"Методика определения нитритов и нитратов в кормах, овощах, бахчевых культурах, крови, патологическом материале, молоке и молочных продуктах" // Технорма.RU

Утверждена

Главным управлением

ветеринарии Госагропрома СССР

18 июня 1986 года

МЕТОДИКА

ОПРЕДЕЛЕНИЯ НИТРИТОВ И НИТРАТОВ В КОРМАХ, ОВОЩАХ,

БАХЧЕВЫХ КУЛЬТУРАХ, КРОВИ, ПАТОЛОГИЧЕСКОМ МАТЕРИАЛЕ,

МОЛОКЕ И МОЛОЧНЫХ ПРОДУКТАХ

1. Принцип метода

Метод определения нитритов основан на фотометрическом измерении интенсивности окраски азосоединения розово-малинового цвета, образующегося при реакции нитритов с альфа-нафтиламином и сульфаниловой кислотой (реактив Грисса) в кислой среде после водного извлечения их из исследуемых проб.

Реакция специфична для нитритов.

Метод определения нитратов основан на водном извлечении их из исследуемых проб, количественном восстановлении нитратов в нитриты и последующем определении нитритов с реактивом Грисса.

2. Метрологическая характеристика метода

Предел определения нитритов составляет 0,05 мг/кг (мг/л), степень определения нитритов 90 +/- 10%.

Предел определения нитратов составляет 0,5 мг/кг (мг/л), степень определения нитратов 83 +/- 17%.

3. Реактивы и растворы

Сульфаниловая кислота, ч.д.а., ГОСТ 5821-69.

Альфа-нафтиламин, ч.д.а., ГОСТ 8827-57.

Барий сернокислый, ч.д.а., ГОСТ 3158-75.

Цинковая пыль, порошок цинка.

Лимонная кислота, х.ч. или ч.д.а., ГОСТ 3652-69.

Марганец сернокислый, ч.д.а., ГОСТ 435-67.

Натрий азотистокислый (NaNO ), х.ч., ГОСТ 4197-66.

Калий азотнокислый (KNO ), х.ч., ГОСТ 4217-65.

Сульфаминовая кислота, т.ч., ТУ 6-09-2437-79 или ТУ 6-09-2437-79.

Уксусная кислота концентрированная (ледяная), ГОСТ 61-69.

12-процентный водный раствор уксусной кислоты.

1-процентный водный раствор сульфаминовой кислоты.

Уголь активированный марки Б или уголь активированный в таблетках (аптечный).

Натрий гидроокись, х.ч., ГОСТ 4328-77.

Цинк сернокислый, ч.д.а., ГОСТ 4374-77.

Приготовление реактива Грисса:

а) 0,5 г сульфаниловой кислоты растворяют в 150 мл 12-процентного раствора уксусной кислоты;

б) 0,1 г альфа-нафтиламина растворяют (при нагревании) в 20 мл дистиллированной воды, фильтруют и смешивают со 150 мл 12-процентного раствора уксусной кислоты.

Перед употреблением одну часть раствора "а" смешивают с равной по объему частью раствора "б". Растворы "а" и "б" хранят отдельно в холодильнике, при необходимости - в течение 6 мес.

Приготовление стандартного раствора нитрита натрия: 0,15 г высушенного

до постоянной массы при температуре 80 °С NaNO растворяют в 1 л

дистиллированной воды, свободной от нитритов. 1 мл этого раствора содержит

0,1 мг (100 мкг) NO . Раствор хранят в холодильнике, он устойчив в течение

месяца.

Приготовление рабочего раствора нитрита натрия: 25 мл полученного

стандартного раствора переносят в мерную колбу на 500 мл и доводят объем до

метки дистиллированной водой. Раствор должен быть свежеприготовленным, 1 мл

его содержит 0,005 мг (5 мкг) NO . Этот раствор используют для построения

калибровочной кривой.

Приготовление стандартного раствора нитрата калия: растворяют 1,63 г

нитрата калия, высушенного до постоянной массы при 105 °С, в

дистиллированной воде в мерной колбе на 1 л и доводят объем раствора до

метки дистиллированной водой. 1 мл этого раствора содержит 1 мг

нитрат-ионов (NO ). Раствор можно хранить в холодильнике в течение 3 мес.

Приготовление рабочего раствора нитрата калия: в мерную колбу на 100 мл

переносят пипеткой 1 мл стандартного раствора нитрата калия и доводят объем

раствора в колбе до метки 12-процентным раствором уксусной кислоты. 1 мл

этого раствора содержит 0,01 мг (10 мкг) NO . Раствор должен быть

свежеприготовленным. Этот раствор используют для построения калибровочной

кривой.

