Утверждена

Начальником Управления

по внедрению новых

лекарственных средств

и медицинской техники

Э.А.БАБАЯНОМ

27 ноября 1985 года

МЕТОДИКА

ОПРЕДЕЛЕНИЯ БИОСОВМЕСТИМОСТИ ПОЛИМЕРНЫХ МАТЕРИАЛОВ

И ИЗДЕЛИЙ ДЛЯ ЭНДОПРОТЕЗИРОВАНИЯ ПО ИХ ВЛИЯНИЮ

НА ЛИМФОИДНУЮ ТКАНЬ

В связи со все увеличивающимся объемом разработок новых материалов и изделий особое значение приобретает разработка экспресс-методов на биологических тест-объектах и тест-системах. Эти методы можно применять в следующих случаях: а) при отборе оптимальных лабораторных образцов материалов и изделий на первом этапе их разработки; б) при оценке различных технологий переработки материалов в изделие; в) при выборе оптимального способа стерилизации изделия; г) при незначительном изменении рецептуры материала; д) при изменении сферы применения хорошо изученного материала.

1. ОБЩИЕ ПОЛОЖЕНИЯ

При непосредственном введении материалов во внутреннюю среду организма способность их вызывать состояние сенсибилизации иммунокомпетентных систем во многом определяет степень совместимости материала с организмом (биосовместимость).

Современная неинфекционная иммунология располагает методами, позволяющими оценить степень биосовместимости вживляемых материалов по характеру их влияния на органы иммунитета, представляемые в организме лимфоидной тканью.

Настоящая Методика предполагает комплекс методов оценки состояния лимфоидной ткани при имплантации синтетических материалов. Эти методы апробированы и адаптированы к задачам токсикологической оценки полимеров медицинского назначения.

Комплекс предлагаемых методов предназначается для использования в качестве экспресс-метода оценки биосовместимости при отборе перспективных для медицины полимерных материалов, а также в качестве этапа токсикологического изучения при гигиенической оценке материалов и изделий, длительно контактирующих с внутренними средами организма.

2. ПЕРЕЧЕНЬ МАТЕРИАЛОВ И ИЗДЕЛИЙ, ПОДЛЕЖАЩИХ ОЦЕНКЕ

НА БИОСОВМЕСТИМОСТЬ

2.1. Материалы для пластики тканей, изготовления эндопротезов или частей и деталей к ним.

2.2. Клеи медицинского назначения.

2.3. Шовные и перевязочные материалы.

2.4. Материалы для микрокапсулирования лекарственных средств.

2.5. Крове- и плазмозаменители.

3. ПОДГОТОВКА МАТЕРИАЛОВ К ИССЛЕДОВАНИЮ

3.1. Твердые материалы должны иметь форму, удобную для имплантации. Предпочтительна форма в виде бруска, имеющего размеры 6 x 4 x 2 мм (грани бруска и углы не должны быть острыми).

3.2. Жидкие, порошкообразные и вспенивающиеся материалы готовятся для имплантации в виде порций по 0,5 куб. см (0,5 мл).

3.3. Тканые и пленочные материалы должны иметь размеры 10 x 10 кв. мм.

3.4. Все материалы, подлежащие оценке на биосовместимость, должны быть стерильны. Способ стерилизации должен соответствовать ОСТ 42-21-2-85 "Стерилизация и дезинфекция изделий медицинского назначения", отобранному для данного вида изделий.

4. УСЛОВИЯ ПРОВЕДЕНИЯ ЭКСПЕРИМЕНТА

4.1. Вид животных: белые крысы - самцы линии Вистор или беспородные.

4.2. Количество групп животных в эксперименте должно быть не менее четырех: а) подопытная; б) контроль интактный; в) контроль ложнооперированный; г) контрольная имплантация традиционного биосовместимого материала.

4.2.1. В качестве традиционного биосовместимого материала при оценке нерассасывающихся имплантатов следует применять тефлон, для рассасывающихся - кетгут, для кровезаменителей - поливинилпирролидон мол. массы 12600, для порошкообразных - порошок тефлона или кетгута, для сплавов - сплав КХС.

4.3. Количество животных в группе - не менее 6 голов.

4.4. Продолжительность эксперимента - 1 месяц.

4.5. Сроки взятия лимфоидных органов - через 2 недели и через 4 недели после имплантации.

