Утверждаю

Заместитель Главного

государственного санитарного

врача СССР

В.Е.КОВШИЛО

27 марта 1986 г. N 4083-86

ВРЕМЕННЫЕ ГИГИЕНИЧЕСКИЕ НОРМАТИВЫ

И МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СОДЕРЖАНИЯ ГИСТАМИНА

В РЫБОПРОДУКТАХ <*>

СанПиН 42-123-4083-86

--------------------------------

<*> Данными Нормативами рекомендуется пользоваться в случаях, когда имеются нарушения условий и сроков хранения рыбопродукции с целью профилактики пищевых отравлений гистаминной этиологии, а также в процессе расследования случаев пищевых отравлений.

Настоящие правила разработаны и утверждены на основе Положения о государственном санитарном надзоре в СССР (п. 7а), утвержденного Постановлением Совета Министров СССР от 31.05.73 N 361.

Нарушение санитарно-гигиенических и санитарно-противоэпидемических правил и норм влечет дисциплинарную, административную или уголовную ответственность в соответствии с законодательством Союза ССР и союзных республик (ст. 18).

Государственный санитарный надзор за соблюдением санитарно-гигиенических и санитарно-противоэпидемических правил и норм государственными органами, а также всеми предприятиями, учреждениями и организациями, должностными лицами и гражданами возлагается на органы и учреждения санитарно-эпидемиологической службы Министерства здравоохранения СССР и министерств здравоохранения союзных республик (ст. 19) (Основы законодательства Союза ССР и союзных республик о здравоохранении, утвержденные Законом СССР от 19 декабря 1969 г. и введенные в действие с 1 июля 1970 г.).

В целях охраны здоровья населения СССР устанавливаются временные гигиенические нормативы и метод определения содержания гистамина в рыбопродуктах.

Гистамин (бета-имидазолэтиламин или 2-аминоэтилимидазол) является широко распространенным биогенным амином, повышенное накопление которого в некоторых продуктах питания при определенных условиях может служить причиной пищевых отравлений.

    N----C--CH --CH

    ││  ││   2   | 2

    HC  CH       NH

     \  /          2

      NH

Гистамин является естественной составной частью продуктов питания, так как в процессе жизнедеятельности он образуется в различных тканях животных. Естественное содержание гистамина невелико и не оказывает неблагоприятного воздействия на организм. Гистамин образуется в продуктах в результате декарбоксилирования гистидина при участии ферментов микрофлоры, развивающейся при нарушении условий хранения. Среди микробов, ответственных за процесс декарбоксилирования гистидина, отмечают многих представителей семейства Enterobacteriacea (Echerichia, Enterobacter, Schigella, Salmonella, Proteus) и некоторые виды, принадлежащие к Pseudomonas, Streptococcus, Lactobacillus, Clostridlum, Vibrio.

Накопление гистамина в рыбе может происходить в период от вылова до замораживания, особенно, если рыба в этот период хранится без охлаждения. Возможно накопление гистамина в рыбе при нарушении цепи холодильного хранения и несоблюдении технологии оттаивания и сроков хранения перед термической обработкой. В этих случаях в мышечной ткани некоторых видов рыб, особенно тунцов, скумбрии и некоторых других может происходить накопление гистамина до токсических уровней. В подавляющем большинстве случаев зарегистрированные вспышки гистаминовых отравлений были обусловлены использованием рыбы из семейства скумбриевых, содержащей большое количество гистамина, и продуктов из нее.

Скрытый период отравления рыбой с повышенным содержанием гистамина обычно составляет менее одного часа, но может колебаться в зависимости от индивидуальных различий от 5 мин. до 5 ч. Симптомы гистаминовой интоксикации весьма характерны. Пострадавшие отмечают резкий или горький (перечный) вкус пищи, наблюдаются покраснение лица и шеи с чувством жара и общего дискомфорта, сильные головные боли, слезотечение, боли в глазах, отек слизистой оболочки носа. Иногда отмечаются нарушения сердечного ритма, жжение в полости рта и глотки, затруднение глотания. Появляются сыпь на лице и шее, зуд кожи. У части пострадавших отмечаются желудочно-кишечные расстройства, боли в животе, тошнота, понос. В тяжелых случаях наблюдаются шок, бронхоспазмы, удушье и расстройства дыхания.