Приготовление реактива для восстановления нитратов в нитриты:

а) барий сернокислый, высушенный при 100 °С до постоянной массы, - 100 г;

б) марганец сернокислый, прокаленный при 200 °С в течение часа, - 10 г;

в) цинковая пыль - 2 г;

г) лимонная кислота - 75 г;

д) сульфаниловая кислота - 4 г;

е) альфа-нафтиламин - 2 г.

Каждый реактив тщательно растирают в ступке, затем к реактиву "а" в ступке последовательно добавляют реактивы "б", "в", "д", "е", "г" и тщательно перемешивают до получения однообразной массы. Полученный реактив хранят в склянке из темного стекла, он пригоден для использования в течение 2 лет.

Приготовление 12-процентного раствора уксусной кислоты: 120 мл ледяной уксусной кислоты смешивают с 880 мл дистиллированной воды.

Приготовление 1-процентного раствора сульфаминовой кислоты: 1 г сульфаминовой кислоты растворяют в 99 мл дистиллированной воды.

Приготовление 0,5 М раствора гидроокиси натрия: 20 г NaOH растворяют в небольшом количестве дистиллированной воды в мерной колбе на 1 л и доводят объем в колбе до метки дистиллированной водой.

Приготовление 5-процентного раствора сульфата цинка: 5 г сульфата цинка растворяют в 95 мл дистиллированной воды.

4. Приборы и посуда

Химические пробирки; пробирки с притертыми пробками; центрифужные

пробирки; пипетки на 1, 5, 10, 20 мл; мерные колбы на 100 и 1000 мл;

конические колбы на 100, 250 мл; химические стаканы на 100, 200 мл; мешочки

для диализа или пленка для диализа N (выпускается картонажными фабриками);

цилиндры на 10, 50 и 100 мл; химические воронки; песочные часы на 2 мин.;

фотоэлектроколориметр; центрифуга на 5000 - 6000 об./мин.; фильтры

обеззоленные среднепористые.

Пленку или мешочки для диализа перед использованием для анализа помещают на 30 - 40 мин. в дистиллированную воду. Во всех случаях при проведении диализа пленку следует брать с запасом по отношению к пробе так, чтобы узел мешочка при проведении диализа не был опущен в воду.

5. Построение калибровочных кривых

Калибровочная кривая для определения нитритов: в 11 химических пробирок наливают рабочий раствор нитрита натрия в количествах, указанных в таблице. Затем в пробирки наливают дистиллированную воду до объема 10 мл, приливают по 1 мл реактива Грисса и энергично встряхивают.

ТАБЛИЦА ДЛЯ ПРИГОТОВЛЕНИЯ ШКАЛЫ СТАНДАРТОВ НА НИТРИТЫ

┌─────┬──────────┬──────────────┬─────┬───────────┬──────────────┐

│N │Количество│Содержание NO │N │Количество │Содержание NO │

│про- │ рабочего │ 2│про- │ рабочего │ 2│

│бирки│ раствора,├───────┬──────┤бирки│ раствора, ├──────┬───────┤

│ │ мл │ мг │ мкг │ │ мл │ мг │ мкг │

├─────┼──────────┼───────┼──────┼─────┼───────────┼──────┼───────┤

│1 │0,1 │0,0005 │0,5 │7 │1,2 │0,006 │6,0 │

│2 │0,2 │0,0010 │1,0 │8 │1,4 │0,007 │7,0 │

│3 │0,4 │0,0020 │2,0 │9 │1,6 │0,008 │8,0 │

│4 │0,6 │0,0030 │3,0 │10 │1,8 │0,009 │9,0 │

│5 │0,8 │0,0040 │4,0 │11 │2,0 │0,010 │10,0 │

│6 │1,0 │0,0050 │5,0 │ │ │ │ │

└─────┴──────────┴───────┴──────┴─────┴───────────┴──────┴───────┘

Для построения калибровочной кривой через 15 мин. после начала окрашивания определяют оптическую плотность растворов на фотоэлектроколориметре при зеленом светофильтре (длина волны 540 нм), кюветы - 10 мм, раствор для сравнения - дистиллированная вода.

Затем на оси абсцисс откладывают количество нитрит-ионов (мкг), а на оси ординат - найденные значения оптической плотности растворов и проводят кривую через точки пересечения.

Эта же шкала стандартов может быть использована для визуального сравнения с опытными пробами.

Калибровочная кривая для определения нитратов. Для приготовления шкалы стандартов в 7 химических пробирок с притертыми пробками или в 7 центрифужных пробирок с притертыми пробками последовательно прибавляют по 0,3 г реактива для восстановления нитратов, затем приливают рабочий раствор и 12-процентную уксусную кислоту в количествах, указанных в таблице (общий объем составляет 10 мл).

