса в хроматографируемом стандарте, нг;

ст

S , S - площади пиков соответственно на хроматограмме стандарта и

ст пр

пробы, кв. мм;

V - общий объем экстракта, мл;

V - хроматографируемый объем экстракта, мкл;

P - масса или объем пробы, г или мл.

Требования безопасности. Необходимо соблюдать требования безопасности при работе с ядовитыми веществами, электронагревательными приборами и сжатыми газами.