Утверждаю

Главный государственный

санитарный врач СССР

П.Н.БУРГАСОВ

30 августа 1985 г. N 3928-85

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

ПО МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОМУ КОНТРОЛЮ ДЕТСКИХ СУХИХ

МОЛОЧНЫХ СМЕСЕЙ И ИХ КОМПОНЕНТОВ.

НОРМАТИВЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Настоящие "Методические указания" предназначаются для санитарно-эпидемиологических станций, осуществляющих контроль за микробиологическими показателями качества детских молочных сухих смесей и их компонентов, а также для производственных лабораторий предприятий, вырабатывающих эту продукцию и компоненты для ее изготовления.

"Методические указания" включают нормы предельно допустимого содержания микроорганизмов в сухих молочных смесях детского питания - "Детолакт", "Детолакт, обогащенный железом", "Детолакт с мукой", "Малыш", "Малютка", "Виталакт" - и ряде компонентов: мука необработанная и обработанная рисовая и гречневая, толокно овсяное, манная крупа, сухая гуманизирующая добавка, солодовый экстракт, масло кукурузное и подсолнечное, сахар-песок рафинированный, сахар молочный, сухая молочная основа для смеси "Малыш" (без солодового экстракта), молоко сухое для производства продуктов детского питания (цельное и обезжиренное). Кроме того, в "Методических указаниях" изложены методы микробиологического исследования вышеперечисленных компонентов и готовых сухих молочных смесей.

В связи с тем, что к продуктам детского и диетического питания предъявляются повышенные санитарно-гигиенические требования, в особенности к продуктам для детей первых месяцев жизни, употребляемым без термической обработки (смеси типа "Детолакт"), то для сырья и компонентов, используемых для их изготовления, также должны быть установлены повышенные требования.

Однако большинство компонентов (мука рисовая и гречневая, толокно, солодовые экстракты, сахар, растительное масло и др.), согласно действующей технической документации, не нормированы по микробиологическим показателям, тогда как продукты детского питания строго регламентированы по ряду санитарно-показательных микроорганизмов.

Существующий в настоящее время микробиологический контроль производства продуктов питания предусматривает исследования только санитарно-показательных групп микроорганизмов, что не позволяет судить о степени безопасности готового продукта для детей раннего возраста.

Известно, что у взрослого человека потенциально патогенные микроорганизмы, такие как Staphylococcus aureus, E. coli, бактерии рода Proteus и другие, вызывают вспышки пищевых интоксикаций и токсикоинфекций при массивном обсеменении продукта, тогда как у детей эти возбудители при значительно меньшей дозе инфекта вызывают заболевания, текущие по типу острой или хронической кишечной инфекции.

Эта уязвимость детского организма в отношении ряда микробов связана с недостаточной выработкой специфических и неспецифических защитных факторов и незрелостью желудочно-кишечного тракта.

Установлено, что наименее защищены против инфекций недоношенные дети и дети первых трех месяцев жизни, находящиеся на искусственном вскармливании, для которых в большей степени и предназначены детские сухие молочные смеси.

Специальные экспериментальные исследования, проведенные в институте питания АМН СССР, показали, что ряд представителей потенциально патогенных микроорганизмов (E. coli, Staph. aureus, энтерококки, Bac. cereus) способны интенсивно размножаться в условиях желудочно-кишечного тракта детей первых месяцев жизни.

Следует подчеркнуть, что бактериологические нормативы на потенциально патогенные и патогенные микроорганизмы для детских смесей и их компонентов отсутствовали.

Полученные данные позволили обоснованно подойти к строгому нормированию отсутствия условно патогенных и патогенных микроорганизмов в относительно большей массе детских сухих молочных смесей и компонентов.

Настоящие "Методические указания" составлены с учетом результатов исследования остаточной микрофлоры ряда готовых детских молочных смесей и их компонентов, проведенных по единой методике в нескольких институтах (Институте питания АМН СССР, Киевском институте гигиены питания Минздрава Украинской ССР, Истринском отделении ВНИИ молочной промышленности). Кроме того, обобщены данные, полученные от ряда молочно-консервных комбинатов детских молочных продуктов. Эти материалы послужили основанием для создания микробиологических нормативов на детские сухие молочные смеси и их компоненты, изготавливаемые на предприятиях при строгом соблюдении санитарно-гигиенических правил, технологических режимов производства, условий хранения и сроков реализации готового продукта. Разработанные микробиологические нормативы на сухие молочные смеси для детского питания и их основные компоненты предусматривают проведение контроля не только по общему количеству бактерий в 1 г продукта, содержанию бактерий группы кишечных палочек, дрожжей и плесеней, но и на целый ряд потенциально патогенных и патогенных микроорганизмов (Staphylococcus aureus, E. coli, Bac. cereus, Salmonella).

"Методические указания" предусматривают, наряду с общепринятыми методами микробиологического контроля детских сухих молочных смесей, введение методов, усовершенствованных в соответствии с рекомендациями ФАО/ВОЗ. Последние модифицированы с учетом возможного воспроизводства их в условиях санитарно-эпидемиологических станций и ведомственных производственных лабораторий.

Микробиологические показатели на готовые сухие молочные смеси разработаны с одной стороны с учетом возрастных особенностей детей, для питания которых предназначаются эти смеси, с другой - с учетом степени термической обработки разведенной смеси перед употреблением. Например, "Детолакт" разводят теплой кипяченой водой, что способствует в значительной степени сохранению жизнеспособности остаточной микрофлоры сухого продукта. Разведенные смеси "Малыш" и "Малютка" доводят до кипения. Данный способ приготовления способствует значительному снижению количества микроорганизмов в разведенных смесях.

Контроль за отсутствием эшерихий коли и коагулазоположительных стафилококков в 1 г продукта детской сухой молочной смеси "Детолакт" введен в соответствии с ТУ поставок фирмы "Abbot Lab" и дополнен контролем за отсутствием бактерий группы кишечных палочек (колиформных бактерий) в 1 г продукта.

Микробиологические нормы предельно допустимых количеств микроорганизмов в компонентах, используемых для приготовления детских смесей, изложенные в "Инструкции по микробиологическому контролю производства жидких и пастообразных детских молочных продуктов", "Санитарно-технологических требованиях к производству продуктов детского и лечебного питания на молочной основе" и "Инструкции по микробиологическому контролю производства на молочно-консервных комбинатах детских продуктов", утвержденных Министерством мясной и молочной промышленности в 1979 - 1980 гг., утрачивают свою силу.

Настоящими микробиологическими нормативами, рекомендуемыми в "Методических указаниях", и методами исследования должны руководствоваться санитарно-эпидемиологические станции и ведомственные производственные лаборатории предприятий при контроле детских сухих молочных смесей и их компонентов. Организация и периодичность контроля, проводимого ведомственными лабораториями предприятий молочной промышленности, должны осуществляться в соответствии с действующей "Инструкцией по микробиологическому контролю производства на молочно-консервных комбинатах детских продуктов", утвержденной Министерством мясной и молочной промышленности СССР 19 марта 1979 г.

Микробиологические нормативы на все виды сухих молочных и сухих кисломолочных продуктов для детского питания сохраняют свою силу в соответствии с действующей на них документацией.

Настоящими указаниями следует руководствоваться в части нормирования микробиологических показателей при пересмотре действующей и разработке вновь создаваемой нормативно-технической документации на детские сухие молочные смеси и их компоненты.

Кратность лабораторных исследований указанной продукции и компонентов, выполняемых санитарно-эпидемиологической службой, должна планироваться в соответствии с Методическими указаниями "Нормативы проведения основных санитарно-бактериологических исследований объектов окружающей среды", утвержденными Минздравом СССР 24 февраля 1983 г. N 2671-83.

1. Микробиологические нормативы на детские

сухие молочные смеси и компоненты

1.1. Нормативы призваны способствовать улучшению качества детских сухих молочных смесей и сырья, применяемого для их изготовления, а также способствовать повышению санитарно-гигиенического уровня и совершенствованию технологических процессов производства на предприятиях, производящих и реализующих данные виды продуктов.

Микробиологические нормативы на сухие детские молочные смеси приведены в табл. 1, на ингредиенты, используемые для их изготовления, - в табл. 2.

Таблица 1

НОРМЫ

ПРЕДЕЛЬНО ДОПУСТИМЫХ КОЛИЧЕСТВ МИКРООРГАНИЗМОВ

В ДЕТСКИХ СУХИХ МОЛОЧНЫХ СМЕСЯХ

┌───────┬───────────┬────────────┬──────┬─────────────────────────┬──────┬──────┬─────┐

│Возраст│Термическая│Наименование│Общее │  Отсутствие в навеске   │B. ce-│Микро-│Дрож-│

│ детей │обработка  │  продукта  │коли- │  продукта (в граммах)   │reus  │скопи-│жи в │

│       │перед упот-│            │чество├──────┬────┬──────┬──────┤в 1 г,│ческие│1 г, │

│       │реблением  │            │микро-│БГКП  │E.  │Salmo-│Staph.│не    │грибы │не   │

│       │           │            │орга- │(коли-│coli│nella │aureus│более │(пле- │более│

│       │           │            │низмов│форм- │    │      │      │<***> │сени) │     │

│       │           │            │в 1 г,│ные   │    │      │      │      │в 1 г,│     │

│       │           │            │не бо-│бакте-│    │      │      │      │не бо-│     │

│       │           │            │лее   │рии)  │    │      │      │      │лее   │     │

│       │           │            │<*>   │      │    │      │      │      │      │     │

├───────┼───────────┼────────────┼──────┼──────┼────┼──────┼──────┼──────┼──────┼─────┤

│С пер- │Отсутствуют│"Детолакт"  │2000  │1,0   │11,0│100   │11,0  │100   │50    │10   │

│вых    │           │            │      │      │    │      │      │      │      │     │

│дней   │           │"Детолакт,  │2000  │1,0   │11,0│100   │11,0  │100   │50    │10   │

│жизни  │           │обогащенный │      │      │    │      │      │      │      │     │

│до 1 - │           │железом"    │      │      │    │      │      │      │      │     │

│2 меся-│           │            │      │      │    │      │      │      │      │     │

│цев    │Доводится  │"Малютка"   │25000 │1,0   │-   │50    │1,0   │100   │100   │50   │

│       │до кипения │            │<**>  │      │    │      │      │      │      │     │

│       │           │            │      │      │    │      │      │      │      │     │

│С 2 ме-│Отсутствует│"Детолакт с │3000  │1,0   │11,0│100   │11,0  │100   │50    │10   │

│сяцев и│           │мукой"      │      │      │    │      │      │      │      │     │

│старше │           │            │      │      │    │      │      │      │      │     │

│       │Доводится  │"Малыш"     │25000 │1,0   │-   │50    │1,0   │100   │100   │50   │

│       │до кипения │            │<**>  │      │    │      │      │      │      │     │

│       │           │            │      │      │    │      │      │      │      │     │

│С пер- │Подвергает-│"Виталакт"  │25000 │1,0   │-   │50    │1,0   │100   │50    │10   │

│вых    │ся пастери-│            │<**>  │      │    │      │      │      │      │     │

│дней   │зации при  │            │      │      │    │      │      │      │      │     │

│жизни  │100 °C     │            │      │      │    │      │      │      │      │     │

│до 5 - │в течение 5│            │      │      │    │      │      │      │      │     │

│6 меся-│минут      │            │      │      │    │      │      │      │      │     │

│цев    │           │            │      │      │    │      │      │      │      │     │

└───────┴───────────┴────────────┴──────┴──────┴────┴──────┴──────┴──────┴──────┴─────┘

--------------------------------

<*> Общее количество мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов.

<**> Фактическое содержание мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов в смесях "Малыш", "Малютка" и "Виталакт", выработанных с соблюдением технологических режимов санитарно-гигиенических правил, не превышает 15000 клеток/г. Этот показатель должен быть включен при пересмотре действующей НТД на данные виды продуктов.

<***> Применяемый метод посева не позволяет выявить количество B. cereus менее 100 клеток/г.