4.6. Техника операции: под нембуталовым наркозом (доза 40 мг/кг) на наружной поверхности верхней трети бедра крысы делается разрез кожи длиной около 1 см. Анатомическим глазным пинцетом расчленяется бедренная мышца (вдоль волокон), в которой при помощи того же пинцета формируется карман. Изучаемый материал помещается в этот карман. На мышцу накладывается один шов, на кожу два шва. Применяется хирургический шелк высоких номеров.

Одной из контрольных групп животных имплантируется биосовместимый материал, другой - производится ложная операция (те же манипуляции без имплантации материала).

4.6.1. В случае изучения жидких или вспенивающихся материалов имплантация производится инъекционным способом.

5. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ЛИМФОИДНОЙ ТКАНИ

5.1. Патоморфологический анализ отпечатков лимфатических узлов.

5.1.1. Взятие материала и приготовление отпечатков.

Животные забиваются методом декапитации. При вскрытии извлекается правый (регионарный к месту имплантации) и левый (отдаленный) лимфоузлы, освобождаются от жировой ткани и острым лезвием перерезаются поперек. При помощи пинцета половинка узла прикладывается несколько раз к обезжиренному предметному стеклу поверхностью среза.

Отпечатки высушиваются на воздухе при комнатной температуре, затем фиксируются метанолом в течение двух минут (или спиртом-ректификатом в течение 15 мин.) и промываются проточной водой. Окраска отпечатков производится стандартными растворами красителей Май-Грюнвальд (в течение 4 мин.) и азур-эозиновой смесью (10 мл красителя на 100 мл дистиллированной воды); окрашивать в течение 45 - 60 мин.

5.1.2. Проведение анализа отпечатков и техника оформления получаемых результатов.

Отпечатки изучаются под микроскопом с применением иммерсии. В отпечатках производится подсчет иммунокомпетентных клеток: малых лимфоцитов, бластов, зрелых плазматических клеток и ретикулярных клеток, а также количество делящихся клеток (митозов).

Подсчет клеток производится в 10 полях зрения, и в дальнейшем принимаются во внимание средние (М) из 10 полей зрения показатели для каждого из видов клеток. Поля зрения берутся в разных частях отпечатков, преимущественно в парокортикальных зонах и у основания мозговых тяжей.

Запись протокола подсчета клеток производится по нижеприведенному образцу (табл. 1).

Таблица 1

ОБРАЗЕЦ ЗАПИСИ ПРОТОКОЛА ПОДСЧЕТА ВИДОВ КЛЕТОК

5.2.1. Взятие материала и приготовление мазков.

Взятие материала. Забой животных и взятие материала производится так же, как в п. 5.1.1. Можно использовать лимфоузлы, из которых готовились отпечатки.

Приготовление мазков. На предметное стекло в каплю физиологического раствора помещается лимфоузел. Затем при помощи двух инъекционных игл ткань органа размельчается в этой капле до получения гомогенной взвеси. Из капли обычным образом готовится мазок, который высушивается на воздухе при комнатной температуре.

Фиксация мазков. Приготовление фиксатора: готовится 60% раствор ацетона (60 мл ацетона и 40 мл дистиллированной воды), куда добавляется трилон (250 мг на 100 мл 60% раствора ацетона); pH раствора 4,8 - 5,0 (доводить pH 0,1 раствором HCl).

Высушенные мазки фиксируются в ацетоновом фиксаторе в течение 30 с, затем промываются в проточной воде и высушиваются на воздухе.

5.2.2. Выявление сукцинатдегидрогеназы и бета-глицерофосфат-дегидрогеназы.

Приготовление фосфатного буфера:

а) приготовить раствор калия фосфорнокислого однозамещенного с мол. весом 136,09 (3,78 г растворяют в 100 мл воды);

б) приготовить раствор калия фосфорнокислого двузамещенного (4,56 г растворить в 100 мл воды);

в) оба раствора слить для получения pH = 7,0 - 7,4 (30 мл раствора калия однозамещенного и 70 мл раствора калия двузамещенного).

Буфер хранить в холодильнике.

Приготовление инкубационной среды для выявления сукцинатдегидрогеназы (СДГ):

а) 10 мг трилона Б; б) 540 мг сукцината натрия; в) 10 мг паранитротетразолия фиолетового; г) 40 мл фосфатного буфера.

Приготовление инкубационной среды для выявления бета-глицерофосфатдегидрогеназы (бета-ГДГ):

а) 10 мг трилона Б; б) 650 мг бета-глицерофосфата; в) 10 мг паранитротетразолия фиолетового; г) 10 мг фосфатного буфера.

