"Методические указания по определению картоцида (фитона) в картофеле, свекле, огурцах, томатах, яблоках, цитрусовых, луке, жоме, мелассе, сахаре, воде и биологическом материале методом тонкослойной хроматографии" // Технорма.RU

Утверждены

Минздравом СССР

6 августа 1981 г. N 2431-81

21 ноября 1985 г. N 4039-85

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

ПО ОПРЕДЕЛЕНИЮ КАРТОЦИДА (ФИТОНА) В КАРТОФЕЛЕ, СВЕКЛЕ,

ОГУРЦАХ, ТОМАТАХ, ЯБЛОКАХ, ЦИТРУСОВЫХ, ЛУКЕ, ЖОМЕ,

МЕЛАССЕ, САХАРЕ, ВОДЕ И БИОЛОГИЧЕСКОМ МАТЕРИАЛЕ

МЕТОДОМ ТОНКОСЛОЙНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ <*>

--------------------------------

<*> Разработаны Т.В. Алдошиной, К.Ф. Новиковой, Ф.Г. Мельцер, Г.А. Летуновской, Э.В. Сазоновой (ВНИИХСЗР).

Краткая характеристика препарата. Картоцид - новый отечественный

фунгицид, рекомендуемый для борьбы с грибковыми заболеваниями картофеля,

томатов и других сельскохозяйственных культур. Действующее начало препарата

- трикапролактамо-медь (II)-дихлоридмоногидрат. Брутто-формула

C H Cl N O Cu. Молекулярная масса 482,0. В чистом виде кристаллы желтого

18 35 2 3 4

цвета, т. пл. 83 - 85 °C. Хорошо растворимы в воде. Растворимость в

органических растворителях при 20 °C, %: в ксилоле - 1,8, хлороформе - 4,4,

ацетоне - 12,7, этиловом спирте - 21,5. Давление паров при 20 °C 0,04 Па. В

лимонах МДУ 0,1 мг/кг. В сахарной свекле, цитрусовых (мякоть) содержание

картоцида не допускается.

Принцип метода. Метод основан на извлечении картоцида из сельскохозяйственной продукции ацетоном, очистке экстракта перераспределением из ацетоновой среды в хлороформ, а затем на колонке с окисью алюминия с последующим определением образовавшегося капролактама методом ТСХ на пластинках "Силуфол". Из воды картоцид извлекают хлороформом и без очистки экстракта определяют методом ТСХ. В биологических объектах картоцид гидролизуют 0,1 н HCl до капролактама с последующим распределением его в хлороформ, очистке экстракта на колонке с оксидом алюминия и определением методом ТСХ.

Метрологическая характеристика метода. Предел обнаружения в

хроматографируемой пробе 3 мкг. Предел определения в сельскохозяйственной

продукции 0,15 мг/кг, в воде 0,001 мг/л, в жоме 0,3 мг/кг и в мелассе

0,6 мг/кг. Среднее значение определения стандартных количеств картоцида

c 80% при n = 15. Стандартное отклонение +/- 8,0%. Доверительный интервал

среднего при p = 0,95, n = 5 для всех объектов 80,0 +/- 10,3%. Размах

варьирования для всех объектов 72,0 - 85,0%. Метрологическая характеристика

метода дана в таблице 127.

Таблица 127

МЕТРОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА МЕТОДА

ОПРЕДЕЛЕНИЯ КАРТОЦИДА В БИООБЪЕКТАХ

┌──────────┬────────────┬──────────────┬───────────┬─────────────┬────────┐

│Анализи- │ Нижний │ Среднее │Стандартное│Доверительный│Размах │

│руемый │ предел │ значение │отклонение │ интервал │варьиро-│

│объект │определения,│ _ │при n = 15,│ определения │вания, %│

│ │ мкг/г │определения c │ % │ при n = 5, │ │

│ │ или мкг/мл │при n = 15, % │ │ p = 0,95, % │ │

├──────────┼────────────┼──────────────┼───────────┼─────────────┼────────┤

│Моча │5 │87,3 │+/- 8,0 │87,3 +/- 9,9 │80 - 100│

│Кровь │5 │76,7 │+/- 8,2 │76,7 +/- 10,2│70 - 90 │

│Почки │1,5 │56,0 │+/- 5,5 │55,0 +/- 6,8 │50 - 60 │

│Печень │0,7 │56,0 │+/- 5,6 │55,0 +/- 7,0 │50 - 60 │

└──────────┴────────────┴──────────────┴───────────┴─────────────┴────────┘

Избирательность метода. Прочие пестициды определению не мешают, так как проявление на пластинке селективно лишь для картоцида.