Таблица 2

НОРМЫ

ПРЕДЕЛЬНО ДОПУСТИМЫХ КОЛИЧЕСТВ МИКРООРГАНИЗМОВ

В КОМПОНЕНТАХ ДЛЯ ДЕТСКИХ СУХИХ МОЛОЧНЫХ СМЕСЕЙ

┌──────────────────────┬────────┬────────────────────────┬──────┬──────┐

│Наименование и номер  │Общее   │  Отсутствие в навеске  │Микро-│Дрожжи│

│нормативно-технической│количес-│  продукта (в граммах)  │скопи-│в 1 г,│

│документации, в соот- │тво <*> ├─────────┬──────┬───────┤ческие│не бо-│

│ветствии с которой из-│микроор-│Бактерии │Бакте-│Коагу- │грибы │лее   │

│готовлен продукт      │ганизмов│группы   │рии   │лазо-  │(пле- │      │

│                      │в 1 г,  │кишечных │рода  │положи-│сени) │      │

│                      │не более│палочек  │Salmo-│тельные│в 1 г,│      │

│                      │        │(коли-   │nella │стафи- │не бо-│      │

│                      │        │формные  │      │лококки│лее   │      │

│                      │        │бактерии)│      │       │      │      │

├──────────────────────┼────────┼─────────┼──────┼───────┼──────┼──────┤

│          1           │   2    │    3    │  4   │   5   │  6   │  7   │

├──────────────────────┼────────┼─────────┼──────┼───────┼──────┼──────┤

│Мука рисовая, гречне- │50000   │0,1      │-     │-      │100   │100   │

│вая, необработанная,  │        │         │      │       │      │      │

│ОСТ 18217-75          │        │         │      │       │      │      │

│                      │        │         │      │       │      │      │

│Мука рисовая, гречне- │10000   │1,0      │25,0  │1,0    │10    │50    │

│вая, обработанная     │        │         │      │       │      │      │

│                      │        │         │      │       │      │      │

│Толокно овсяное,      │10000   │1,0      │25,0  │1,0    │10    │50    │

│ГОСТ 2929-75          │        │         │      │       │      │      │

│                      │        │         │      │       │      │      │

│Крупа манная          │10000   │1,0      │25,0  │1,0    │50    │50    │

│                      │        │         │      │       │      │      │

│Сухая гуманизирующая  │25000   │1,0      │25,0  │1,0    │50    │10    │

│добавка, ТУ 49387-77  │        │         │      │       │      │      │

│                      │        │         │      │       │      │      │

│Солодовый экстракт,   │10000   │1,0      │25,0  │-      │100   │50    │

│ТУ 18 УССР 395-74     │        │         │      │       │      │      │

│РСТ Латв. ССР 33-75   │        │         │      │       │      │      │

│                      │        │         │      │       │      │      │

│Масло растительное    │100     │1,0      │25,0  │1,0    │20    │не до-│

│кукурузное, ГОСТ      │        │         │      │       │      │пуска-│

│8808-73               │        │         │      │       │      │ются  │

│                      │        │         │      │       │      │      │

│Масло растительное    │500     │1,0      │25,0  │1,0    │100   │не до-│

│подсолнечное, ГОСТ    │        │         │      │       │      │пуска-│

│1129-73               │        │         │      │       │      │ются  │

│                      │        │         │      │       │      │      │

│Сахар-песок рафиниро- │1000    │1,0      │25,0  │-      │10    │10    │

│ванный, ГОСТ 22-78    │        │         │      │       │      │      │

│                      │        │         │      │       │      │      │

│Сахар молочный рафини-│10000   │1,0      │25,0  │1,0    │10    │50    │

│рованный обычный,     │        │         │      │       │      │      │

│ОСТ 49-63-73          │        │         │      │       │      │      │

│                      │        │         │      │       │      │      │

│Сухая молочная основа │15000   │1,0      │25,0  │1,0    │50    │10    │

│для смеси "Малыш" (без│        │         │      │       │      │      │

│солодового экстракта) │        │         │      │       │      │      │

│                      │        │         │      │       │      │      │

│Молоко сухое для про- │25000   │1,0      │25,0  │       │50    │10    │

│изводства продуктов   │        │         │      │       │      │      │

│детского питания      │        │         │      │       │      │      │

│(цельное или обезжи-  │        │         │      │       │      │      │

│ренное) <**>          │        │         │      │       │      │      │

└──────────────────────┴────────┴─────────┴──────┴───────┴──────┴──────┘

--------------------------------

<*> Общее количество мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов.

<**> ТУ на этот продукт будут разработаны ВНИМИ в 1986 г. Апробация при изготовлении экспериментальных партий проведена; при контроле за качеством продукта при изготовлении опытной партии микробиологические показатели будут проверены и, возможно, нормативы будут уточнены.

1.2. Рекомендации по оценке результатов

микробиологических исследований

Настоящими микробиологическими нормативами предусмотрен широкий спектр контролируемых микроорганизмов как в готовых сухих детских молочных смесях, так и в соответствующих компонентах.

При лабораторном санитарном контроле готовых детских сухих смесей санитарно-эпидемиологические станции осуществляют исследования на все виды микроорганизмов в соответствии с перечнем в табл. 1. В том случае, если один или несколько показателей превышают нормы, приведенные в указанной таблице, производится микробиологический контроль ингредиентов в соответствии с данными, приведенными в табл. 2.

При обнаружении повышенной бактериальной обсемененности сухих детских молочных смесей, молочной основы и сухой гуманизирующей добавки следует проводить контроль также за количественным содержанием энтерококков в данных продуктах по методам, изложенным ниже.

При этом следует иметь в виду, что повышенные показатели содержания общего количества мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов, бактерий группы кишечных палочек (колиформных бактерий), эшерихий коли, стафилококкус ауреус свидетельствуют либо о недостаточном температурном режиме, либо о повышенной бактериальной обсемененности исходных компонентов, либо о неудовлетворительном санитарном состоянии оборудования.

Более строгие требования к отсутствию сальмонелл в значительной массе готовых продуктов и ингредиентов введены в связи со способностью практически всех серотипов этого рода вызывать инфекционные заболевания у детей грудного возраста.

При микробиологическом контроле на молочно-консервных комбинатах, выпускающих детские сухие молочные смеси, производственные лаборатории осуществляют исследования готовой продукции с использованием методов и нормативов, изложенных в настоящих "Методических указаниях". Периодичность проведения микробиологических исследований готовой продукции и ингредиентов устанавливается согласно "Инструкции по микробиологическому контролю производства на молочно-консервных комбинатах детских продуктов", утвержденной заместителем министра мясной и молочной промышленности СССР 19 марта 1979 г.

Контроль за содержанием микроорганизмов - сальмонелл, E. coli, коагулазоположительных стафилококков осуществляется санитарно-эпидемиологическими станциями по методам, изложенным в настоящих "Методических указаниях", и в массе продукта, предусмотренной в таблицах 1 и 2.

Микробиологический контроль за качеством детской сухой молочной смеси "Детолакт" осуществляется согласно ТУ 49 689-82 "Смеси сухие молочные для детского питания".

Запрещается выпуск в реализацию готовой продукции, в которой обнаружены патогенные микроорганизмы в навесках продукта, предусмотренных табл. 1 "Методических указаний".

При наличии отклонений готовой продукции от указанных нормативов в сторону ухудшения осуществляется контроль ингредиентов и готовой продукции на все виды микроорганизмов, указанных в таблицах 1 и 2, а также контролируется санитарно-гигиеническое содержание оборудования, инвентаря, воздуха, воды, соблюдение правил личной гигиены (смывы с рук, санитарной одежды и т.п.) с последующим назначением санитарных дней и других санитарно-гигиенических мероприятий.

2. Методы отбора проб сырья, компонентов

и готовой продукции

2.1. Отбор проб детских сухих молочных смесей и компонентов молочного происхождения производится в соответствии со СТ СЭВ 3013-81 "Пищевые и вкусовые продукты. Порядок отбора проб для микробиологических анализов", ГОСТ 9225-84 "Молоко и молочные продукты. Методы микробиологического анализа" и ГОСТ 3622-68 "Молоко и молочные продукты. Отбор проб и подготовка их к испытанию".

2.1.1. Пробы для микробиологических исследований отбирают до отбора проб для физико-химических исследований способом, исключающим вторичную бактериальную контаминацию продукта: пробы берут стерильным приспособлением (шпателем, щупом, ложкой и т.п.) в стерильную посуду. Перед отбором пробы для контроля фасованной продукции поверхность упаковки тщательно протирают ватой, смоченной спиртом. Вскрывают упаковку стерильным ножом или ножницами. Посуду с образцом закрывают стерильной ватной пробкой, пергаментом или притертой стеклянной пробкой и снабжают этикеткой, в которой указывают: номер образца, наименование продукта, номер и размер партии, день и час отбора образца, должность и подпись лица, отобравшего образец, номер стандарта или технических условий, по которым изготовлен образец, и наименование микробиологических анализов, которые необходимо провести в отобранной пробе.

2.2. Пробы сухих молочных продуктов и компонентов крупной фасовки (мешки) отбирают из 10 мест (упаковок) одной партии общей массой 200,0 +/- 1,0 г и тщательно перемешивают.

2.3. Отбор проб от каждой однородной партии продукции, фасованной в мелкую упаковку (50 - 200 г (куб. см)), производят в количестве 3 единиц фасовки в оригинальной упаковке (желательно в начале, середине и конце процесса расфасовки). Затем из каждого образца стерильной ложкой отбирают по 50 - 100 г продукта в одну стерильную емкость для получения средней пробы.

2.4. Отбор проб продукции, фасованной в коробки по 250 - 500 г (куб. см), производится в количестве 1 единицы фасовки от каждой однородной партии продукции.

2.5. Пробы жидких (сиропообразных) и сгущенных компонентов детских сухих молочных смесей отбирают от каждой контролируемой партии:

- фасованной во фляги - по 50,0 г на 4 - 5 фляг;

- фасованной в бочки - по 150 - 200 г из 4 - 5 мест одной бочки;

- фасованной в цистерны или другие емкости - по 50,0 г из 4 - 5 мест одной емкости.

Пробы затем тщательно перемешивают.

2.6. Микробиологические исследования проводят тотчас или не позднее 4 часов с момента отбора пробы при температуре хранения не выше +6 °C.

2.7. При отборе проб для микробиологических исследований на предприятии работниками СЭС необходимо, чтобы микробиолог комбината одновременно с ними отбирал пробы и исследовал их.

3. Методы исследования

При определении в исследуемых продуктах санитарно-показательных условно-патогенных и патогенных микроорганизмов (БГКП, E. coli, Staph. aureus, бактерии рода Salmonella) введен этап предварительного неселективного обогащения в разведенном фосфатном буферном растворе при 37 °C в течение 24 часов. Проведение этой процедуры вызвано необходимостью восстановления физиологических свойств бактерий, поврежденных при термической обработке и сушке детских молочных смесей.

Следует обратить внимание лабораторных работников на обязательное использование при проведении посевов на индикаторные условно-патогенные и патогенные микроорганизмы контрольных культур соответствующих микроорганизмов, которые следует засевать и исследовать в тестах идентификации параллельно с исследуемым образцом продукта.

3.1. Определение общего количества мезофильных

аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов

(общее количество микроорганизмов)

3.1.1. Сущность метода.

Метод основан на количественном подсчете бактериальных колоний, вырастающих при посеве исследуемых продуктов на плотных питательных средах определенного состава при температуре (30 +/- 1) °C в течение 72 часов.