ТАБЛИЦА ДЛЯ ПРИГОТОВЛЕНИЯ ШКАЛЫ СТАНДАРТОВ НА НИТРАТЫ

┌──────────┬────────────┬────────────────┬───────────────────────┐

│N пробирки│ Количество │ - │Количество 1-процентной│

│ │ рабочего │ Содержание NO │ уксусной кислоты, мл │

│ │раствора, мл│ 3 │ │

│ │ ├────────┬───────┤ │

│ │ │ мг │ мкг │ │

├──────────┼────────────┼────────┼───────┼───────────────────────┤

│1 │0,0 │0,0 │- │10,0 │

│2 │1,0 │0,010 │10 │9,0 │

│3 │2,0 │0,020 │20 │8,0 │

│4 │4,0 │0,040 │40 │6,0 │

│5 │6,0 │0,060 │60 │4,0 │

│6 │8,0 │0,080 │80 │2,0 │

│7 │10,0 │0,100 │100 │0,0 │

└──────────┴────────────┴────────┴───────┴───────────────────────┘

Затем пробирки или центрифужные пробирки закрывают пробками и энергично встряхивают в течение ровно 2 мин. Через 10 мин. пробы центрифугируют в центрифужных пробирках при 5 - 6 тыс. об./мин. в течение 5 мин. Далее проводят колориметрическое определение интенсивности окраски раствора при длине волны 540 нм, кюветы - 10 мм, раствор для сравнения - 12-процентный раствор уксусной кислоты, обработанный, как пробы, сухим восстановителем и прошедший центрифугирование, - пробирка N 1.

Затем на оси абсцисс откладывают количество нитрат-ионов (мкг), а на оси ординат - найденные значения оптической плотности растворов и проводят кривую через точки пересечения.

Эта же шкала стандартов может быть использована для визуальных определений.

6. Ход определения

Корма. Для исследования измельчают пробу кормов и берут навеску 2 - 10 ч. Извлечение нитритов и нитратов из проб кормов проводят методом диализа. Для этого точно отмеривают 50 - 100 мл дистиллированной воды и используют этот объем для всех дальнейших операций с пробой. Пробу помещают в мешочек или пленку для диализа, приливают туда небольшое количество дистиллированной воды из первоначального объема (50 или 100 мл). Воды приливают столько, чтобы она хорошо смочила пробу. Далее пленку завязывают в виде мешочка, весь оставшийся объем дистиллированной воды (от 50 или 100 мл) наливают в химический стаканчик, опускают мешочек в стакан таким образом, чтобы полностью погрузить пробу в воду, и оставляют ее для проведения диализа в течение 1,5 - 2 ч. Затем, не вынимая мешочков из стаканов, пипеткой отбирают 10 мл диализата для анализа на нитриты и 5 мл для анализа на нитраты и проводят анализ, как описано ниже.

Кровь, органы и ткани животных. Для анализа берут 20 - 50 мл крови, 2 - 10 г органов или тканей животных, помещают пробу в диализный мешочек и опускают в химический стаканчик, в который наливают соответственно 50 - 100 мл прокипяченной горячей дистиллированной воды. Через 1,5 - 2 ч пипеткой отбирают из стакана 10 мл диализата для анализа на нитриты и 5 мл для анализа на нитраты и проводят анализ, как описано ниже.

Если раствор в стакане после диализа имеет окраску или муть, анализ следует проводить после удаления пигментов или мути. Пигменты, окрашивающие диализат, удаляют путем фильтрования небольшого объема диализата через воронку с бумажным фильтром, заполненным на 2/3 активированным углем. Уголь на фильтре предварительно промывают 50 мл прокипяченной дистиллированной воды, которую отбрасывают. Затем через этот фильтр отфильтровывают объем диализата, необходимый для анализа на нитриты и нитраты. В случае необходимости проводят повторное фильтрование этого раствора через свежую порцию активированного угля, промытого водой, до полного исчезновения окраски диализата.

При наличии в диализате мути проводят осаждение белков смесью 0,5 М раствора NaOH и 5-процентного раствора сульфата цинка в объемном отношении 2:5. Для этого отбирают из стакана 30 мл диализата, переносят его в другой стаканчик или колбу, добавляют 10 - 20 мл вышеуказанной смеси. После выпадения осадка диализат фильтруют, измеряют объем фильтрата и отбирают 5 мл для анализа на нитраты и 10 мл для анализа на нитриты.