Примечание: п-нитротетразолий лучше добавить после того, как pH среды будет доведен до рабочего.

Приготовление красителя метилового зеленого: 2,7 г уксуснокислого натрия растворить в 100 мл дистиллированной воды, довести ледяной кислотой до pH 4,8 - 5,0 (1,5 мл) 500 мг метилового зеленого растворить в 100 мл шуфера из уксуснокислого натрия. Смесь очищают при помощи делительной воронки хлороформом до тех пор, пока хлороформ не станет чистым.

Выявление ферментов и окраска мазков. Зафиксированные мазки помещают в одну из инкубационных сред (в зависимости от того, какая дегидрогеназа выявляется) и нагревают до 38 - 39 °C, после чего помещают в термостат (37 °C) на 60 минут. После инкубации мазки промывают в проточной воде и окрашивают метиловым зеленым в течение 60 минут. Затем следует отмывка препаратов.

5.2.3. Проведение анализа мазков и техника оформления полученных результатов.

Подсчет гранул ферментов в клетках производится под микроскопом с применением иммерсии. В окрашенном препарате лимфоциты и прочие клетки лимфоидного ряда имеют бледно-зеленую окраску. Гранулы фермента располагаются в ядре и цитоплазме, имеют округлую сферическую форму и темно-фиолетовый (почти черный) цвет. Техника анализа мазка предполагает подсчет количества гранул в 50 клетках, последние считают в разных полях зрения, в разных участках мазка.

Активность фермента в клетке выражается средним количеством гранул в одной клетке (общее количество гранул в 50 клетках, деленное на 50). Запись протокола подсчета гранул фермента производится по нижеприведенному образцу ("0" обозначает отсутствие фермента в клетке).

Таблица 2

ОБРАЗЕЦ ЗАПИСИ ПРОТОКОЛА ПОДСЧЕТА ГРАНУЛ ФЕРМЕНТА

┌──────────────────────────────────────────────────────────────────────────────┐

│  1       5       6       0       0       10      6       0       1       4   │

├──────────────────────────────────────────────────────────────────────────────┤

│  0       3       0       0       8       12      15      4       6       0   │

├──────────────────────────────────────────────────────────────────────────────┤

│  4       3       2       0       0       8       9       0       6       0   │

├──────────────────────────────────────────────────────────────────────────────┤

│  0       5       5       4       0       0       0       8       10      11  │

├──────────────────────────────────────────────────────────────────────────────┤

│  4       1       1       2       4       6       0       5       10      0   │

└──────────────────────────────────────────────────────────────────────────────┘

Коэффициент активности фермента в этом случае равен 158 / 50 = 3,74.

5.3. Гистохимическое выявление рибонуклеиновой кислоты в ткани селезенки по методу Браше.

5.4. Гистохимическое выявление щелочной фосфатазы в лимфоузлах по методу Гомори.

5.5. Определение весовых коэффициентов тимуса и селезенки.

5.6. Оценка результатов экспериментов.

Для оценки степени совместимости материала главное значение имеют данные цитоморфологического анализа лимфоузлов. Эти данные должны получить подтверждение в результате гистохимического исследования селезенки и анализа весовых коэффициентов лимфоидных органов.

Цитохимическое определение сукцинатдегидрогеназы и бета-гли-церофосфатдегидрогеназы проводится факультативно, но обязательно в совокупности с гистохимическим определением щелочной фосфатазы в лимфоузлах.

Материал следует считать биологически несовместимым, если через 1 месяц после имплантации материалов не наблюдается нормализации показателей или выраженной тенденции к таковой и отличия их от контроля существенны (статистически достоверны).

В случае если показатели состояния лимфоидной ткани подопытных животных отличаются от контроля менее существенно (носят характер тенденции к изменению Р, равном или меньше 0,1), вопрос о биологической совместимости исследуемого материала должен решаться с учетом всей совокупности данных токсикологического эксперимента.

5.6.1. Статистическая обработка данных.

Для цифровых показателей, получаемых методами, указанными в п. п. 5.1; 5.2.3; 5.5, - статистическая обработка обязательна. Она проводится с использованием критерия "t" по Стьюденту. Для результатов цитохимических исследований (п. 5.2.3) предпочтительнее метод Уилкоксона - Манна - Уитна.

Результаты, полученные в опытной группе животных, сравниваются с контролем, которому вживлялся "инертный материал". Если этот контроль не имеет достоверных отличий от ложнооперированного контроля, опытная группа может быть сравнена непосредственно с интактным контролем.