3.1.2. Аппаратура, материалы, реактивы:

автоклав вертикальный по ГОСТ 9586-75, или другой марки, или получаемый по импорту;

анализатор потенциометрический, диапазон измерения pH от 7,0 до 8,0 с погрешностью не более +/- 0,05 по ГОСТ 19881-74, или иономер универсальный ЭВ-74, или потенциометр универсальный pH-340;

аппарат универсальный типа АВУ-6С для встряхивания жидкостей в колбах и пробирках по ТУ 64-1-2451-78 (шуттель-аппарат);

аппарат для измельчения тканей с числом оборотов не менее 8000 об./мин. и не более 45000 об./мин.;

баня водяная с обогревом;

весы лабораторные 2 класса точности с наибольшим пределом взвешивания 200 г по ГОСТ 24104-80;

лупа измерительная по ГОСТ 8309-75;

микроскоп биологический по ГОСТ 8284-78, или другой марки, или полученный по импорту;

стерилизатор СС-200 М по ТУ 64-1-2498-75 или другой марки;

термостат с водяной рубашкой электрический 8Ц-1125 М по ТУ 64-1-1868-75, или термостат электрический суховоздушный ТС-80 по ТУ 64-1-1382-72, или получаемый по импорту;

прибор для счета колоний бактерий ПСБ по ТУ 64-1-2401-72;

холодильник электрический бытовой по ГОСТ 16317-76 или получаемый по импорту;

карандаши по стеклу;

колбы конические вместимостью 40, 200, 400, 1000, 1600 куб. см по ГОСТ 19908-80;

ножи;

ножницы;

посуда мерная лабораторная стеклянная по ГОСТ 1770-74;

пипетки исполнения 5, 1-го класса точности вместимостью 1,2 куб. см по ГОСТ 20292-74, или 2-го класса точности по ГОСТ 1770-74;

пипетки исполнения 7, 1-го класса точности вместимостью 10 куб. см по ГОСТ 20292-74, или 2-го класса точности по ГОСТ 1770-74;

пробирки исполнения ПК вместимостью 20 куб. см по ГОСТ 19908-80;

спиртовки лабораторные стеклянные по ГОСТ 10090-74;

стаканчики для взвешивания (бюксы) по ГОСТ 7148-70;

стаканы типа ВН-100 вместимостью 100 куб. см по ГОСТ 19908-80;

ступки фарфоровые по ГОСТ 9147-73;

цилиндры исполнения 1, вместимостью 100, 500 куб. см по ГОСТ 1770-74;

чашки биологические (Петри) по ГОСТ 10973-75;

бумага индикаторная универсальная по ТУ 6-09-1181-76;

вата по ГОСТ 5556-81;

марля по ГОСТ 9412-77;

пробки ватные;

штативы для пробирок;

агар микробиологический по ГОСТ 17206-71;

агар питательный сухой по ТУ 42-14-33-75;

среда питательная сухая для определения общего количества бактерий в молоке и молочных продуктах, ТУ 49513-78 производства СКФ ВНИИМС;

вода дистиллированная по ГОСТ 6709-72;

вода питьевая по ГОСТ 2874-82;

гидролизат казеина панкреатический по ТУ 42-14-1-74;

Д-глюкоза, ч., по ГОСТ 6038-79;

калий фосфорнокислый однозамещенный, х.ч. или ч.д.а., по ГОСТ 4198-75;

кислота соляная, ч.д.а., по ГОСТ 3118-77 плотн. 1,190 г/куб. см, 1 н раствор;

масло иммерсионное для микроскопии по ГОСТ 13739-78;

натрия гидроокись, х.ч. или ч.д.а., по ГОСТ 4328-77, 1 н раствор;

стекла предметные для микропрепаратов по ГОСТ 9284-75;

спирт этиловый ректификованный по ГОСТ 5962-67;

спирт этиловый ректификованный технический по ГОСТ 18300-72;

экстракт кормовых дрожжей по ТУ 42-14-56-76.

3.1.3. Подготовка к анализу.

3.1.3.1. Посуду стерилизуют в стерилизаторе (сушильном шкафу) при (160 +/- 2) °C в течение (2,0 +/- 0,5) час; другие вспомогательные материалы (металлические, ватные, деревянные) в автоклаве при (121 +/- 2) °C в течение 20 - 30 мин.

3.1.3.2. Приготовление концентрированного и разбавленного фосфатных буферных растворов для разведений исследуемых продуктов осуществляют, как указано в п. п. 4.1.1 и 4.1.2.

3.1.4. Проведение анализа.

3.1.4.1. Приготовление разведений для посева.

Для приготовления первого разведения (1:10) асептически делают навески из средней пробы исследуемого продукта. Сухие продукты взвешивают в количестве (10 +/- 0,1) г, жидкие продукты отмеривают по (10 +/- 0,1) куб. см стерильной пипеткой вместимостью 10 куб. см (при этом пипетку промывают до 10 раз раствором этого продукта в указанном ниже разбавителе до верхнего уровня имеющихся на ней делений). Навески помещают в колбы вместимостью 200 куб. см. Навески сгущенных и пастообразных продуктов делают в количестве (10 +/- 0,1) г в стерильные химические стаканы вместимостью 200 куб. см или широкогорлые банки. К каждой навеске продукта добавляют 90 куб. см стерильного разбавленного фосфатного буфера (п. 4.1.2). Для получения одноводной взвеси продукта производят взбалтывание круговыми движениями не менее 25 - 30 раз. Допускается перемешивание на аппарате для встряхивания жидкостей в течение (5 +/- 1) мин. При этом следует избегать намокания пробок. Навеску продукта 10 г можно гомогенизировать в 90 куб. см разбавленного фосфатного буфера в стерильном стакане гомогенизатора или растереть в стерильной ступке.

Из первого разведения взвеси продукта стерильной пипеткой на 1 куб. см набирают (1 +/- 0,01) куб. см и переносят в пробирку, содержащую (9 +/- 0,1) куб. см разбавленного фосфатного буфера, перемешивают осторожно, набирая и выдувая из пипетки 10 раз, и получают второе разведение продукта (1:100). Последующие разведения в зависимости от предполагаемого обсеменения продукта 1:1000, 1:10000 и т.д. готовят аналогично. Для приготовления каждого разведения берут новую пипетку. Вводят пипетку в пробирку не более чем на 2 - 3 см ниже поверхности взвеси. Время от момента приготовления разведений до посева не должно превышать 20 - 25 мин. Перед посевом все разведения осторожно встряхивают.

3.1.4.2. Посев на чашки.

Для определения количества мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов для посева выбирают те разведения продукта, на которых на чашках вырастает не более 300 и не менее 30 колоний. Перед посевом чашки маркируют. На дне чашки карандашом по стеклу ставят номер исследуемого образца продукта, разведение и дату.

По (1 +/- 0,0) куб. см каждого соответствующего разведения продукта вносят в 2 чашки Петри (параллельное определение). При повседневном контроле в ведомственных лабораториях допускается посев в одну чашку Петри, в арбитражных случаях посев в 2 чашки обязателен. Пипетку с посевным материалом держат под углом (45 +/- 1) °C, касаясь концом пипетки дна чашки, не выдувая последнюю каплю из пипетки. Затем наливают в каждую чашку Петри по 20 - 25 куб. см питательной среды (п. 4.2.1 и 4.2.2), расплавленной на водяной бане и остуженной до (45 +/- 2) °C. Края колб с питательной средой перед каждой заливкой фламбируют в пламени газовой горелки или спиртовки. Образец посевного материала смешивают с агаровой средой осторожно и равномерно путем легкого покачивания, избегая образования комков застывающей среды.

3.1.4.3. Инкубация.

После застывания среды чашки Петри переворачивают крышками вниз и помещают в таком виде в термостат при (30 +/- 1) °C. Инкубацию производят в течение (72 +/- 3) часов (допускается предварительный учет через (48 +/- 3) часов с последующим окончательным учетом через (72 +/- 3) часа).

Чашки Петри с посевами распределяются в термостате таким образом, чтобы каждая их группа отделялась от соседних чашек, от верха и стенок термостата не менее чем на (3 +/- 1) см.

3.1.4.4. Подсчет выросших колоний.

После инкубации подсчитывают колонии на тех чашках, где количество их составляет 30 - 300 колоний.

Количество выросших колоний подсчитывают на каждой чашке, поместив ее вверх дном на темном фоне, пользуясь лупой с увеличением от 4 до 10 раз. Каждую подсчитанную колонию отмечают на дне чашки чернилами.

Можно производить подсчет колоний с помощью специального прибора.

3.1.4.5. Обработка результатов.

    а) Если инкубированные чашки с разведением 1:10   не  содержат

                                                           1

колоний, то результат выражают  так:  "меньше  чем  1  x 10 "  или

"менее 10 КОЕ <*> на 1 г или куб. см продукта".

    --------------------------------

    <*> КОЕ - колониеобразующие единицы.

    б) Если на каждой из двух  параллельных  чашек  с  разведением

1:10 содержится меньше чем 30 колоний,  то  результат   выражается

                       2

так: "меньше чем 3 x 10  или меньше чем 300 КОЕ на  1 г (куб.  см)

продукта".

При исследовании продуктов, имеющих норматив на содержание общего количества мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов менее 500 КОЕ в 1 г, допускается учет всех выросших колоний в количестве менее 30 на чашке с последующим умножением на кратность разведения (например, масло растительное кукурузное).

в) Если количество колоний более 30, подсчитывают колонии на обеих чашках с одним и тем же разведением и вычисляют среднюю величину, умножают ее на соответствующее разведение и получают число микроорганизмов на 1 г или 1 куб. см продукта.

    Например: посеяно разведение  1:100; чашка 1  -  175  колоний,

чашка 2  -  203 колонии; расчет - 175 + 203 = 378 : 2 = 189 x 100;

                   4

результат: 1,9 x 10  КОЕ в 1 г продукта или 19000 КОЕ/г.

Среднее арифметическое от подсчитанных количеств колоний, выросших на чашках, является общим количеством мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов в 1 г (куб. см) исследуемого продукта. Ответ выражают в виде числа КОЕ/г с указанием соответствия или несоответствия продукта микробиологическому нормативу на этот показатель.

3.1.4.6. Контроль стерильности питательных сред и окружающего воздуха.

При контроле стерильности сред наливают 15 - 20 куб. см питательной среды из каждой ее партии в стерильную чашку Петри и помещают в термостат (контрольные чашки).

При контроле стерильности воздуха чашки с питательной средой выдерживают открытыми на рабочем столе в течение (15 +/- 1) мин.

Инкубацию производят в термостате при температуре (30 +/- 1) °C в течение (72 +/- 3) часов.

Число колоний, выросших на одной чашке, должно быть не более 3 - 5. Если вырастает большее количество колоний, помещение для микробиологических посевов подвергают дополнительной дезинфекции.

3.2. Определение бактерий группы кишечных палочек

(колиформных бактерий)

3.2.1. Сущность метода.

Для приведения в соответствие показателя "бактерии группы кишечных палочек" с принятой международной номенклатурой (Coliformes - ФАО/ВОЗ и СЭВ), а также с действующим ГОСТ 9225-84 "Молоко и молочные продукты. Методы микробиологического анализа" в настоящих "Методических указаниях" к бактериям группы кишечных палочек (БГКП) отнесены грамотрицательные, не образующие спор палочки, сбраживающие лактозу с образованием кислоты и газа при температуре (37 +/- 1) °C в течение 24 - 48 часов, в основном, являющиеся представителями родов Escherichia, Citrobacter, Enterobacter, Klebsiella и Serratia. Группы микроорганизмов, относящиеся к колиформным бактериям и БГКП, в настоящих "Методических указаниях" максимально сближены и, по существу, являются идентичными.

Следует подчеркнуть, что посев на цитратную среду Козера (Симмонса) для первичной идентификации выделенных из исследуемых продуктов БГКП специально не проводится с целью окончательного учета всех разновидностей - и цитратотрицательных, и цитратположительных вариантов этих бактерий. Это обусловлено все более широким распространением энтеротоксигенных штаммов среди цитратассимилирующих энтеробактерий, способных вызывать острые кишечные заболевания у детей.

3.2.2. Аппаратура, материалы и реактивы.

Для проведения анализа используют аппаратуру, материалы и реактивы, перечисленные в п. 3.1.2, включая дополнительно следующие материалы и реактивы:

пробирки Уленгута (поплавки);

пробирки стеклянные исполнения Ш и П2 по ГОСТ 10515-7;

стаканы высокие с носиком вместимостью 200 куб. см по ГОСТ 19908-80;

среда Кесслер сухая по ТУ 49-365-76 с учетом Изменения N 2 от 01.05.85;

бромтимоловый синий, ч.д.а., по ТУ 6-09-2086-77;

желчь сухая по ОСТ 49-278-75 или желчь нативная крупного рогатого скота, стерильная;

кристаллический фиолетовый, ч.д.а., по ТУ 6-09-4119-75;

культура бактерий группы кишечных палочек (контрольный штамм);

лактоза по ОСТ 4963-73;

магний сернокислый по ГОСТ 4523-77;

натрий хлористый по ГОСТ 4233-77;

натрий-аммоний фосфорнокислый по ГОСТ 4170-78;

натрий лимоннокислый по ГОСТ 22280-76;

натрий сернокислый по ГОСТ 903-76;

бумага индикаторная универсальная по ТУ 6-09-1181-76;

среда Эндо сухая по ТУ 49-876-82;

агар с эозинметиленовым синим сухой (среда Левина) по ТУ 42-1495-77;

пептон сухой ферментативный по ГОСТ 13805-76;

фуксин основной по МРТУ 6-09-6436-69.

3.2.3. Подготовка к анализу.

Подготовку к анализу проводят, как указано в п. 3.1.3.

3.2.4. Приготовление разведений.

Готовят разведение исследуемого продукта 1:10, как указано в п. 3.1.4.1.

3.2.5. Проведение анализа.

Для посева используется то количество продукта, в котором предусматривается отсутствие БГКП (колиформных бактерий) соответствующими пунктами таблиц 1 и 2.