В этом случае при расчете по формуле содержания нитратов и нитритов за общий объем фильтрата следует принимать сумму объема диализата, оставшегося в первом стаканчике (20 мл), и объема фильтрата, измеренного после осаждения белков и фильтрования.

Молоко, молозиво, обрат, сухое молоко, заменитель цельного молока (ЗЦМ). Отбирают 20 - 50 мл молока или молозива, переносят в пленку для диализа и приливают туда 2 - 4 мл 12-процентной уксусной кислоты, перемешивают содержимое стеклянной палочкой, завязывают пленку и опускают ее в стакан, содержащий 50 - 100 мл горячей прокипяченной дистиллированной воды. Затем через 1,5 - 2 ч отбирают 5 мл диализата для анализа на нитраты и 10 мл для анализа на нитриты и проводят анализ, как описано ниже. В том случае, если в растворе после диализа есть муть, необходимо провести осаждение белков. Для этого отбирают 20 - 30 мл диализата, добавляют 10 - 20 мл смеси 0,5 М раствора NaOH и 5-процентного раствора сульфата цинка в объемном отношении 2:5. После выпадения осадка диализат фильтруют, измеряют объем фильтрата и отбирают пипеткой 5 мл для анализа на нитраты и 10 мл для анализа на нитриты.

Общий объем диализата при этом будет составлять сумму первоначального объема диализата, оставшегося в первом стакане и измеренного после фильтрования объема.

Сухого молока, ЗЦМ для анализа берут 2 - 5 г, помещают в пленку для диализа, хорошо смачивают пробу небольшим объемом дистиллированной воды, приливают туда 2 - 4 мл 12-процентной уксусной кислоты, перемешивают стеклянной палочкой, завязывают пленку и опускают ее в стакан, содержащий 50 - 100 мл горячей дистиллированной воды, диализ проводят в течение 1,5 - 2 ч. При расчете общего объема воды необходимо учесть объем воды, взятый для смачивания пробы.

Анализ проводят, как описано для проб молока.

Обрата для анализа берут 20 - 50 мл, приливают к нему 20 - 50 мл дистиллированной воды, хорошо перемешивают в течение 10 мин. и отбирают 5 мл для анализа на нитраты и 10 мл для анализа на нитриты. Если в растворе есть муть или опалесценция, необходимо проводить осаждение белков, как указано выше.

Картофель, сахарная свекла, огурцы, капуста, лук, редька и другие овощи и бахчевые культуры, дающие с водой неокрашенные растворы. После измельчения проб берут навеску 2 - 10 г, помещают в колбу и заливают 50 - 100 мл дистиллированной воды. Перемешивают в течение 10 - 15 мин. и отбирают аликвотные количества для анализа на нитраты и нитриты. В том случае, если раствор имеет окраску, проводят фильтрование небольшого объема экстракта через активированный уголь, как описано выше.

7. Проведение определения

После того как в пробирку отобрано 10 мл диализата для анализа на нитриты, туда добавляют 1 мл реактива Грисса (раствор "а" смешивают с раствором "б" в равных объемных частях), встряхивают содержимое пробирки и через 15 мин. после появления окраски проводят измерение оптической плотности раствора на фотоэлектроколориметре при зеленом светофильтре (длина волны 540 нм) против дистиллированной воды в кюветах с рабочей длиной 10 мм.

Для анализа на нитраты отбирают 5 мл диализата в пробирку с притертой пробкой, в которую предварительно насыпано 0,3 г сухого восстановителя, приливают туда же 5 мл 12-процентной уксусной кислоты, закрывают пробирку пробкой и энергично встряхивают ее в течение точно 2 мин.

В параллельную пробирку насыпают 0,3 г сухого восстановителя и наливают 10 мл 12-процентной уксусной кислоты, закрывают ее пробкой и встряхивают в течение 2 мин. (пробирка для сравнения) при измерении оптической плотности пробы.

Через 10 мин. переливают содержимое пробирок в центрифужные пробирки и центрифугируют при 5 - 6 тыс. об./мин. в течение 5 мин. После этого проводят колориметрирование проб на ФЭКе при зеленом светофильтре (длина волны 540 нм, кюветы с рабочей длиной 10 мм). В качестве раствора для сравнения используют "холостой" раствор - раствор уксусной кислоты, обработанный сухим восстановителем, как описано выше.

В том случае, если в пробах устанавливается наличие большого содержания нитритов - свыше 20 мкг (интенсивная окраска в пробирке), их следует удалять, так как они несколько завышают результаты определения нитратов. Для удаления нитритов к диализату в стакане, соответственно 50 или 100 мл, прибавляют 2 - 4 мл 1-процентного раствора сульфаминовой кислоты, перемешивают раствор стеклянной палочкой и оставляют на 5 мин. После этого отбирают 5 мл диализата для анализа на нитраты и проводят анализ, как описано выше. При расчетах учитывают увеличение общего объема пробы.