Предел переносимости гистамина для взрослого человека составляет 5 - 6 мг/кг веса тела. Токсическая доза находится в пределах > 100 - 1000 мг/кг продукта и высокотоксичная - свыше 1 г/кг.

Временная предельно допустимая концентрация гистамина в рыбопродуктах установлена на уровне 100 мг/кг с учетом практики международного законодательства (Финляндия, Чехословакия, США, Швеция и др.).

В случае обнаружения гистамина в рыбе, содержание которого превышает предельно допустимую концентрацию, ее следует направлять на рыбообрабатывающие предприятия для изготовления рыбопродукции, где по технологии предусматриваются разбавление (фаршевые изделия) или подсортировка с другими видами рыб (консервы). При этом среднее содержание гистамина в продуктах, поступающих для питания, не должно превышать 100 мг/кг массы рыбы.

Метод определения содержания гистамина в рыбопродуктах

В основе метода определения гистамина лежит измерение интенсивной флуоресценции производного, полученного при взаимодействии гистамина с о-фталевым альдегидом.

Предел обнаружения метода - 0,1 мг/кг, относительное стандартное отклонение - 0,20 - 0,30. Степень извлечения добавленного к образцу стандарта гистамина - 65 - 85%. Продолжительность анализа - 3 ч.

Метод включает следующие этапы:

- подготовку образца к анализу; экстракцию метанолом;

- очистку экстракта с помощью ионообменной хроматографии;

- построение калибровочной кривой;

- количественное определение гистамина.

Методические рекомендации предназначены для лабораторий институтов гигиенического профиля и санитарно-эпидемиологических станций для определения содержания гистамина в рыбопродуктах.

Оборудование и материалы

1. Мясорубка по ГОСТ 4025-83Е.

2. Микроразмельчитель тканей РТ-2 по МРТУ 64.1.-1505-63.

3. Весы технические по ГОСТ 24104-80Е.

4. Весы аналитические по ГОСТ 24104-80Е.

5. Спектрофотометр СПЕКОЛ (Карл Цейсс ИЕНА) с измерительной приставкой для определения флуоресценции. Светофильтры: первичный лямбда = 365 нм, вторичный лямбда = 465 нм. Возможно использование отечественного флуориметра БИАН-130 (светофильтры: первичный лямбда = 365 нм, вторичный лямбда = 470 нм).

6. Баня водяная с нагревателем.

7. Термометр 0 - 100 °C по ГОСТ 2045-71.

8. Колонка хроматографическая стеклянная 60 х 30 мм.

9. Колбы конические плоскодонные на 50 мл с НШ 14,5, на 100 мл с НШ 29 по ГОСТ 23932-79Е.

10. Колбы мерные на 50, 100, 250 мл по ГОСТ 1770-74Е.

11. Дефлегматорная насадка по ГОСТ 23932-79Е.

12. Стаканы химические на 500 мл.

13. Цилиндры мерные на 50 мл по ГОСТ 1770-74Е.

14. Воронки химические диаметром 60 мм по ГОСТ 23932-79Е.

15. Пипетки на 2, 5, 10 мл по ГОСТ 20292-74Е.

16. Бумага фильтровальная по ГОСТ 12026-76.

17. Ионообменная смола Анионит АРА-12п (Cl-форма; фракция 0,25 - 0,10 мм) по ТУ 6-09-10-818-73. Для перевода смолы в OH-форму 100 г ее помещают в химический стакан, заливают 150 мл 2 н едкого натра, перемешивают и оставляют на 30 мин. Сливают жидкость и вновь добавляют щелочь. Повторяют процедуру промывания дважды. Тщательно отмывают смолу дистиллированной водой до pH 7 - 8. Смолу хранят под водой.

После проведения анализа смолу регенерируют следующим образом: заливают 1 н соляной кислотой, выдерживают 10 - 15 мин., раствор сливают. Обработку смолы кислотой повторяют дважды. Промывают дистиллированной водой до нейтральной реакции и переводят смолу в OH-форму, как описано выше.