3.2.5.1. Посев компонентов детских сухих смесей:

- жидкие и сиропообразные компоненты (солодовый экстракт, растительное масло) засевают непосредственно в среду Кесслер с лактозой (с поплавком) (п. п. 4.2.3.1, 4.2.3.3), соблюдая соотношение продукта и среды 1:10;

- сыпучие и порошкообразные продукты (мука, толокно, сахар-песок, сахар молочный рафинированный и т.п.) подготавливают к посеву, как указано в п. 3.2.4. При исследовании всех перечисленных компонентов, кроме муки необработанной (табл. 2), (10,0 +/- 0,1) куб. см разведения продукта 1:10, содержащего 1,0 исследуемого продукта, вносят в колбу с (90,0 +/- 1,0) куб. см среды Кесслер с лактозой;

- муку необработанную, рисовую и гречневую, в которой предусматривается отсутствие БГКП (колиформных бактерий) в 0,1 г, засевают в объеме 1 куб. см разведения 1:10 в пробирку с (10 +/- 0,1) куб. см среды Кесслер с лактозой (с поплавком).

Посевы помещают в термостат при температуре (37 +/- 0,1) °C на 24 часа. При отсутствии признаков роста - газообразования или изменения цвета среды - посевы продолжают инкубировать еще 4 часа. При отсутствии роста дается заключение об отсутствии БГКП (колиформных бактерий) в засеваемой массе продукта.

При наличии признаков роста - газообразования, помутнения, изменения цвета среды - на среде Кесслер с лактозой для окончательного заключения о присутствии в продукте БГКП (колиформных бактерий) из подозрительных колб и пробирок производят высев на чашки со средой Эндо или Левина (п. 4.2.3.6). Чашки с посевами помещают в термостат при (37 +/- 1) °C на 18 - 24 часа. Учет результатов посева производят в соответствии с п. 3.2.5.4.

3.2.5.2. Посев детских сухих молочных смесей.

Детские сухие молочные смеси перед засевом в среду Кееслер с лактозой подвергают предварительной инкубации в десятикратном объеме разбавленного фосфатного буфера (п. 4.2.1).

3.2.5.2.1. Предварительная инкубация детских сухих молочных смесей.

Асептически взвешивают (1,0 +/- 0,1) г сухого продукта, вносят в колбочку вместимостью 50,0 куб. см с (9,0 +/- 0,1) куб. см разбавленного фосфатного буфера для предварительного обогащения. Взвесь тщательно перемешивают, проверяют значение pH при помощи индикаторной бумаги, для чего стерильной стеклянной палочкой наносят каплю испытуемой взвеси на полосу универсальной индикаторной бумаги. Полученную окраску немедленно сравнивают со шкалой. При необходимости доводят значение pH до 7,0 +/- 0,1, используя простерилизованные растворы 1,0 н гидроокиси натрия или 1,0 н соляной кислоты (п. п. 4.1.4 и 4.1.5).

Колбочки помещают в термостат при температуре (37 +/- 1) °C и выдерживают 24 часа.

3.2.5.3. Проведение посева после предварительного обогащения.

На следующий день засевают (1,0 +/- 0,01) куб. см проинкубированной в буферном растворе взвеси продукта в пробирку с (10,0 +/- 0,01) куб. см среды Кесслер с лактозой (с поплавком).

Посевы помещают в термостат при температуре (37 +/- 1) °C на 24 часа. При отсутствии признаков роста - газообразования, помутнения или изменения цвета среды - дают заключение об отсутствии БГКП (колиформных бактерий) в 1 г и о соответствии исследованного продукта нормативу на БГКП (колиформные бактерии).

При наличии на среде Кесслер с лактозой признаков роста для окончательного заключения о присутствии в продукте БГКП (колиформных бактерий) необходимо произвести высев из газ-положительных и подозрительных пробирок или колб на чашки со средой Эндо или Левина. Посев производят петлей так, чтобы получить рост изолированных колоний. Посев из каждой пробирки производят на отдельный сектор, лучше - на отдельную чашку. Чашки с посевами помещают крышками вниз в термостат при температуре (37 +/- 1) °C на 18 - 24 часа.

3.2.5.4. Учет результатов.

При отсутствии на среде Эндо или Левина колоний, типичных для бактерий группы кишечных палочек (колиформных бактерий) (на среде Эндо - красных с металлическим блеском или без него, розовых и бледно-розовых; на среде Левина - черных с металлическим блеском, темных с черным центром, коричневых с темным центром), засеянная навеска продукта считается не загрязненной ими, т.е. исследуемый продукт соответствует нормативу на БГКП (колиформные бактерии).

При наличии на среде Эндо или Левина типичных для кишечных палочек (колиформных бактерий) колоний их продолжают изучать. Из изолированных колоний, характерных или подозрительных на БГКП, делают препараты, окрашивая их по Граму, и микроскопируют.

Обнаружение грамотрицательных бесспоровых палочек указывает на наличие БГКП (колиформных бактерий) в анализируемой массе продукта и несоответствии продукта микробиологическому нормативу.

3.3. Определение эшерихий коли

Определение производится при исследовании детских сухих молочных смесей, употребляемых без предварительной термической обработки после ее разведения.

3.3.1. Сущность метода.

Метод основан на способности эшерихий коли ферментировать лактозу с образованием кислоты и газа при температуре (44,5 +/- 0,5) °C в течение 24 - 48 часов. Идентификацию эшерихий коли проводят по следующим признакам: образование индола, положительная реакция с метиловым красным, отрицательная реакция Фогес-Проскауэра (образование ацетилметилкарбинола) и отсутствие способности утилизировать цитраты.

3.3.2. Аппаратура, материалы и реактивы.

При проведении анализов используют аппаратуру, материалы и реактивы, перечисленные в п. 3.1.2, включая дополнительно следующие материалы и реактивы:

пробирки Уленгута (поплавки);

агар в волокнах или в порошке по ГОСТ 17206-71 или получаемый по импорту;

бриллиантовый зеленый, ч., по ТУ 6-09-4279-76;

бромтиноловый синий, ч.д.а., по ТУ 6-09-2086-77;

гидролизат казеина панкреатический по ТУ 42-14-1-74;

д-лактоза, 1-водная, ч., по ТУ 6-09-2293-79 или лактоза по ОСТ 4963-73;

д-глюкоза, ч., по ГОСТ 6038-79;

желчь сухая по ОСТ 49-278-75 или желчь нативная крупного рогатого скота, стерильная;

бумага индикаторная универсальная по ТУ 6-09-1181-76;

йод по ГОСТ 4159-74, ч.д.а., 5-процентный спиртовой раствор;

кислота соляная, х.ч., по ГОСТ 3118-77, 1 н раствор;

калий йодистый, ч.д.а., по ГОСТ 4232-74, 0,5-процентный спиртовой раствор;

кристаллический фиолетовый, ч.д.а., по ТУ 6-09-4119-75;

калий фосфорнокислый однозамещенный, ч., по ГОСТ 4198-75;

калия гидроокись по ГОСТ 24363-80, 40-процентный раствор;

культура эшерихии коли (контрольный штамм);

метиловый красный, ч.д.а., по ГОСТ 5853-51;

магний сернокислый, ч. по ГОСТ 4523-77;

медь сернокислая, 5-водная, х.ч., по ГОСТ 4165-78;

натрий-аммоний фосфорнокислый, двузамещенный, 4-водный, ч. или х.ч., по ГОСТ 4170-78;

натрий хлористый, ч., или х.ч., или ч.д.а., по ГОСТ 4233-77;

натрия гидроокись, х.ч. или ч.д.а., по ГОСТ 4328-77, 1 н раствор;

натрий лимоннокислый трехзамещенный, ч.д.а., по ГОСТ 22280-76;

нафтол, ч., по ГОСТ 5838-79;

пара-диметиламинобензальдегид, ч., по ТУ 6-09-3272-77;

среда Кесслер сухая с лактозой по ТУ 49-365-76 с учетом Изменения N 2;

агар с эозинометиленовым синим сухой (среда Левина) по ТУ 42-1495-77;

агар Эндо сухой по ТУ 49876-82;

триптофан по ТУ 6-09-1492-80;

фуксин основной по МРТУ 6-09-6436-69;

пептон сухой ферментативный по ГОСТ 1385-76.

3.3.3. Подготовка к анализу.

3.3.3.1. Посуду и материалы стерилизуют, как указано в п. 3.1.3.1. Разбавленный фосфатный буфер готовят, как указано в п. 4.1.2.

3.3.4. Проведение анализа.

3.3.4.1. Асептически взвешивают (11,0 +/- 0,1) г сухого продукта и растворяют в колбе вместимостью 200,0 куб. см (99,0 +/- 0,1) куб. см разбавленного фосфатного буфера для предварительного обогащения.

Для доведения pH до 7,0 +/- 0,1 используют простерилизованные 1 н раствор гидроокиси натрия или 1 н раствор соляной кислоты, проверяя значение pH индикаторной бумагой, для чего стерильной стеклянной палочкой наносят каплю испытуемой взвеси на полоску универсальной индикаторной бумаги. Полученную окраску немедленно сравнивают со шкалой.

Колбу помещают в термостат и выдерживают при температуре (37 +/- 1) °C в течение (24 +/- 1) часов.

3.3.4.2. На следующий день засевают (1,0 +/- 0,01) куб. см разведения продукта в пробирку со средой Кесслер с лактозой (или с желчно-лактозным бульоном) (п. 4.2.3.4), помещают в термостат и выдерживают при температуре (44,5 +/- 0,5) °C в течение (24 +/- 1) часов. При отсутствии газа в пробирках после 24 часов их выдерживают до (48 +/- 3) часов.

Пробирки с посевами просматривают на присутствие газа. При отсутствии газа в пробирках делают заключение об отсутствии в продукте Escherichia coli.

Пробирки, в которых обнаружен газ или другие признаки роста (помутнение среды), подвергают дальнейшим исследованиям. Из этих пробирок производят посев штрихом или рассевом на поверхность чашки Петри с подсушенной средой Эндо или Левина так, чтобы получить изолированные колонии. Посевы выдерживают в термостате при температуре (37 +/- 1) °C в течение (24 +/- 1) часов.

Эшерихии на среде Эндо имеют колонии красные с металлическим блеском или без него, розовые; на агаре Левина - черные, темно-коричневые колонии с темным центром, с металлическим блеском или без него. Если при окрашивании по Граму и просмотре под микроскопом подтверждается наличие грамотрицательных бесспоровых палочек, то все типичные колонии подвергают идентификации по ИМАЦ-тестам (реакция на индол, реакция с метиловым красным, реакция Фогес-Проскауэра, утилизация цитрата).

3.3.4.3. Реакции на индол.

Из типичной изолированной колонии на среде Эндо (Левина) производят высев в пробирку с бульоном на индол (п. 4.2.3.7). Пробирки выдерживают в термостате при температуре (37 +/- 1) °C в течение (24 +/- 1) часов.

После выдерживания в термостате в пробирки с индольной средой добавляют 5 - 10 капель реактива Эрлиха (п. 4.2.3.8). Появление темно-красного окрашивания в поверхностном слое свидетельствует об образовании индола.

3.3.4.4. Реакция Фогес-Проскауэра.

Типичную, хорошо изолированную колонию пересевают в пробирку со средой Кларка (п. 4.2.3.9). Выдерживают в термостате при температуре (37 +/- 1) °C в течение (48 +/- 3) часов. Вынимают пробирки из термостата и из каждой из них пипеткой стерильно отбирают (1,0 +/- 0,01) куб. см культуральной жидкости в чистые пробирки. Затем к 1 куб. см добавляют (0,60 +/- 0,01) куб. см 5-процентного раствора альфа-нафтола (п. 4.2.3.12) и (0,20 +/- 0,01) куб. см 40-процентного раствора гидроокиси калия (п. 4.2.3.13), хорошо перемешивают. Появление красного окрашивания в первые 5 минут свидетельствует о положительной реакции (образование ацетилметилкарбинола).

3.3.4.5. Реакция с метиловым красным.

В пробирки с оставшейся средой Кларка добавляют по 5 капель реактива метилового красного в каждую пробирку. Четкое красное окрашивание указывает на положительную реакцию <*>.

--------------------------------

<*> Согласно ТУ поставок фирмы "Abbot Lab" при контроле за готовым продуктом "Детолакт" рекомендуется инкубация в течение 96 часов на среде Кларка для проведения теста с метил-рот. Однако, по данным большинства исследователей, для этого теста достаточно инкубации в течение 48 часов.

3.3.4.6. Утилизация цитратов.

Производят пересев из типичных колоний со среды Эндо или Левина на чашки Петри с подсушенной средой Симмонса (или в пробирки со средой Козера) (п. п. 4.2.3.14; 4.2.3.16). Посевы выдерживают в термостате при (37 +/- 1) °C в течение 24 - 48 часов. При учете результатов обращают внимание на наличие роста и изменение цвета среды.

Наличие роста и изменение цвета окраски среды из зеленого в синий или желтый характерно для цитрат-положительных культур.