Реактивы и материалы. Ацетон х.ч. Гексан х.ч. Хлороформ х.ч. Бензол х.ч. Метиловый спирт х.ч. Этиловый спирт х.ч. Сульфат натрия безводный х.ч. Хлороводородная кислота, х.ч. 2 н и 0,1 н. Гидроксид натрия 1 н и 4 н. Хлорид железа ч.д.а. Гидроксиламин солянокислый ч.д.а. Проявляющие реагенты: N 1 (растворяют 21 г гидроксиламина солянокислого в 100 мл воды. Перед обработкой хроматограммы смешивают 20 мл полученного раствора с 5 мл 1 н NaOH); N 2 (к 85 мл воды добавляют 15 мл 2 н HCl и растворяют 10 г хлорида железа). Пластинка "Силуфол". Оксид алюминия нейтральный, II степени активности или отечественный для хроматографии. Стандартные растворы картоцида в ацетоне с содержанием 100 мкг/мл (раствор 1) и 10 мкг/мл (раствор 2). Растворы 1 и 2 стабильны при хранении в холодильнике в течение 3 мес.

Приборы, аппаратура, посуда. Ротационный вакуумный испаритель. Аппарат для встряхивания. Камера для хроматографирования. Делительные воронки на 25; 100 и 1500 мл. Колбы: плоскодонные на 50 и 250 мл; круглодонные на 250 мл; мерные на 100 мл; конические на 25; 50 и 100 мл. Хроматографические колонки длиной 10 см, внутренним диаметром 2,5 см (колонка N 1) и 0,8 см (колонка N 2) с краном, стеклянная. Пробирки конические градуированные на 10 мл. Пипетки на 1; 5 и 10 мл с делениями. Пульверизаторы стеклянные. Цилиндры мерные на 100 и 250 мл. Пористый фильтр. Пипетки на 1 и 10 мл с делениями. Сушильный шкаф.

Подготовка к определению хроматографических камер. Хроматографические камеры за 1 ч до начала хроматографирования заполняют смесью подвижных растворителей хлороформ-метиловый спирт (25:2) и бензол-этиловый спирт (30:5) для насыщения камер парами подвижных растворителей. Объем подвижного растворителя должен по высоте находиться не ниже 0,7 - 1,0 см от уровня дна камеры. Хроматографическую колонку N 1 заполняют 3,5 г оксида алюминия в 20 мл хлороформа. Избыток хлороформа сливают с подсоединением слабого вакуума, оставляя слой растворителя на уровне 1 - 2 мм над поверхностью сорбента. Хроматографическую колонку N 2 заполняют 2 г оксида алюминия в 15 мл хлороформа при анализе мочи и крови и 9 г оксида алюминия в 40 мл при анализе печени и почек. Избыток хлороформа сливают с подсоединением слабого вакуума, оставляя слой растворителя на уровне 1 - 2 мм над поверхностью сорбента.

Подготовка проб к анализу. Для анализа картофеля, огурцов, яблок, цитрусовых, лука, свеклы из средней пробы подготавливают три параллельные навески массой 20 г. Картофель, огурцы, свеклу, цитрусовые, яблоки измельчают ножом на кубики с размером граней около 0,5 см. Томаты и лук измельчают на маленькие дольки. Сахар анализируют в виде песка или молотого сахара и отбирают три параллельные навески массой 20 г, жом анализируют в естественном виде, отбирая навески массой 10 г. Каждую отобранную пробу крови (2 мл) или мочи (2 мл) помещают в отдельную пробирку и анализируют всю отобранную пробу. Навеску почек берут 5 - 10 г, печени 10 - 15 г.