После колориметрирования проб по соответствующим калибровочным кривым находят количество нитритов и нитратов, подставляют их в формулу для расчета (в мкг) и определяют содержание нитратов и нитритов.

Если при определении нитратов образуется очень интенсивная окраска, не укладывающаяся при определении оптической плотности в пределы калибровочной кривой, необходимо повторить определение, взяв меньшее аликвотное количество диализата для анализа, например 0,1 мл, и довести анализируемый объем до 10 мл 12-процентной уксусной кислотой. Далее провести анализ, как указано выше, учитывая при расчетах разведение этого раствора.

Однако если определяется очень высокое содержание нитратов (г/кг), необходимо повторить анализ данной пробы, соответственно уменьшая навеску и увеличивая объем дистиллированной воды для диализа. Можно также после проведения диализа в первый раз и установления высокого содержания нитратов прибавить в стакан к прежнему диализату, в котором находится мешочек с пробой, еще 100 мл дистиллированной воды и провести дополнительный диализ в течение часа. После этого взять аликвотное количество для анализа и провести анализ на нитраты. При расчетах необходимо учесть это разведение диализата, в данном случае в 2 раза, т.е. общий объем диализата при этом составил не 100, а 200 мл.

8. Расчет результатов анализа

Расчет результатов анализа проводят по формуле:

В х У

Х = ------,

А х У

где:

Х - содержание нитритов (нитрит-ионов) или нитратов (нитрат-ионов),

мг/кг;

В - содержание нитрит-ионов или нитрат-ионов, найденных по

соответствующим калибровочным кривым, мкг;

А - навеска анализируемого образца, г;

У - общий объем фильтрата, мл (соответственно 50, 100 мл или другие

объемы с учетом разведений);

У - объем фильтрата, взятый для анализа, мл (5 или 10 мл

соответственно).

Поскольку при диализе однородная равновесная концентрация минеральных солей устанавливается во всем объеме раствора (в стакане и в растворе в диализном мешочке), при расчете принимается во внимание весь взятый для анализа объем раствора или дистиллированной воды для анализа.

КОЛОРИМЕТРИЧЕСКИЙ МЕТОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ МЕТГЕМОГЛОБИНА

В КРОВИ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ ЖИВОТНЫХ

1. Принцип метода

Метод основан на сравнительном измерении оптической плотности растворов исследуемой крови с исходной концентрацией оксигемоглобина (гемоглобина) и параллельной пробы крови, в которой весь оксигемоглобин окислен до метгемоглобина феррицианидом калия, с использованием фотоэлектроколориметра при красном светофильтре.

2. Реактивы и растворы

Аммиак водный (NH OH), ГОСТ 3760-64.

Калий железосинеродистый (феррицианид калия, соль кровяная красная), ГОСТ 4206-65.

Гепарин (25000 ед.).

Трилон Б (комплексон III, хелатон, двунатриевая соль ЭДТА - двунатриевая соль этилендиаминтетрауксусной кислоты).

0,25-процентный раствор аммиака готовят, добавляя к 1 мл аммиака 99 мл дистиллированной воды. Насыщенный раствор феррицианида калия готовят, растворяя 70 г этой соли в 100 мл дистиллированной воды. Раствор можно хранить не более недели. Раствор гепарина готовят путем прибавления к 5 мл гепарина 20 мл дистиллированной воды. Раствор трилона Б готовят путем растворения 50 г препарата в 500 мл дистиллированной воды, подогревая раствор при температуре 80 °С до полного растворения. Теплый раствор фильтруют через микропористый стеклянный фильтр N 3 или 4 или через 4 слоя фильтровальной бумаги.

3. Приборы и посуда

Химические пробирки.

Пипетки на 1, 10 мл.

Химические воронки или воронки со стеклянным фильтром N 3 или 4.

Фотоэлектроколориметр.

4. Подготовка проб к анализу

Для анализа у исследуемых животных берут по 1 - 2 мл крови, помещают ее в пробирку и стабилизируют кровь, добавив туда 2 - 3 капли раствора гепарина или трилона Б, перемешивают раствор и закрывают пробирки пробками.

Анализ проб на содержание метгемоглобина лучше проводить непосредственно после доставки проб, но при необходимости стабилизированную кровь хранят в холодильнике при температуре 2 - 4 °С.

Перед исследованием кровь тщательно перемешивают.