Для цитрат-отрицательных разновидностей характерно отсутствие роста и изменения цвета среды.

3.3.5. Обработка результатов идентификации.

Таблица 3

КЛАССИФИКАЦИЯ КОЛИФОРМНЫХ БАКТЕРИЙ ПО ИМАЦ-ТЕСТАМ

┌───────────┬───────┬───────┬──────────┬─────────────────────────┐

│Образование│Реакция│Реакция│Утилизация│      Тип бактерий       │

│  индола   │с мети-│Фогес- │ цитратов │                         │

│           │ловым  │Проска-│          │                         │

│           │красным│уэра   │          │                         │

├───────────┼───────┼───────┼──────────┼─────────────────────────┤

│     +     │   +   │   -   │     -    │Типичные эшерихии коли   │

│     -     │   +   │   -   │     -    │Атипичные эшерихии коли  │

│     -     │   -   │   +   │     +    │Типичные энтеробактер    │

│           │       │       │          │аэрогенес                │

│     +     │   -   │   +   │     +    │Атипичные энетеробактер  │

│           │       │       │          │аэрогенес                │

│     +     │   +   │   -   │     +    │Типичные                 │

│     -     │   +   │   -   │     +    │Атипичные                │

└───────────┴───────┴───────┴──────────┴─────────────────────────┘

При выделении из продукта грамотрицательных неспорообразующих палочек, продуцирующих газ из лактозы при (44,5 +/- 0,5) °C, образующих и не образующих индол, дающих положительную реакцию с метиловым красным, отрицательную реакцию Фогес-Проскауэра и не растущих на среде Симмонса (Козера), считают, что в 11 г продукта содержатся эшерихии коли; продукт в данном случае бракуется.

При обнаружении в 11 г продукта бактерий родов Enterobacter и Citrobacter, но при отсутствии колиформных бактерий (БГКП) в 1 г, продукт браковке не подлежит. Однако микробиолог предприятия должен усилить контроль за соблюдением санитарно-гигиенических правил на предприятии и обратить внимание на необходимость дополнительного контроля технологического режима при изготовлении продукта.

3.4. Определение сальмонелл

3.4.1. Сущность метода.

Метод основан на использовании сред обогащения для увеличения роста сальмонелл, их выделения на специальных агаровых средах с последующим проведением серологической реакции.

3.4.2. Аппаратура, материалы, реактивы.

При проведении анализов используют аппаратуру, материалы и реактивы, перечисленные в п. 3.1.2, включая дополнительно следующие материалы и реактивы:

бутыли стеклянные по ГОСТ 5717-81;

кастрюли эмалированные по ГОСТ 24788-81;

целлофан (пленка полиэтиленцеллофановая) ОСТ 6-06-114-79;

дрожжи хлебные прессованные по ГОСТ 171-81;

висмут-сульфитный агар по ТУ-42 14127-78;

железо сернокислое;

д-глюкоза, ч., по ГОСТ 6038-79;

д-лактоза, 1-водная, ч., по ТУ 6-09-2293-79;

магний хлористый, 6-водный, ч., х.ч., ч.д.а., по ГОСТ 4209-77;

мел химический осажденный по ГОСТ 6253-72;

мочевина, ч., по ГОСТ 6691-77;

натрий хлористый, ч., х.ч., ч.д.а., по ГОСТ 4233-77;

натрий серноватистокислый, ч.д.а., по СТ СЭВ 223-75;

сахароза, ч.д.а., по ГОСТ 5833-75;

среда Плоскирева по МРТУ 42 134-67;

соль Мора, ч., по ГОСТ 4208-72;

среда Клиглера по ТУ;

сыворотка сальмонеллезная 0-агглютинирующая адсорбированная по ГОСТ 16449-78;

феноловый красный по ТУ 6-09-4530-77;

хлороформ технический по ГОСТ 20015-74;

культура бактерий рода сальмонелл (контрольный штамм).

3.4.3. Подготовка к анализу.

3.4.3.1. Посуду и материалы стерилизуют, как указано в п. 3.1.3.1.

3.4.4. Проведение анализа.

При исследовании детских сухих молочных смесей, употребляемых без предварительной термической обработки, навеска продукта должна составлять (100 +/- 1,0) г, для продуктов, употребляемых с предварительной термической обработкой, - (50 +/- 0,5) г, компонентов детских смесей - (25 +/- 0,25) г.

3.4.4.1. Взвешивают в стерильных условиях в стакане вместимостью 200 куб. см (100,0 +/- 1,0) г, (50,0 +/- 0,5) г или (25,0 +/- 0,1) г сухой смеси или компонента и затем для предварительного обогащения навески асептически переносят в колбы вместимостью соответственно: 1600 куб. см, 1000 куб. см или 400 куб. см, содержащие (900,0 +/- 5) куб. см, (450,0 +/- 1,0) куб. см или (225,0 +/- 1,0) куб. см разбавленного фосфатного буфера (п. 4.1.2).

Соблюдается соотношение массы продукта и питательной среды 1:10.

Проверяют pH с помощью индикаторной бумаги и доводят pH смеси до 6,8 - 7,2 1 н раствором гидроокиси натрия. Все тщательно перемешивают. При плохом растворении продукта пробы подвергают механическому встряхиванию на аппарате для встряхивания жидкости (шуттель-аппарат). К приготовленным взвесям продукта добавляют 0,1% водный раствор бриллиантового зеленого (п. 4.2.4.2) в количестве 2% к объему (т.е. 20 мл р-ра красителя к 1000 куб. см продукта), перемеривают и выдерживают в термостате при (37 +/- 1) °C в течение 18 - 24 часов.

3.4.4.2. На следующий день переносят (1,0 +/- 0,01) куб. см выдержанной в термостате смеси в пробирки с 10 куб. см магниевой среды (п. 4.2.4.1) или среды Мюллера (п. 4.2.4.4). Пробирки помещают в термостат с температурой (37 +/- 1) °C на 18 - 24 часа.

3.4.4.3. После инкубации в термостате производят высев из пробирок с магниевой средой или средой Мюллера на поверхность хорошо подсушенных чашек с дифференциально-диагностическими средами Плоскирева и висмут-сульфитного агара (п. 4.2.4.5). Для получения отдельных колоний петлей берут минимальное количество посевного материала и производят посев штрихом.

Чашки с посевами помещают в термостат с температурой (37 +/- 1) °C на 24 - 48 часов.

Проверку посевов осуществляют дважды: через (24 +/- 1) ч и (48 +/- 3) ч после выдерживания в термостате.

3.4.5. Обработка результатов.

3.4.5.1. На среде Плоскирева колонии сальмонелл бесцветные, плотные, на висмут-сульфитном агаре - черные, с характерным металлическим блеском, при этом наблюдается прокрашивание в черный цвет участка среды под колонией.

При отсутствии типичных колоний сальмонелл на каждой из сред конечный результат анализа записывают как "отрицательный", т.е. в исследуемой массе продукта сальмонеллы отсутствуют.

При наличии на любой из питательных сред на чашках Петри типичных или подозрительных колоний на сальмонеллы производят их дальнейшее изучение.

3.4.5.2. Из каждой среды на чашке Петри, содержащей подозреваемую колонию сальмонелл, выбирают хорошо изолированную колонию и высевают штрихом и уколом на трехсахарный агар с мочевиной (п. 4.2.4.6) или среду Клиглера (п. 4.2.4.8). Пробирки с посевами выдерживают в термостате при (37 +/- 1) °C в течение 24 часов. Производят идентификацию культур, высеянных на среду Клиглера или трехсахарный агар с мочевиной, по ферментации лактозы, глюкозы, сахарозы и расщеплению мочевины.

Покраснение или пожелтение скошенной части столбика среды указывает на образование кислоты в результате ферментации лактозы, сахарозы или обоих сахаров.

Покраснение самого столбика указывает на расщепление глюкозы.

Восстановление цвета среды до исходного (бледно-розовый) свидетельствует о расщеплении мочевины.

Механизм действия среды Клиглера идентичен с трехсахарным агаром. Об образовании сероводорода судят по почернению среды в столбике.

Если культуры сбраживают лактозу с образованием газа и расщепляют мочевину, они не принадлежат к бактериям рода сальмонелла.

Культуры, не ферментирующие лактозу и не расщепляющие мочевину, но ферментирующие глюкозу (с образованием или без образования газа), подвергаются дальнейшему изучению.

Культуры, ферментирующие глюкозу без образования газа, подозрительны как брюшнотифозные или дизентерийные.

Культуры, ферментирующие глюкозу с образованием газа, дающие в среде пузырьки и продуцирующие сероводород, могут принадлежать к роду сальмонелла.

Если ни в одной из пробок не обнаружено ни одной характерной для сальмонелл реакции, то результат считают отрицательным и дают заключение об отсутствии в исследуемой массе продукта бактерий рода сальмонелла.

3.4.5.3. Если обе пробирки покажут типичную для сальмонелл окраску сред, проводят серологическое исследование. Для этой цели берут петлей небольшое количество культуры из пробирок с трехсахарным агаром или средой Клиглера, эмульгируют в капле физиологического раствора на предметом стекле. Добавляют каплю сальмонеллезной 0-сыворотки (п. 4.2.4.9) к раствору и осторожно покачивают предметное стекло, чтобы смешать жидкости.

Положительная реакция на сальмонеллы (агглютинация) наблюдается в течение 30 - 60 сек. Обязательна постановка отрицательной реакции (культура + физиологический раствор).

Если при проведении серологического исследования агглютинации не обнаруживается, конечный результат записывают как "отрицательный".

Любая агглютинация, которая появляется на стекле, говорит о вероятности присутствия сальмонелл.

3.4.5.4. При выделении культур грамотрицательных палочек, ферментирующих глюкозу с образованием или без образования газа, не ферментирующих лактозу и сахарозу, образующих или не образующих сероводород и обладающих четкой серологической характеристикой, считают, что в исследуемой навеске продукта присутствуют бактерии рода сальмонелла. Продукт к реализации не допускается. Проводится тщательная санитарная обработка всей технологической линии.

3.5. Определение коагулазоположительных

стафилококков

3.5.1. Сущность метода.

Метод основан на способности микроорганизмов из рода Staphylococcus расти на питательных средах с повышенным содержанием поваренной соли. Наибольшее санитарно-гигиеническое значение имеет Staph. aureus (золотистый стафилококк), принадлежность к которому, в основном, определяется по способности коагулировать цитратную плазму крови человека или кролика.

3.5.2. Аппаратура, материалы и реактивы.

При проведении анализов используют аппаратуру, материалы и реактивы, перечисленные в п. 3.1.2, включая дополнительно следующие материалы и реактивы:

стерильное обезжиренное молоко;

яйцо куриное диетическое;

плазма крови кролика сухая, выпускаемая Белорусским ИЭМ;

культура коагулазоположительного стафилококка (контрольный штамм).

3.5.3. Подготовка к анализу.

3.5.3.1. Посуду и материалы стерилизуют, как указано в п. 3.1.3.1.

3.5.3.2. Приготовление разбавленного фосфатного буфера производят согласно п. 4.1.2.

3.5.4. Проведение анализа.

При исследовании смесей, употребляемых без предварительной термической обработки после восстановления (см. табл. 1), навеска продукта должна составлять (11,0 +/- 0,1) г; для смесей, употребляемых с предварительной термической обработкой, и компонентов - (1,0 +/- 0,01) г (см. табл. 1 и 2).

3.5.4.1. Взвешивают в стерильных условиях (11,0 +/- 0,1) г или (1,0 +/- 0,01) г сухой молочной смеси и помещают в колбы с (99,0 +/- 0,1) куб. см или с (9,0 +/- 0,1) куб. см разбавленного фосфатного буфера. Хорошо размешивают, как указано в п. 3.1.4.1. Смесь выдерживают в термостате при температуре (37 +/- 1) °C в течение 18 - 24 часов. На следующий день пипеткой переносят (1,0 +/- 0,01) куб. см смеси в пробирку с солевым бульоном (п. 4.2.5.1) и помещают в термостат при температуре (37 +/- 1) °C на (24 +/- 1) час.

3.5.4.2. Через (24 +/- 1) час. производят посев из бульона для получения изолированных колоний на чашки Петри со средой ЖСА (желточно-солевой агар) (п. 4.2.5.2) или на чашки с МСА (молочно-солевой агар) (п. 4.2.5.4). Чашки с посевами выдерживают в термостате при температуре (37 +/- 1) °C в течение 18 - 24 часов. На ЖСА колонии стафилококков имеют форму дисков, выпуклые, матовые, вокруг колоний наблюдаются радужные венчики и зоны помутнения среды. На МСА колонии стафилококков имеют форму дисков с диаметром 2 - 4 мм, с ровными краями, могут быть пигментированными в разнообразный цвет - белый, желтый, лимонный.