18. Фталевый альдегид "ч" по МРТУ 6-09-5387-68.

19. Соляная кислота "чда" по ГОСТ 3118-77.

20. Ортофосфорная кислота "ч" по ГОСТ 6552-80.

21. Натр едкий "чда" по ГОСТ 4328-77.

22. Метиловый спирт "хч" по ГОСТ 6995-77.

23. Гистамин или хлоргидрат гистамина.

24. Вода дистиллированная по ГОСТ 6709-72.

1. Подготовка образца к анализу

1.1. Отбор образцов для анализа и хранение их

От правильности осуществления этого этапа контроля в значительной степени зависят достоверность полученных данных по содержанию в анализируемом продукте гистамина и объективность гигиенической оценки его. При исследовании рыб, продуктов из них, пищевых продуктов из морских животных эта задача является весьма важной и требует соответствующей предварительной подготовки. Как известно, отбор проб пищевых продуктов слагается из нескольких этапов: отбора транспортных упаковок, отбора пробы и навесок для анализа.

Каждая из перечисленных операций должна производиться в строгом соответствии с требованиями ГОСТов на исследуемые продукты: ГОСТ 7631-73 "Рыба, продукты из рыбы, морских млекопитающих и беспозвоночных" (с. 12 - 17) и ГОСТ 8756-70 "Продукты пищевые консервированные" (с. 1 - 5).

Отобранные в соответствии с указанным образцы рыбы, продуктов из рыб, морских млекопитающих и беспозвоночных, подлежащих исследованию, упаковывают каждый в отдельности в пергаментную бумагу или в целлофан, затем в плотную оберточную бумагу и перевязывают бечевкой, для этой цели можно использовать также чистые стеклянные банки с притертыми стеклянными или плотными корковыми пробками. Образцы доставляют в лабораторию сразу же после отбора, в случае длительной транспортировки их охлаждают до температуры +2 - 4 °C, используя для этой цели холодильники или соответствующие приспособления.

К исследованию образцов следует приступить в день доставки их в лабораторию. При отсутствии такой возможности образцы должны храниться при температуре, предусмотренной для хранения данной продукции, не более 3 сут. со времени отбора среднего образца.

1.2. Подготовка образца к исследованию

Рыбу, отобранную для исследования, размораживают, очищают от механических загрязнений и чешуи. Обмывание рыбы не допускается.

Для исследования крупной рыбы берут только мясо без кожи и костей. Для этого от рыбы отделяют голову и плавники, разрезают тушку по брюшку и удаляют все внутренности; разрезают продольным разрезом по спинке и удаляют позвоночник и, по возможности, все ребра, а мясо вместе с подкожным жиром тщательно соскабливают с кожи. Мелкую рыбу исследуют целиком.

При весе каждого неразделанного экземпляра рыбы свыше 500 г после разделки берут для дальнейшего измельчения только одну продольную половину рыбы.

При весе одной продольной половины рыбы свыше 1 кг ее разрезают на поперечные куски шириной 2 - 4 см и берут для анализа мясо от половины всего числа кусков через один.

Мелкую неразделанную рыбу или пробу мяса от крупной рыбы дважды пропускают, как можно быстрее, через мясорубку; фарш тщательно перемешивают и из разных мест отбирают навеску в соответствии с прописью избранного метода.

При исследовании консервов из рыб или морских животных из содержимого всех банок, выделенных в качестве среднего образца, после определения соотношения составных частей (жидкой и твердой) готовят одну общую пробу. Специи (лук, перец и др.) должны быть удалены из рыбы. Твердую часть консервов быстро пропускают два раза через мясорубку, смешивают с жидкой частью и растирают по частям в фарфоровой ступке до состояния однородной массы. Консервы, имеющие заливку, рассол, можно измельчать на аппарате "Измельчитель тканей". Из подготовленной таким образом пробы отбирают навески для последующих определений.