5. Ход анализа

В 2 химические пробирки наливают по 7,3 мл 0,25-процентного раствора аммиака и добавляют по 0,2 мл исследуемой крови (из одной пробы крови). В одну из пробирок (пробирка N 2) добавляют 1 - 2 капли насыщенного раствора феррицианида калия, оставляют на 10 мин. обе пробирки, а затем определяют величину светопоглощения (экстинцию) обоих растворов, используя для сравнения 0,25-процентный раствор аммиака.

В первой пробирке (пробирке N 1) определяют величину светопоглощения

раствора крови с исходной концентрацией оксигемоглобина или, что то же,

гемоглобина, во второй (пробирка N 2) - величину светопоглощения раствора

крови, в которой весь оксигемоглобин (HbO ) превращен в метгемоглобин

(МтHb).

Как отмечено выше, содержание оксигемоглобина в исходной пробе крови соответствует содержанию гемоглобина в ней.

Поскольку в параллельной пробе крови (пробирка N 2) весь гемоглобин полностью переводится в метгемоглобин добавлением насыщенного раствора феррицианида калия, величина светопоглощения раствора с содержанием метгемоглобина практически постоянная и зависит от исходного уровня гемоглобина (оксигемоглобина).

6. Колориметрирование проб

Определение светопоглощения растворов крови в обеих пробирках проводят на фотоэлектроколориметре (ФЭК) при красном светофильтре. У ФЭК различных марок длина волны, соответствующая максимуму пропускания при красном светофильтре, бывает различной. Так, у ФЭК-56 при работе с красным светофильтром N 8 длина волны составляет 597 нм, у спектрофотоэлектроколориметров ФЭК-56 ПМ и ФЭК-КФК-2 длины волн при работе с красным светофильтром лежат в интервале 600 - 670 нм.

Определение светопоглощения растворов крови в обеих пробирках проводят с использованием ФЭК различных марок при красном светофильтре в вышеприведенном интервале длин волн, используя для сравнения 0,25-процентный раствор аммиака, в кюветах с рабочей длиной 10 мм.

Различия, связанные с измерением экстинций растворов крови при

различающихся длинах волн при работе на ФЭК различных марок, корригируются

путем введения в расчетную формулу коэффициента - величины приведенной

экстинции раствора крови с исходным уровнем оксигемоглобина (Е HbO

привед.), как показано в разделе, - расчет результатов анализа. При расчете

этой приведенной величины используют измеренные опытным путем величины

светопоглощения раствора крови с исходным уровнем оксигемоглобина (Е HbO )

- пробирка N 1 и величины светопоглощения раствора крови с предельным

содержанием метгемоглобина (Е МтHb) - пробирка N 2.

7. Расчет результатов анализа

Предварительно опытным путем на большой группе животных двух видов

установлена средняя величина светопоглощения раствора крови с исходным

уровнем оксигемоглобина (Е HbO ) и средняя величина светопоглощения

раствора крови с полученным уровнем метгемоглобина (Е МтHb) для овец и

коров.

В пробах крови овец первая величина (Е HbO ) составила 0,15, вторая

(Е МтHb) - 0,57; для крупного рогатого скота эти величины составляют

соответственно 0,17 и 0,79.

Поскольку гемоглобин в пробе крови полностью переводится в метгемоглобин добавлением насыщенного раствора феррицианида калия, изменение светопоглощения, равное 0,42 (0,57 - 0,15) для овец и 0,62 (0,79 - 0,17) для крупного рогатого скота, соответствует 100% содержания метгемоглобина.

Все эти данные были необходимы для выведения коэффициентов при расчете содержания метгемоглобина в крови животных по данной методике.

По методике проводят определение светопоглощения растворов исследуемой крови с исходным уровнем оксигемоглобина (пробирка N 1) и полученным уровнем метгемоглобина (пробирка N 2) и рассчитывают содержание метгемоглобина в крови по нижеприведенным формулам, используя установленные коэффициенты и расчетное приведенное значение светопоглощения раствора оксигемоглобина с учетом коррекции измерения этой величины при красном светофильтре с различающимися длинами волн:

Х = (Е - Е ) х 2,38 х 100 (1) для овец,

2 1

Х = (Е - Е ) х 1,61 х 100 (2) для крупного рогатого скота,

2 1

где:

Х - содержание метгемоглобина в исследуемой пробе крови, %;

Е - приведенное значение светопоглощения раствора оксигемоглобина

(Е HbO ), расчет его приводится ниже;

Е - среднее значение величины светопоглощения раствора

оксигемоглобина, равное 0,15 для овец и 0,17 для крупного рогатого скота;

2,38 и 1,61 - расчетные коэффициенты, найденные из средних величин

светопоглощения растворов оксигемоглобина и метгемоглобина для овец и

крупного рогатого скота (расчет их также приводится далее).