Не менее пяти характерных колоний, подозрительных на стафилококки, с каждой чашки намечают для дальнейшего исследования, из которых приготавливают мазки-препараты, окрашивают по Граму и микроскопируют. Колонии грамположительных мелких кокков, расположенных в мазке гроздьевидно, отсеивают в пробирки со скошенным мясо-пептонным агаром (п. 4.1.3), пробирки с посевами выдерживают в термостате при (37 +/- 1) °C в течение 18 - 24 часов.

Из культур, выросших на скошенном МПА, после предварительной проверки мазка на чистоту под микроскопом, ставят реакцию плазмокоагуляции.

3.5.4.3. Постановка реакции плазмокоагуляции.

В пробирку с (0,50 +/- 0,01) куб. см разведенной кроличьей плазмы (п. 4.2.5.6) вносят петлю суточной агаровой культуры. Одну пробирку с плазмой оставляют незасеянной, а в другую засевают заведомо коагулазоположительный стафилококк в качестве контроля.

Пробирки помещают в термостат при температуре (37 +/- 1) °C.

Учитывают результаты через 24 часа и оставляют до утра при комнатной температуре для окончательного учета. Ускорение реакции производят за счет использования 3- и 4-часовых бульонных культур стафилококков, добавляя их по (0,10 +/- 0,01) куб. см в (0,50 +/- 0,01) куб. см разведенной цитратной плазмы.

Пробирки на свертывание плазмы следует просматривать осторожно, чтобы не разрушить начало образования сгустка.

При учете реакции плазмокоагуляции могут наблюдаться три степени активности фермента коагулазы:

++++ - сгусток плотный;

+++ - сгусток, имеющий небольшой отсек;

++ - сгусток в виде взвешенного мешочка.

Все три варианта являются положительным результатом.

3.5.5. Обработка результатов.

3.5.5.1. Положительная реакция плазмокоагуляции свидетельствует о присутствии коагулазоположительных стафилококков в засеянной массе продукта (в 11,0 или в 1,0 г).

3.5.5.2. Отрицательная реакция плазмокоагуляции свидетельствует об отсутствии коагулазоположительных стафилококков в засеянной массе продукта (в 11,0 или в 1,0 г).

3.5.5.3. Примечание.

При обнаружении значительного роста коагулазоотрицательных стафилококков в готовых детских сухих молочных смесях микробиолог должен обратить внимание на санитарно-гигиеническое содержание предприятия, т.к. у детей грудного возраста некоторые варианты коагулазоотрицательных стафилококков (Staph. epidermidis) также способны вызывать острые стафилококковые энтериты.

3.6. Определение энтерококков

Определение энтерококков проводится в случае обнаружения в выработанной партии значительного превышения количества мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов в целях выяснения причин несоответствия изготовленного продукта этому нормативу.

3.6.1. Сущность метода.

Метод основан на количественном подсчете колоний энтерококков, вырастающих на плотных питательных средах, в состав которых входят ингибиторы (кристаллический фиолетовый, трифенилтетразолий хлористый, антибиотики: пенициллин, стрептомицин, полимиксин), подавляющие развитие других бактерий.

3.6.2. Аппаратура, материалы и реактивы.

При проведении анализа используют аппаратуру, материалы и реактивы, перечисленные в п. 3.1.2, включая дополнительно следующие материалы и реактивы:

кристаллический фиолетовый, ч.д.а., по ТУ 6-09-4119-75;

молоко обезжиренное, приготовленное по ГОСТ 9225-84, стерильное;

мясо-пептонный бульон, pH 7,2 - 7,4;

натрий хлористый, х.ч. или ч.д.а., по ГОСТ 4233-77;

полимиксин "М" сульфат по 500000 ЕД, медпрепарат;

2,3,5-трифенилтетразолий хлористый, ч.д.а., по ТУ 6-09-3838-78;

культура энтерококка (контрольный штамм);

перекись водорода (пергидроль), концентрированный раствор, по ГОСТ 177-71, 1-процентный раствор.

3.6.3. Подготовка к анализу.

Подготовку к анализу проводят, как указано в п. п. 3.1.3 и 4.1.

3.6.4. Проведение анализа.

3.6.4.1. Приготовление разведений проводят, как указано в п. 3.1.4.1.

3.6.4.2. Посев.

Из разведения продукта 1:10 берут по 0,1 куб. см и высевают на подсушенную поверхность молочной среды с полимиксином (п. 4.2.6.1) в двух чашках Петри. Посевной материал тщательно втирают шпателем в поверхность среды. Посевы инкубируют в термостате при (37 +/- 1) °C в течение (48 +/- 3) час.

3.6.4.3. Обработка результатов.

Посевы просматривают. Типичные колонии энтерококков имеют округлую форму, ровные края, блестящую поверхность, диаметр 1,5 - 2 мм и красную окраску с зоной протеолиза на светло-голубом фоне среды. Подсчитывают все типичные колонии на обеих чашках и среднеарифметическое их число умножают на 100, получая количество энтерококков в 1 г или 1 куб. см продукта.

Идентификация культур.

Три - пять колоний отсеивают на скошенный мясо-пептонный агар для дальнейшей идентификации. На скошенном агаре посевы культивируют при (37 +/- 1) °C в течение (24 +/- 1) час.

Из колоний, выросших на скошенном агаре, готовят мазки и окрашивают по Граму. Определяют каталазную активность культуры: на чистое обезжиренное стекло наносят каплю 1-процентного водного раствора перекиси водорода (п. 4.2.6.5) и в ней растирают петлю культуры. Если пузырьки газа не выделяются, значит реакция отрицательная. Кроме того, изучаемые культуры засевают в бульоны, содержащие 40% желчи (п. 4.2.6.3) и имеющие pH (9,6 +/- 0,1) (п. 4.2.6.4). Инкубируют посевы при (37 +/- 1) °C в течение 18 - 24 часов. Рост изучаемых культур в указанных бульонных средах подтверждают микроскопией мазка, окрашенного по Граму.

Энтерококки - грамположительные кокки, в мазках из жидких сред располагаются в виде коротких и длинных цепочек, с плотных - в виде диплококков или скоплений кокков; растут в бульонах с 40% желчи и при pH 9,6 - 10,2, не разлагают перекись водорода, т.к. не вырабатывают фермент каталазу.

Обнаружение значительного роста энтерококков в исследуемом продукте свидетельствует о необходимости контроля за термическим режимом технологического процесса или о проведении санитарной обработки оборудования и технологических линий.

3.7. Определение B. cereus

3.7.1. Сущность метода.

Метод основан на количественном подсчете колоний B. cereus, относящихся к спорообразующим аэробным бациллам, при росте их на плотных питательных средах с антибиотиками и яичным желтком.

3.7.2. Аппаратура, материалы и реактивы.

Для проведения анализа используют аппаратуру, материалы и реактивы, перечисление в п. 3.1.2, включая дополнительно следующие материалы и реактивы:

агар питательный сухой по ТУ 42-1433-75;

литий хлористый, 1-водный, х.ч., по ТУ 6-09-3751-74;

маннит;

натрий лимоннокислый трехзамещенный по ГОСТ 22280-76;

полимиксин "М" сульфат по 500000 ЕД, медпрепарат;

2,3,5-трифенилтетразолий хлористый по ТУ 6-09-3838-78;

яйца куриные диетические;

культура B. cereus, контрольный штамм.

3.7.3. Подготовку к анализу проводят, как указано в п. 3.1.3.

3.7.4. Проведение анализа.

3.7.4.1. Приготовление разведений проводят, как указано в п. 3.1.4.1.

3.7.4.2. Посев.

Производят посев по 0,1 куб. см из разведения продукта 1:10 (0,01 г продукта) на поверхность питательной среды в двух чашках Петри. Посевной материал тщательно растирается шпателем по поверхности питательной среды. Для посева молочных продуктов целесообразно использовать среду Донована (п. 4.2.7.1), для посева других продуктов - солевой полимиксиновый агар (п. 4.2.7.3).

Посевы инкубируют в термостате при температуре (30 +/- 1) °C <*> от 24 до 96 часов.

--------------------------------

<*> Ранее для инкубации B. cereus использовалась температура 37 °C, однако исследования отечественных авторов и рекомендации ФАО-ВОЗ и СЭВ указывают на температуру 30 °C как более оптимальную для роста B.

3.7.4.3. Обработка результатов.

При отсутствии роста на обеих чашках дают заключение о соответствии детской сухой молочной смеси нормативу на этот показатель.

При обнаружении роста изучают морфологию колоний: штаммы B. cereus на солевом полимиксиновом агаре с 2,3,5-трифенилтетразолием хлористым образуют ярко-рубиновые колонии на фоне широкой зоны глубокого равномерного коагулята, колонии в первые часы округлые, выпуклые; в дальнейшем (через 24 - 48 часов) - распластанные по поверхности агара с изрезанными краями. На среде Донована штаммы B. cereus образуют крупные белые распластанные колонии со слегка изрезанными краями, окруженные широкой зоной глубокого белого равномерного матового коагулята или двойной зоной - коагулята и просветления (лецитиназная активность).

Из типичных колоний готовят мазки и окрашивают по Граму. B. cereus - грамположительные споровые палочки, в некоторых культурах - грамотрицательные.

3.7.4.3. Идентификация культур.

Пересевают 3 - 5 колоний на скошенный агар с последующей инкубацией при температуре (30 +/- 1) °C 18 - 24 час.

Проводят микроскопию висячей и раздавленной капли для установления подвижности и посев на среду с маннитом (п. 4.2.7.5) и на кровяной агар (п. 4.2.7.4). Инкубацию посевов проводят при (30 +/- 1) °C 24 - 48 час. Культуру также пересевают в пробирку со средой Кларка (п. 4.2.3), которую инкубируют при температуре (30 +/- 1) °C в течение 48 часов для последующей постановки реакции Фогеса-Проскауэра.

Постановка реакции Фогеса-Проскауэра описана в п. 3.3.4.4.

Характерными признаками для B. cereus являются образование зон просветления на кровяном агаре (гемолитическая активность), положительные реакции на лецитиназу и Фогеса-Проскауэра, подвижность и отсутствие способности сбраживать маннит.

3.7.4.4. При обнаружении роста для определения количества B. cereus в исследуемом продукте количество выросших типичных колоний на чашках умножают на соответствующее разведение и выражают в пересчете на 1 г или 1 куб. см исследуемого продукта.

3.7.4.5. В продуктах, выработанных с соблюдением технологических правил, при посеве 0,01 г рост B. cereus должен отсутствовать, что соответствует показателю на этот микроорганизм - "менее 100 клеток/г".

При обнаружении роста микробиолог в заключении указывает подсчитанное количество B. cereus в 1 г продукта.

Если несоответствие нормативу по B. cereus выражается в обнаружении от 100 до 500 клеток/г, но при соответствии продукта другим микробиологическим показателям, то партия не задерживается для реализации, а микробиолог проводит исследования на наличие B. cereus в компонентах растительного происхождения и в случае обнаружения в них значительных количеств B. cereus дает рекомендации о возможности и путях их использования в производстве.

3.8. Определение количества дрожжей и плесеней

3.8.1. Сущность метода.

Метод основан на количественном подсчете числа колоний дрожжей и плесеней, вырастающих на плотных питательных средах с антибиотиками при температуре (24 +/- 1) °C, при посеве исследуемых продуктов.

3.8.2. Аппаратура, материалы и реактивы.

При проведении анализа используют аппаратуру, материалы и реактивы по п. 3.1.2, включая дополнительно следующие материалы и реактивы:

мальтоза;

пептон сухой ферментативный для микробиологических целей по ГОСТ 13805-76;

пенициллин (медпрепарат);

стрептомицин (медпрепарат);

левомицетин (медпрепарат);

неомицин (медпрепарат);

сусло солодовое неохмеленное (пивное);

ареометр по ГОСТ 18481-81 Е;

среда для определения дрожжей и плесеней в молоке и молочных продуктах, сухая, производства СКФ ВНИИМС.

3.8.3. Подготовка к анализу.

Подготовку к анализу проводят, как указано в п. 3.1.3.

3.8.4. Проведение анализа.

3.8.4.1. Приготовление разведений для посева проводят согласно п. 3.1.4.1.

3.8.4.2. Посев.