Средние образцы продукции сохраняются в холодильнике до конца анализа; в случае обнаружения гистамина в количестве выше установленной гигиенической нормы - до вручения результатов исследований в соответствующие учреждения и принятия необходимых профилактических мер.

2. Экстракция

Навеску 10 г (с точностью 0,01 г) приготовленного образца помещают в сосуд микроразмельчителя тканей, добавляют 25 мл метанола и перемешивают 5 мин. Полученную смесь переносят в плоскодонную коническую колбу на 100 мл, ополаскивают сосуд смесителя 15 - 20 мл метанола, сливают в колбу, снабженную дефлегматором, и нагревают на водяной бане до 60 °C 15 мин.; затем охлаждают до комнатной температуры и фильтруют через складчатый бумажный фильтр в мерную колбу на 50 мл. Осадок промывают метанолом и доводят до метки объем экстракта. Метанольный экстракт можно хранить в холодильнике несколько недель.

3. Очистка экстракта

В стеклянную хроматографическую колонку (60 х 30 мм) заливают суспензию ионообменной смолы Анионит АРА-12п до образования столбика высотой 40 мм и промывают 20 мл дистиллированной воды. (Вода должна покрывать смолу постоянно).

Наносят 5 мл метанольного экстракта, добавляют 5 мл 1 н соляной кислоты, пропускают через колонку и элюируют дистиллированной водой до получения 35 мл элюата. Элюат следует хранить в холодильнике.

4. Построение калибровочной кривой

Для приготовления основного раствора, содержащего 10 мкг/мл гистамина, 2,5 мг гистамина растворяют в 0,1 н соляной кислоте в мерной колбе на 250 мл. 1, 2 и 3 мл основного раствора помещают в мерные колбы на 100 мл, доводят 0,1 н соляной кислотой до метки и получают рабочие растворы с концентрациями 0,1 мкг/мл, 0,2 мкг/мл и 0,3 мкг/мл соответственно.

Основной раствор гистамина хранят в холодильнике неделю, рабочие растворы готовятся ежедневно.

    10 мл  каждого  рабочего  раствора  вносят в колбы на 50 мл,  добавляют

10 мл  0,1 н  соляной кислоты,  3 мм  1 н  едкого натра  и  смешивают.  При

перемешивании вносят 1 мл 0,1% метанольного раствора о-фталевого альдегида,

через 4 мин.  добавляют 3 мл 3,47 н фосфорной кислоты  и оставляют на 1,5 ч

при  комнатной  температуре.  Измеряют  интенсивность флуоресценции рабочих

стандартных   растворов   гистамина    при   лямбда             =  365  нм,

                                                   возбуждения

лямбда        = 465  нм.    На   основании   полученных   данных   строится

      эмиссии

калибровочная    кривая    зависимости   интенсивности   флуоресценции   от

концентрации гистамина в растворе. Каждое деление оси абсцисс соответствует

0,02 мкг гистамина в 1 мл раствора.

5. Количественное определение гистамина в рыбопродуктах

10 мл элюата вносят в колбу на 50 мл, добавляют 10 мл 0,1 н соляной кислоты и перемешивают. Далее проводят процедуру, описанную в п. 4 "Построение калибровочной кривой".

Если образцы содержат гистамина более 100 мг/кг рыбы, необходимо взять 1 мл элюата, добавить 10 мл 0,1 н соляной кислоты и далее повторить процедуру количественного определения гистамина.

Для количественного определения содержания гистамина используется калибровочная кривая.

Содержание гистамина в рыбе Г (в мг/кг) вычисляется по формуле:

                                С  х А х В х Ф

                                 о

                            Г = --------------,

                                     Б х Р

    где:

    С  -  концентрация   гистамина   в  растворе  образца,   найденная   по

     о

калибровочной кривой, мкг/мл;

    Р - навеска образца для анализа в г (10 г);

    А - объем метанольного экстракта в мл (50 мл);

    Б - количество метанольного экстракта,  пропущенного через колонку в мл

(5 мл);

    В - объем элюата в мл (35 мл);

                           мл элюата + мл 0,1 н HCl

    Ф - фактор разведения: ------------------------.

                                  мл элюата