Значение Е - приведенное значение светопоглощения раствора

оксигемоглобина (Е HbO = Е ) - находят из пропорции с использованием

2 2

измеренных величин светопоглощения раствора крови с исходным содержанием

оксигемоглобина (пробирка N 1) и метгемоглобина (пробирка N 2) в опыте.

Е Е Е х Е

2 4 3 4

-- = --, откуда Е = -------,

Е Е 2 Е

3 5 5

где:

Е - искомая величина - приведенное значение оптической плотности

раствора оксигемоглобина;

Е - среднее значение оптической плотности раствора метгемоглобина,

соответственно 0,57 для овец для расчета Е в формулу (1) и 0,79 для

крупного рогатого скота в формулу (2);

Е - измеренное значение оптической плотности раствора оксигемоглобина

(пробирка N 1);

Е - измеренное значение оптической плотности раствора метгемоглобина

(пробирка N 2).

Значение Е подставляют в формулу (1) или (2) для расчета содержания

метгемоглобина в крови овец или крупного рогатого скота.

Если приведенное значение оптической плотности раствора оксигемоглобина

(Е ) будет равно или меньше средней величины оптической плотности раствора

оксигемоглобина (Е в формулах N 1 и 2), что объясняется индивидуальными

колебаниями содержания гемоглобина в крови, содержание метгемоглобина в

крови в этом случае будет равно или меньше 2,38 для овец и 1,61 для

крупного рогатого скота.

Коэффициенты 2,38 и 1,61 были рассчитаны из средних показателей оптической плотности растворов метгемоглобина и оксигемоглобина в крови овец и коров соответственно по формулам:

100 х 0,01 100 х 0,01

---------- = 2,38, ---------- = 1,61,

0,42 0,62

где:

0,42 - изменение светопоглощения растворов крови овец с содержанием мет- и оксигемоглобина (0,57 - 0,15), соответствующее 100-процентному содержанию метгемоглобина в крови овец;

0,01 - наименьший показатель оптической плотности, т.е.:

0,42 - 100

0,01 - Х.

Подобным образом рассчитан коэффициент для крупного рогатого скота.

ФОТОКОЛОРИМЕТРИЧЕСКИЙ ГЕМОГЛОБИНЦИАНИДНЫЙ МЕТОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ

МЕТГЕМОГЛОБИНА КРОВИ ЖИВОТНЫХ, В ТОМ ЧИСЛЕ ПТИЦЫ

Метод предназначен для химико-токсикологических, клинических и других исследований свернувшейся (сгустков) и несвернувшейся (цельной) крови на долю метгемоглобина в процентах по отношению к общему гемоглобину.

Методы основаны на уменьшении величины оптической плотности содержащегося в исследуемом растворе крови метгемоглобина (гемоглобина) вследствие перевода его в цианметгемоглобин (гемоглобинцианид) и вычисления процентного соотношения этой величины к такому же показателю 100-процентного метгемоглобина того же раствора крови.

Принцип определения - фотоколориметрический по прямому определению

630

(установлению) величины уменьшения оптической плотности (Д ДЕЛЬТА) раствора

крови в одной кювете.

Погрешность метода - не более 0,075% при нормальном и 0,227% при 71,1-процентном содержании метгемоглобина от общего гемоглобина.

Выявляемость метода при оптической плотности 0,001 составляет не более 0,3%.

1. Оборудование, реактивы и растворы

1.1. Оборудование:

колориметр-нефелометр фотоэлектрический типа ФЭК-56 М или другие приборы подобного типа с наличием светофильтра с длиной волны 625 - 670 нм;

центрифуга лабораторная на 4 - 8 тыс. об./мин. типа ЦЛН-2 или ЦУМ-1 и др.;

колбы мерные вместимостью 25 куб. см;

пипетки на 1, 5 и 10 куб. см;

стаканчики стеклянные на 50 куб. см;

пипетки глазные;

палочки стеклянные или пластмассовые.

1.2. Реактивы и растворы:

ацетонциангидрин по ТУ 6-09-3558-81 или ГОСТ 13198-77, 10-процентный раствор (объем/объем). Годен до 1 года;

вода дистиллированная по ГОСТ 6709-72;

калий железосинеродистый (соль красная кровяная) по ГОСТ 4206-75, х.ч., 10-процентный раствор. Годен 30 дней при хранении в темном месте.

2. Подготовка к анализу

2.1. Приготовление раствора крови.