Для определения количества дрожжей и плесневых грибов из каждой пробы делают посев по 1 куб. см нативного продукта или по 1 куб. см разведений 1:10 и 1:100 на две чашки Петри. В каждую чашку Петри с заранее промаркированной крышкой добавляют не позднее чем через 15 - 20 мин. 14 куб. см одной из агаризованных сред: сусловый агар (п. 4.2.8.6), среда Сабуро (п. 4.2.8.7), среда для определения дрожжей и плесеней в молочных продуктах СКФ ВНИИМС (п. 4.2.8.8) <*>, охлажденной до (45 +/- 1) °C. Среду немедленно тщательно перемешивают и оставляют для застывания.

--------------------------------

<*> К средам добавляются антибиотики согласно п. 4.2.8.9.

Чашки с посевами выдерживают в термостате при температуре (24 +/- 1) °C в течение (120 +/- 5) часов - 5 суток с предварительным учетом через 3 суток.

Контроль стерильности питательных сред и воздуха проводят, как указано в п. 3.1.4.3.

3.8.4.3. Обработка результатов.

Количество колоний дрожжей и плесневых грибов подсчитывают раздельно на каждой чашке. Колонии дрожжей на указанных средах имеют беловато-желтый цвет, сметанообразную консистенцию, по мере роста и увеличения размеров приобретают перламутровый оттенок и куполообразное возвышение.

Типичные колонии плесневых грибов с поверхности покрыты пушистым мицелием, часто напоминающим вату. Окраска варьирует.

Содержание дрожжей и плесневых грибов в 1 куб. см или в 1 г продукта - (x) в КОЕ вычисляют по формуле:

                                     m

                           x = n x 10 ,

где:

n - количество колоний, подсчитанных на чашке Петри;

m - число десятикратных разведений.

За окончательный результат анализа принимают среднее арифметическое, полученное по всем чашкам.

3.8.4.4. При обнаружении в 1 г исследуемого продукта количеств дрожжевых и плесневых грибов, превышающих установленные нормативы по этим показателям, партия готового продукта к реализации задерживается для повторного расширенного микробиологического контроля. Микробиолог отбирает удвоенное количество образцов готовых детских сухих молочных смесей с проведением посева на все микробиологические показатели, указанные в табл. 1 "Методических указаний". Одновременно микробиолог должен произвести внеочередной контроль (на содержание дрожжевых и плесневых грибов) оборудования по ходу технологического процесса (контрольные точки и узлы трубопроводов) и воздуха в фасовочном отделении.

Компоненты растительного происхождения с содержанием дрожжевых и плесневых грибов, превышающим норматив не более чем в 5 раз, допускаются на изготовление сухих молочных смесей только после проведения технологических мероприятий, позволяющих снизить обсемененность.

4. Питательные среды и реактивы

4.1. Питательные среды и реактивы общего назначения

4.1.1. Концентрированный фосфатный буферный раствор.

Взвешивают (34,0 +/- 0,1) г однозамещенного фосфорнокислого калия и растворяют в (500,0 +/- 5,0) куб. см дистиллированной воды в мерной колбе вместимостью 1000 куб. см. Устанавливают pH раствора до (7,2 +/- 0,1) 1 н раствором гидроокиси натрия и доводят дистиллированной водой до 1000 куб. см. Хранят раствор в емкости, укупоренной резиновой пробкой, в условиях холодильника.

4.1.2. Разбавленный фосфатный буферный раствор с pH 7,0 - 7,2

По тексту данный раствор именуется "разбавленный фосфатный буфер".

Вносят пипеткой вместимостью 2,0 куб. см (1,25 +/- 0,01) куб. см концентрированного фосфатного буферного раствора в мерную колбу вместимостью 1000 куб. см и доводят объем дистиллированной водой до метки. Разливают разбавленный фосфатный буфер по (10,0 +/- 0,1) куб. см в пробирки, по (100,0 +/- 1,0) куб. см в колбы вместимостью 200 куб. см и по (900,0 +/- 1,0) куб. см в колбы вместимостью 1600 куб. см, закрывают ватными пробками. Стерилизуют в автоклаве при (121 +/- 2) °C в течение (18 +/- 3) мин.

4.1.3. Приготовление физиологического раствора натрия хлорида, реактивов для окраски по Граму, мясо-пептонного бульона (МПБ), мясо-пептонного агара (МПА) производят согласно ГОСТ 9225-84.

4.1.4. 1 н раствор гидроокиси натрия.

Взвешивают (40,0 +/- 0,1) г едкого натра в стакане вместимостью 100 куб. см и переносят, смывая дистиллированной водой, в мерную колбу вместимостью 1000 куб. см (1 куб. дм), доводят объем до метки и получают раствор с массовой концентрацией 40 г/куб. дм (1 н раствор NaOH).

При необходимости раствор стерилизуют автоклавированием при (121 +/- 2) °C в течение (18 +/- 3) мин.

4.1.5. 1 н раствор соляной кислоты.

В мерную колбу вместимостью 1000 куб. см наливают до половины дистиллированную воду, потом осторожно вносят (30,6 +/- 0,1) куб. см концентрированной соляной кислоты плотностью 1,19 г/куб. см. Доводят объем до метки водой и получают раствор с массовой концентрацией 36,5 г/куб. дм - (1 н и раствор HCl). При необходимости раствор стерилизуют автоклавированием при (121 +/- 2) °C в течение (18 +/- 3) мин.

4.2. Специальные питательные среды и реактивы

4.2.1. Среда для определения общего количества мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов:

    Сухой питательный агар производства           - 35 г

    ДагНИИ питательных сред

    Экстракт кормовых дрожжей производства        - 2,5 г

    МНИИВС им. Мечникова

    Глюкоза                                       - 1,0 г

    Вода дистиллированная                         - 1000,0 куб. см

    pH                                            - 7,0.

Стерилизация в автоклаве при (121 +/- 2) °C в течение (21 +/- 3) мин.

4.2.2. Среда питательная для определения общего количества бактерий в молоке и молочных продуктах из сухих питательных сред <*>

--------------------------------

<*> Использование среды 4.2.2 допускается только в ведомственных лабораториях Минмясомолпрома СССР. В арбитражных случаях использование среды 4.2.1 обязательно.

Среда готовится по прописи, указанной на этикетке.

4.2.3. Среды и реактивы для выделения бактерий группы кишечных палочек и эшерихий коли.

4.2.3.1. Среда Кесслер с лактозой.

К 1 куб. дм водопроводной воды добавляют (10,0 +/- 0,1) г пептона и 50 куб. см желчи крупного рогатого скота. Смесь кипятят на водяной бане при помешивании 20 - 30 мин. Затем фильтруют ее через ватно-марлевый фильтр, добавляют 2,5 г лактозы, доводят объем водой до 1 куб. дм. Устанавливают pH 7,4 - 7,6, используя 1 н растворы NaOH или HCl и проверяя значение pH на потенциометре или универсальной индикаторной бумагой. Добавляют 4 куб. см 1-процентного водного раствора генцианового фиолетового, разливают в колбы по 90 куб. см и в пробирки по 10 куб. см, закладывают поплавки (пробирки Уленгута) отверстием книзу.

Стерилизуют при (121 +/- 2) °C в течение 15 минут.

4.2.3.2. 1-процентный водный раствор генцианового (кристаллического) фиолетового.

Взвешивают (1,0 +/- 0,01) г генцианового (кристаллического) фиолетового, помещают в мерную колбу вместимостью 100 куб. см и доливают до метки дистиллированной водой. Раствор хранят при температуре (4 +/- 1) °C в течение 7 суток.

4.2.3.3. Среда Кесслер с лактозой из сухих питательных сред.

Среда готовится согласно прописи на этикетке банки.

4.2.3.4. Бульон с лактозой, бычьей желчью и бриллиантовым зеленым.

Взвешивают (10 +/- 0,1) г пептона и (10 +/- 0,1) г лактозы, растворяют в 500 куб. см дистиллированной воды, добавляют 20 г сухой бычьей (крупного рогатого скота) желчи, растворенной в 200 куб. см воды, или 200 куб. см жидкой стерильной желчи; доводят объем до 950 куб. см. Устанавливают pH 7,4 +/- 0,1 1 н раствором гидроокиси натрия или 1 н раствором соляной кислоты, проверяя значение pH на потенциометре или по универсальной индикаторной бумаге. Добавляют 13,3 куб. см 0,1-процентного водного раствора бриллиантового зеленого, доводят общий объем до 1 куб. дм. Готовую среду разливают по 10 куб. см в пробирки, содержащие поплавки. Стерилизуют 15 минут при (121 +/- 2) °C.

4.2.3.5. 0,1-процентный водный раствор бриллиантового зеленого.

Взвешивают (0,10 +/- 0,01) г бриллиантового зеленого, помещают в мерную колбу вместимостью 100 куб. см и доливают до метки дистиллированной водой. Раствор хранят при температуре (4 +/- 1) °C в течение 7 суток в колбе, укупоренной резиновой пробкой.

4.2.3.6. Среды Эндо с эозинметиленовым синим (Левина) из сухих питательных сред.

Среды Эндо и Левина производства ДагНИИ питательных сред готовят согласно прописям на этикетках банок. Изготовленные и разлитые в стерильные чашки Петри среды можно хранить при температуре (4 +/- 1) °C до 10 суток.

4.2.3.7. Среда на индол.

Взвешивают (10,0 +/- 0,1) г сухого панкреатического гидролизата казеина (или 100,0 куб. см жидкого панкреатического гидролизата казеина с содержанием 500 мг% аминного азота), (5,0 +/- 0,1) г хлористого натрия, (1,0 +/- 0,01) г ДЛ-триптофана, растворяют в 1000 куб. см дистиллированной воды. Доводят pH до 7,0 +/- 0,1 1 н растворами NaOH или HCl и, измеряя значение pH на потенциометре или по универсальной индикаторной бумаге, разливают в пробирки по 5 куб. см. Стерилизуют 15 минут при (121 +/- 2) °C.

4.2.3.8. Реактив на индол (Эрлиха).

Взвешивают (5,0 +/- 0,1) г пара-диметиламинобензальдегида в стеклянном стакане вместимостью 100 куб. см, помещают в коническую колбу вместимостью 200 куб. см и растворяют в (50 +/- 1) куб. см этилового спирта. С помощью мерного цилиндра вместимостью 100 куб. см медленно добавляют (50 +/- 1) куб. см концентрированной соляной кислоты. Раствор хранят в колбе с притертой пробкой при температуре (4 +/- 1) °C.

4.2.3.9. Среда Кларка.

Взвешивают (5,0 +/- 0,1) г пептона, (5,0 +/- 0,1) г глюкозы, (5,0 +/- 0,1) г двузамещенного фосфорнокислого калия. Растворяют ингредиенты в 950 куб. см дистиллированной воды, устанавливают pH 6,9 +/- 0,1, используя 1 н растворы NaOH или HCl, проверяя значение pH на потенциометре или универсальной индикаторной бумагой. Доводят общий объем до 1 куб. дм дистиллированной водой и фильтруют при необходимости. Разливают в пробирки по 5 куб. см, стерилизуют в течение 20 минут при (115 +/- 2) °C.

4.2.3.10. 90-процентный раствор этилового спирта.

Добавляют к (900 +/- 5) куб. см 96-процентного этилового спирта (60 +/- 1) куб. см дистиллированной воды в колбе емкостью 1000 куб. см.

4.2.3.11. Раствор индикатора метилового красного.

Взвешивают (0,1 +/- 0,001) г индикатора метилового красного, количественно переносят в мерную колбу вместимостью 500 куб. см, растворяют в (300 +/- 1) куб. см 90-процентного раствора этилового спирта (п. 4.2.3.10), доливают до 500 куб. см дистиллированной водой. Хранят раствор в колбе с притертой пробкой при температуре (4 +/- 1) °C.

4.2.3.12. 5-процентный раствор альфа-нафтола.

Взвешивают (5,0 +/- 0,1) г альфа-нафтола, растворяют в (100 +/- 1) куб. см абсолютного этилового спирта. При отсутствии абсолютного этилового спирта можно использовать ректификованный этиловый спирт 96°. Раствор должен быть свежеприготовленным.

4.2.3.13. 40-процентный раствор гидроокиси калия.

Взвешивают (40 +/- 0,1) г гидроокиси калия в стакане вместимостью 100 куб. см, переносят в мерную колбу вместимостью 100 куб. см, растворяют в (60,0 +/- 1) куб. см дистиллированной воды, затем доводят до метки дистиллированной водой. Раствор хранят при температуре (4 +/- 1) °C.

4.2.3.14. Среда Козера.