Ход анализа. Экстракция и очистка экстракта. Навеску анализируемой

пробы картофеля, огурцов, томатов, яблок, цитрусовых, свеклы, лука, жома,

сахара помещают в плоскодонную колбу на 500 мл, заливают 40 мл ацетона и

экстрагируют картоцид с помощью механического встряхивания колбы в течение

30 мин. Экстракт пропускают через бумажный фильтр в круглодонную колбу на

250 мл, содержащую 0,5 мл воды. Экстракцию овощей и фруктов проводят еще 2

раза тем же количеством растворителя. Из объединенного экстракта с помощью

ротационного вакуумного испарителя отгоняют ацетон. Водный остаток

переносят в делительную воронку на 100 мл. Колбы ополаскивают 2 раза водой

общим объемом 5 мл, в случае жома и сахара - 20 - 25 мл. Водный раствор

дважды промывают 10 мл гексана. Гексановый слой отбрасывают. Из водной фазы

картоцид трижды экстрагируют хлороформом порциями по 10 мл. После

разделения слоев хлороформный слой переносят в коническую колбу на 100 мл,

сушат над безводным сульфатом натрия (7 - 10 г), фильтруют в круглодонную

колбу на 50 мл. Из круглодонной колбы с помощью ротационного вакуумного

испарителя отгоняют растворитель до объема 1 мл. Остаток переносят на

хроматографическую колонку 1, заполненную оксидом алюминия II степени

активности в хлороформе, при закрытом кране колонки, открывают кран колонки

и дают раствору впитаться в сорбент. Колбу дважды обмывают хлороформом

порциями по 2 мл и полученный раствор каждый раз переносят на колонку и

элюируют картоцид с колонки 30 мл хлороформа со скоростью 30 кап./мин.

Элюат собирают в коническую пробирку. Общий объем элюата 25 - 30 мл.

В пробирку помещают стеклянный капилляр с заплавленным верхним концом и

удаляют растворитель на горячей водяной бане до объема ~ 0,05 мл. Остаток с

помощью того же капилляра, но с отломленным заплавленным концом переносят

на хроматографическую пластинку. Параллельно на пластинку наносят серию

стандартов с содержанием картоцида 3 - 15 мкг. Хроматограмму развивают в

системе хлороформ-метанол (25:2) или бензол-этанол (30:5). После

развития хроматограммы пластинку сушат, а затем обрабатывают из

пульверизатора проявляющим раствором N 1. Влажную хроматограмму выдерживают

в сушильном шкафу при 120 °C в течение 15 - 20 мин., а затем обрабатывают

раствором N 2. Картоцид в виде капролактама проявляется на пластинках в

виде темно-коричневых пятен на желтом фоне с R 0,40 +/- 0,05 в первой

системе и 0,28 +/- 0,03 во второй. Пятна стабильны в течение 5 - 7 мин.

Навеску мелассы 5 г растворяют в 100 мл дистиллированной воды и трижды экстрагируют в делительной воронке на 500 мл хлороформом порциями по 100 мл. Объединенный хлороформный экстракт сушат над безводным сульфатом натрия (25 г), затем фильтруют в круглодонную колбу, содержащую 0,5 мл 0,1 н HCl, и полностью отгоняют растворитель с помощью ротационного вакуумного испарителя. Влажный остаток количественно переносят из колбы в делительную воронку на 100 мл 25 мл 0,1 н HCl и трижды экстрагируют хлороформом порциями по 10 мл. Объединенный хлороформный экстракт сушат над безводным сульфатом натрия (5 г). Далее поступают, как описано для другой сельскохозяйственной продукции.

Из 1 л воды картоцид извлекают 4-кратной экстракцией хлороформом порциями по 100 мл, в делительной воронке - по 1,5 л. В воду предварительно добавляют около 15 г NaCl. Объединенный хлороформный экстракт сушат над безводным сульфатом натрия и порциями фильтруют в грушевидную колбу на 50 мл. Из колбы с помощью ротационного вакуумного испарителя отгоняют растворитель до объема 1 - 2 мл. Последнюю порцию хлороформа отгоняют до объема 0,1 мл. Остаток количественно с помощью стеклянного капилляра переносят на хроматографическую пластинку, далее поступают так, как описано для анализа растительных проб.