2.1.1. Из сгустка крови. От свежего трупа животного (в том числе птицы) или из патматериала (из сердца, крупных сосудов) берут в стаканчик сгусток крови массой около 1 г, добавляют 9 куб. см воды и сгусток тщательно разминают чистым никелированным пинцетом до обесцвечивания комков фибрина. Затем комки фибрина удаляют, а в стаканчик с гемолизатом эритроцитов приливают 15 куб. см воды.

2.1.2. Из цельной крови. В мерную колбу на 25 куб. см наливают около 20 куб. см воды, 1 куб. см (точно) гепаринизированной (декальцинированной трилоном Б или оксалатной) крови, промывают внутренний канал пипетки несколько раз содержимым колбы (избегая образования пены), объем гемолизата эритроцитов в колбе доводят водой до метки и тщательно перемешивают (разведение крови в 25 раз).

2.1.3. Гемолизаты из стабилизированной крови или сгустка крови переносят в капроновые центрифужные патроны, центрифугируют 15 - 20 мин. при 8 тыс. об./мин. и исследуют не позднее 1 ч после центрифугирования.

3. Проведение анализа

3.1. Устанавливают в рабочее положение светофильтр с длиной волны 630 нм. В левый кюветодержатель помещают 10-миллиметровую кювету с водой, а в правый - такую же кювету с 4 куб. см центрифугата раствора крови и устанавливают правый измерительный барабан прибора точно на ноль (по красной шкале). Открывают световое окно с помощью рукоятки шторки и вращением левого барабана добиваются установки стрелки микроамперметра на ноль.

В кювету с раствором крови вносят одну каплю раствора ацетонциангидрина

(АЦГ) и перемешивают содержимое кюветы стеклянной палочкой. При этом

взаимодействие метгемоглобина с АЦГ с образованием цианметгемоглобина

заканчивается через 2 - 3 мин. Через 2 - 3 мин. после прибавления раствора

АЦГ открывают световое окно прибора и правым измерительным барабаном

устанавливают стрелку микроамперметра на ноль. По красной шкале правого

630

барабана отсчитывают показатель уменьшения оптической плотности (Д ДЕЛЬТА)

раствора крови.

3.2. Правую кювету освобождают от содержимого и 4 - 5 раз тщательно промывают водой. Затем ополаскивают кювету 0,5 куб. см раствора крови, наливают 4 куб. см того же раствора крови и устанавливают кювету в правый кюветодержатель. К раствору крови в кювете добавляют одну каплю 10-процентного раствора красной кровяной соли (ККС), перемешивают другой чистой стеклянной палочкой и оставляют стоять 3 мин. За это время весь кровяной пигмент превращается в метгемоглобин.

Устанавливают правый измерительный барабан точно на ноль, а левый (не открывая светового окна) устанавливают на отметку 0,4 - 0,6 по красной шкале. Открывают шторку светового окна и левым барабаном точно устанавливают стрелку микроамперметра на ноль.

К раствору крови в кювете прибавляют одну каплю раствора АЦГ, содержимое кюветы перемешивают стеклянной палочкой, устанавливают первый барабан на отметку 0,4 (грубая наводка, без открытия светового окна).

Через 2 - 3 мин. после прибавления раствора АЦГ открывают световое окно

и устанавливают правым измерительным барабаном стрелку микроамперметра на

ноль. По красной шкале правого барабана снимают показатель уменьшения

630

оптической плотности (Д ДЕЛЬТА) раствора крови, в котором весь гемоглобин

был переведен в метгемоглобин.

4. Обработка результатов

4.1. Долю метгемоглобина (в %) к общему гемоглобину (общему пигменту) крови вычисляют по формуле:

630

Д ДЕЛЬТА х 100

MetHb = ---------------,

630

Д ДЕЛЬТА

где:

630

Д ДЕЛЬТА - показатель уменьшения оптической плотности раствора крови

после прибавления АЦГ;

630

Д ДЕЛЬТА - показатель уменьшения оптической плотности 100-процентного

метгемоглобинового раствора крови после прибавления АЦГ.

5. Оценка результатов

5.1. Для постановки диагноза при отравлении животных и птицы метгемоглобинобразующими ядами определение доли метгемоглобина к общему гемоглобину является решающим диагностическим показателем.

Обнаружение в крови более 30% метгемоглобина указывает на возможность отравления, а более 60% - на возможную причину падежа животного от отравления метгемоглобинобразующими веществами (ядами).

5.2. Обнаружение в крови животного нормального содержания (до 5%) метгемоглобина исключает потребность проведения химико-токсикологических исследований патматериала на метгемоглобинобразующие вещества (нитриты, бертолетову соль, красную кровяную соль, анилин и др.). Однако для исключения отравления животных нитрат-ионами (без их редукции в нитриты) необходимо патматериал исследовать на нитраты.