Утверждена

Начальником Управления

по внедрению новых

лекарственных средств

и медицинской техники

Э.А.БАБАЯНОМ

27 ноября 1985 года

МЕТОДИКА

ОПРЕДЕЛЕНИЯ ТОКСИЧЕСКОГО ДЕЙСТВИЯ ВЫТЯЖЕК ИЗ МАТЕРИАЛОВ

И ИЗДЕЛИЙ НА ПОЛОВЫХ КЛЕТКАХ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА

В связи со все увеличивающимся объемом разработок новых материалов и изделий особое значение приобретает разработка экспресс-методов на биологических тест-объектах и тест-системах. Эти методы можно применять в следующих случаях: а) при отборе оптимальных лабораторных образцов материалов и изделий на первом этапе их разработки; б) при оценке различных технологий переработки материалов в изделие; в) при выборе оптимального способа стерилизации изделия; г) при незначительном изменении рецептуры материала; д) при изменении сферы применения хорошо изученного материала.

1. ПРИНЦИП МЕТОДИКИ

Визуально под микроскопом наблюдают двигательную активность сперматозоидов быка, подвергавшихся воздействию водных экстрактов из полимерных материалов, до полного прекращения прямолинейно-поступательного движения.

2. ТЕСТ-ОБЪЕКТ

В качестве биологического тест-объекта экспресс-метода используется замороженная в парах жидкого азота гранулированная сперма быка. Сперму замораживают в виде гранул весом 0,1 - 0,2 г. При низкотемпературной консервации обменные процессы в сперме полностью приостанавливаются. Замороженную сперму можно получать на станциях искусственного осеменения или в Республиканском банке семени Госагропрома СССР.

3. ЭТАПЫ ВЫПОЛНЕНИЯ

3.1. Приготовление опытной и контрольной проб

Для определения степени токсичности вытяжку необходимо сравнивать с контрольным раствором. Контрольной пробой служит глюкозо-цитратная среда (состав среды: глюкоза - 4 г, цитрат натрия - 0,58 г, вода дистиллированная до 100 мл). Опытным образцом является водный экстракт из полимерного материала или изделие, приготовленное в соответствии с научно-методическими документами для данного вида изделий. Изотонию достигают путем добавления сухих реактивов глюкозы (4 г) и цитрата натрия (0,58 г) на 100 мл вытяжки.

3.2. Приготовление пробы спермы

Перед оттаиванием замороженной спермы отмеривают пипеткой в пробирку 0,5 мл контрольной пробы. Четыре пробирки с глюкозо-цитратной средой ставят в водяную баню при температуре +40 °C. Охлажденным до температуры жидкого азота длинным анатомическим пинцетом извлекают из сосуда Дьюара гранулу спермы и быстро опускают в нагретый раствор. В одной пробирке оттаивают только одну гранулу спермы. Сразу после оттаивания содержимое пробирок сливают в одну колбочку и тщательно перемешивают (маточный раствор).

3.3. Ход определения

Из маточного раствора оттаянной разбавленной спермы добавляют 0,3 мл суспензии сперматозоидов в 1 мл опытного образца. Аналогично поступают и с контрольной пробой. Конечная концентрация сперматозоидов в образцах - 6 - 7 млн/мл. Все пробирки с опытными и контрольными растворами должны быть помещены в водяную баню при температуре + 40 °C в течение всего эксперимента.

3.4. Оценка результатов

Главным критерием оценки функционального состояния сперматозоидов принимается длительность их движения. Оценка подвижности производится микроскопированием капли спермы из опытных и контрольных проб каждые 10 - 15 минут. Предметный столик микроскопа должен быть постоянно нагрет до температуры +40 °C. Время подвижности сперматозоидов определяется как среднее между двумя последними измерениями, из которых первое определение регистрирует наличие хотя бы одной - двух поступательно-подвижных клеток, а второе - полное прекращение поступательного движения.

Степень токсичности испытуемого раствора определяется отношением величин времени подвижности сперматозоидов в опыте и контроле:

                             опыт

                        Т = ------ x 100,

                            контр.

где:

Т - степень токсичности;

опыт - время подвижности сперматозоидов в испытуемом растворе;

контр. - время подвижности сперматозоидов в контрольном растворе.

Результаты опытов обрабатываются статистическим методом парных сравнений по Стьюденту.