Образец крови или мочи переносят в делительную воронку вместимостью

25 мл, пробирку обмывают 1 - 2 мл 0,1 н соляной кислоты и полученный

раствор также переносят в делительную воронку. Содержимое делительной

воронки доводят до 10 мл 0,1 н хлороводородной кислотой, смесь

перемешивают несколько секунд и трижды экстрагируют полученный капролактам

хлороформом порциями по 10 мл. Хлороформный экстракт в плоскодонной колбе

на 50 мл сушат над безводным сульфатом натрия (5 г). Хлороформный раствор

порциями декантируют в круглодонную колбу на 25 мл, а затем с помощью

ротационного вакуумного испарителя концентрируют до объема ~ 1 мл. Сульфат

натрия в колбе 3 раза промывают свежими порциями хлороформа по 2 - 3 мл,

полученный раствор также переносят в круглодонную колбу и каждую порцию

концентрируют до объема ~ 1 мл. Остаток в колбе переносят на

хроматографическую колонку II с Al O при закрытом кране. Открывают кран

2 3

колонки и дают раствору впитаться в сорбент. Колбу несколько раз обмывают

хлороформом и полученный раствор каждый раз переносят на колонку. Элюируют

капролактам с колонки хлороформом со скоростью 2 кап./с с подсоединением

слабого вакуума. Общий объем элюата 15 мл. Собирают элюат в грушевидную

колбу на 25 мл с оттянутым концом. Полученный раствор концентрируют с

помощью ротационного вакуумного испарителя до объема 0,05 мл и проводят

определение методом ТСХ.

Навеску почек (5 - 10 г) гомогенизируют с помощью ножа до состояния кашицы, добавляют 20 мл 0,1 н HCl. Гомогенизат перемешивают с кислотой в течение нескольких минут. Полученную массу фильтруют через пористый фильтр (пор 160) с подсоединением слабого вакуума. Остаток на фильтре промывают 0,1 н соляной кислотой порциями по 5 мл 4 раза. Фильтрат переносят в делительную воронку на 100 мл и трижды экстрагируют капролактам хлороформом порциями по 10 мл. Хлороформный экстракт сушат над безводным сульфитом натрия (5 г), а затем декантируют раствор в грушевидную колбу на 50 мл. Остаток в колбе промывают несколько раз хлороформом общим объемом 10 мл. Хлороформный экстракт концентрируют с помощью ротационного вакуумного испарителя до объема ~ 1 мл. Остаток в колбе переносят на хроматографическую колонку II с оксидом алюминия при закрытом кране. Открывают кран колонки и дают раствору впитаться в сорбент. Колбу несколько раз обмывают хлороформом порциями по 1 мл и полученный раствор каждый раз переносят на колонку, элюируют капролактам с колонки хлороформом со скоростью 2 кап./с с подсоединением слабого вакуума. Общий объем элюата 40 мл. Элюат собирают в грушевидную колбу на 50 мл с втянутым концом. Полученный раствор концентрируют с помощью ротационного вакуумного испарителя до объема ~ 0,05 мл и проводят определение методом ТСХ.

Навеску печени (10 - 15 г) гомогенизируют с помощью ножа до состояния кашицы, добавляют 35 мл 0,1 н HCl. Гомогенизат перемешивают с кислотой в течение нескольких минут. Полученную массу фильтруют через пористый фильтр (пор 160) с подсоединением слабого вакуума. Остаток на фильтре промывают 0,1 н хлороводородной кислотой порциями по 5 мл 4 раза. Фильтрат переносят в делительную воронку на 100 мл и экстрагируют капролактам трижды хлороформом порциями по 15 мл. Хлороформный экстракт сушат над безводным сульфатом натрия (5 - 7 г), а затем декантируют раствор в грушевидную колбу на 50 мл. Содержимое колбы концентрируют с помощью ротационного вакуумного испарителя до объема 2 - 3 мл. Оставшийся в колбе сульфат натрия промывают несколько раз хлороформом общим объемом 10 мл. Хлороформный раствор переносят в грушевидную колбу и ее содержимое концентрируют до объема 1 мл. Остаток переносят на хроматографическую колонку II и далее поступают так, как описано выше при анализе почек.

Обработка результатов анализа. Количественное определение проводят путем сравнения площади и интенсивности пятен рабочей пробы и серии стандартов. При большом содержании картоцида на пластинку наносят аликвотную часть раствора. Содержание картоцида в анализируемой пробе (X, мг/кг или мг/л) вычисляют по формуле:

X = ---,

V P

где:

A - количество картоцида, найденное в хроматографируемой пробе, мкг;

V - общий объем раствора, мл;

V - объем аликвоты, отобранной для хроматографирования, мл (при

нанесении всей пробы V = V );

1 2

P - навеска пробы или объем анализируемой пробы воды, г или мл.

Требования безопасности. Соблюдать требования техники безопасности, установленные для работы с легковоспламеняющимися жидкостями и метиловым спиртом.