Взвешивают (1,5 +/- 0,1) г натрия-аммония фосфорнокислого, (1,0 +/- 0,01) г калия фосфорнокислого двузамещенного, (0,2 +/- 0,01) г магния сульфата, (3,0 +/- 0,1) г натрия лимоннокислого трехзамещенного. Растворяют в 950 куб. см дистиллированной воды. Добавляют 10 куб. см 5-процентного спиртового раствора бромтимолового синего. Устанавливают pH 6,8 1 н растворами NaOH или HCl, проверяя значение pH на потенциометре. Доводят объем дистиллированной водой до метки (1 куб. дм). Разливают по 10 куб. см в пробирки, стерилизуют в течение 15 минут при (121 +/- 2) °C.

4.2.3.15. 0,5-процентный раствор бромтимолового синего в спирте.

Взвешивают (0,5 +/- 0,01) г бромтимолового синего, помещают в мерную колбу вместимостью 100 куб. см и доводят этиловым спиртом до метки. Раствор хранят при температуре (4 +/- 1) °C в течение 30 суток.

4.2.3.16. Среда Симмонса.

Среда готовится аналогично среде Козера (п. 4.2.3.14). Но после измерения pH в нее добавляют (20 +/- 0,1 г) агара на 1 куб. дм, прогревают на водяной бане до растапливания агара, стерилизуют в течение 15 минут при (121 +/- 2) °C. Разливают в стерильные чашки Петри или пробирки.

4.2.4. Среды и реактивы для выделения бактерий рода Salmonella.

4.2.4.1. Магниевая среда.

Среда готовится из трех растворов:

    I раствор:

Пептон                                             - 8,4 г

Хлористый натрий (NaCl)                            - 14,3 г

Дрожжевой диализат                                 - 40,0 куб. см

Калий фосфорнокислый однозамещенный                - 2,85 г

Вода дистиллированная                              - 890,0 куб. см

    II раствор:

Магний хлористый кристаллический

(MgCl  x 6H O)                                     - 71,4 г

     2     2

Вода дистиллированная                              - 90,0 куб. см

    III раствор:

0,5-процентный водный раствор

бриллиантового зеленого                            - 1,8 куб. см.

После растворения всех ингредиентов растворы соединяют, разливают приготовленную таким образом среду в пробирки по 10 куб. см.

Среду стерилизуют при (112 +/- 1) °C в течение 30 мин.

4.2.4.2. 0,5-процентный и 0,1-процентный водные растворы бриллиантового зеленого.

Для приготовления 0,5-процентного раствора взвешивают (0,5 +/- 0,01) г индикатора бриллиантового зеленого, вносят в стерильную мерную колбу вместимостью 100 куб. см и доводят стерильной дистиллированной водой до метки.

Для приготовления 0,1-процентного раствора берут 10 куб. см 0,5-процентного исходного раствора индикатора и доводят до 50 куб. см в стерильной мерной колбе или цилиндре стерильной дистиллированной водой.

Растворы хранят в холодильнике в течение 7 суток.

4.2.4.3. Дрожжевой диализат.

Взвешивают (1000 +/- 10) г свежих хлебных (прессованных) дрожжей, размешивают в (1000 +/- 1) куб. см дистиллированной воды в кастрюле до состояния гомогенной массы, которую переливают в целлофановый мешок, предварительно промытый дистиллированной водой. Мешок завязывают, обмывают под струей питьевой воды, а затем дистиллированной водой и погружают в эмалированную кастрюлю, в которую предварительно наливают (1300 +/- 1) куб. см дистиллированной воды. Мешок должен быть полностью погружен в жидкость. Диализ ведут при температуре 60 - 80 °C в течение (6 +/- 0,5) час. За это время количество жидкости в кастрюле должно уменьшиться примерно в 2 раза. Затем жидкость из кастрюли переливают в стерильную бутыль и добавляют хлороформ (0,5% к объему жидкости) и сохраняют при (6 +/- 1) °C до 7 месяцев.

4.2.4.4. Среда Мюллера.

К 90 куб. см стерильного мясо-пептонного бульона добавляют:

а) 4,5 г мела, предварительно простерилизованного во флаконе сухим жаром (при 160 °C в течение 2 часов);

б) 10 куб. см раствора гипосульфита натрия (50 г чистого кристаллического гипосульфита натрия в 100 куб. см дистиллированной воды стерилизуют текучим паром в течение 30 минут);

в) 2 куб. см раствора Люголя (металлического йода 26 г, йодистого калия 20 г, дистиллированной воды 100 куб. см).

После добавления указанных ингредиентов смесь взбалтывают и разливают в пробирки по 10 - 15 куб. см.

4.2.4.5. Среды Плоскирева и висмут-сульфитный агар.

Среда Плоскирева и висмут-сульфитный агар (ВСА) выпускаются в сухом виде Дагестанским НИИ питательных сред; их следует готовить согласно прописям, указанным на этикетках банок. Изготовленные и разлитые в стерильные чашки Петри среды можно хранить в холодильнике до 10 суток.

4.2.4.6. Трехсахарный агар с мочевиной.

Трехсахарный агар с мочевиной готовят смешением следующих ингредиентов:

    дистиллированная вода                         - 100 куб. см

    сухой питательный агар                        - 2,5 г

    лактоза                                       - 1,0 г

    сахароза                                      - 1,0 г

    глюкоза                                       - 0,1 г

    мочевина                                      - 1,0 г

    железо сернокислое (FeSO  x 7H O)             - 0,02 г

                            4     2

    гипосульфит натрия (Na O  x 5H O)             - 0,03 г

                          2 3     2

    0,04-процентный водный раствор

    фенолового красного                           - 0,04 куб. см.

Тщательно перемешивают и устанавливают pH 7,2 - 7,4. Разливают в пробирки по 5 куб. см и стерилизуют текучим паром по 20 минут 3 дня подряд. После стерилизации среду скашивают. Готовая среда имеет бледно-розовый цвет.

4.2.4.7. 0,4-процентный водный раствор фенолового красного.

Взвешивают (0,1 +/- 0,001) г индикатора фенолового красного, вносят в колбу вместимостью 50 куб. см и вливают (25 +/- 0,1) куб. см дистиллированной воды. Тщательно перемешивают до полного растворения. Раствор хранят в холодильнике до 7 суток.

Для получения 0,04-процентного раствора индикатора 1 куб. см 0,4-процентного раствора смешивают с 9 куб. см дистиллированной воды.

4.2.4.8. Среда Клиглера из сухих питательных сред.

Среда готовится и стерилизуется согласно прописи на этикетке. Готовую среду скашивают в пробирках так, чтобы остался небольшой столбик (не менее 3 см высотой).

4.2.4.9. Поливалентная агглютинирующая сальмонеллезная сыворотка.

Необходимые разведения сыворотки готовят перед использованием согласно прописи в прилагаемой к коробке инструкции.

4.2.5. Среды и реактивы для выделения стафилококков.

4.2.5.1. Солевой бульон.

К (100 +/- 1) куб. см мясо-пептонного бульона (МПБ) с pH 7,2 - 7,4 в колбе вместимостью 200 куб. см добавляют (6,5 +/- 0,1) г хлористого натрия и разливают в пробирки по (10,0 +/- 0,1) куб. см. Стерилизуют в автоклаве при (121 +/- 2) °C в течение (20 +/- 3) мин.

4.2.5.2. Желточно-солевой агар (ЖСА).

Основа - солевой агар: к мясо-пептонному бульону (МПБ) с pH 7,2 - 7,4 добавляют 2% агара и 6,5% хлористого натрия, расплавляют на водяной бане, при необходимости фильтруют через ватно-марлевый фильтр, разливают мерным цилиндром по (100 +/- 1) куб. см в колбы вместимостью 250 куб. см и стерилизуют при (121 +/- 2) °C в течение (30 +/- 3) мин. Получают солевой агар. Вместо мясо-пептонного бульона можно использовать сухой питательный агар, добавив к нему только 6,5% хлористого натрия.

ЖСА: на (100 +/- 1) куб. см стерильного расплавленного и остуженного до (45 +/- 2) °C солевого агара добавляют (20 +/- 0,1) куб. см эмульсии яичного желтка. После полного размешивания желточно-солевой агар разливают в стерильные чашки Петри по 20 - 25 куб. см и хранят в холодильнике до 5 - 7 дней.

4.2.5.3. Эмульсия яичного желтка.

На дно стерильной чашки Петри помещают куриное яйцо, которое тщательно протирают ватой, смоченной этиловым спиртом. Стерильным пинцетом пробивают с двух противоположных сторон яйца два отверстия. Через одно из этих отверстий из яйца полностью удаляют белок, а затем, несколько увеличив отверстие, выливают желток в стерильную колбу вместимостью 200 куб. см. К желтку постепенно добавляют (частями по 20 - 30 куб. см) 180 - 200 куб. см стерильного физиологического раствора, затем содержимое тщательно встряхивают до получения гомогенной массы.

4.2.5.4. Молочно-солевой агар (MCA).

В качестве основы МСА используется солевой агар, приготовляемый так же, как для ЖСА по п. 4.2.5.2.

На (100 +/- 1) куб. см стерильного расплавленного и остуженного до (45 +/- 2) °C солевого агара добавляют (10 +/- 0,1) куб. см стерильного обезжиренного молока. Среду тщательно перемешивают и разливают по чашкам.

4.2.5.5. Стерильное обезжиренное молоко.

Свежее молоко центрифугируют при 3000 об./мин. в течение (20 +/- 3) мин. Снимают чайной ложкой отделившийся верхний слой жира, разливают молоко в колбы или пробирки, закрывают ватными пробками и стерилизуют в автоклаве текучим паром 2 дня подряд по (30 +/- 3) мин. при (115 +/- 1) °C в течение (15 +/- 2) мин.

4.2.5.6. Цитратная плазма кролика.

Цитратная плазма кролика для реакции плазмокоагуляции выпускается в сухом виде. Готовят непосредственно перед употреблением согласно прописи в прилагаемом наставлении.

4.2.6. Среды и реактивы для выделения энтерококков.

4.2.6.1. Молочная среда с полимиксином по Калине Г.П.

К (1000 +/- 5) куб. см мясо-пептонного бульона (МПБ) добавляют (5,0 +/- 0,1) г натрия хлористого, (15,0 +/- 0,1) г агара. Стерилизуют при 121 °C в течение 20 минут. Полученный таким образом основной агар расплавляют и охлаждают до (45 +/- 1) °C. К (85,0 +/- 1,0) куб. см основного агара добавляют (1,25 +/- 0,01) куб. см 0,01-процентного водного раствора кристаллического фиолетового, (0,50 +/- 0,01) куб. см 10-процентного водного раствора 2,3,5-трифенилтетразолия хлористого, (15,0 +/- 0,1) куб. см стерильного обезжиренного молока, 20000 - 40000 ЕД полимиксина "М". Все ингредиенты асептически смешиваются и среду тонким слоем разливают в чашки Петри. Чашки со средой можно хранить в холодильнике в течение 7 - 10 суток.

4.2.6.2. Стерильное обезжиренное молоко готовится согласно п. 4.2.5.5.

4.2.6.3. Бульон с 40% желчи.

К (60 +/- 0,1) куб. см мясо-пептонного или питательного бульона прибавляют (40 +/- 0,1) куб. см нативной профильтрованной желчи крупного рогатого скота. Устанавливают pH 7,2 - 7,4 и разливают в пробирки по (5 +/- 0,1) °C. Стерилизуют при (121 +/- 1) куб. см в течение (18 +/- 3) мин.

4.2.6.4. Бульон с pH 9,6.

Мясо-пептонный или питательный бульон с pH 7,2 - 7,4 нейтрализуют 1 н раствором гидроокиси натрия до pH 9,6, проверяя значение pH универсальной индикаторной бумагой или по потенциометру. Разливают в пробирки или флаконы и стерилизуют при (121 +/- 1) °C в течение (18 +/- 3) мин.

4.2.6.5. 1-процентный раствор перекиси водорода.

К (320 +/- 1) куб. см дистиллированной воды в колбе вместимостью 400 куб. см добавить (10 +/- 0,01) куб. см концентрированного раствора пергидроля с исходной концентрацией 33%. Тщательно перемешать, перелить в колбу с притертой пробкой. Хранить в холодильнике в колбе, обернутой темной бумагой.

4.2.7. Среды и реактивы для выделения Bac. cereus.

4.2.7.1. Среда Донована.

К (1000 +/- 5) куб. см питательного или мясо-пептонного агара добавляют (2,5 +/- 0,1) г трехзамещенного цитрата натрия, (2,5 +/- 0,1) г хлористого лития, стерилизуют при (110 +/- 2) °C в течение (30 +/- 3) мин., охлаждают до 45 - 50 °C и добавляют полимиксин "М" - 200000 ЕД и эмульсию двух желтков. Тщательно перемешивают и разливают в чашки Петри, которые можно хранить в холодильнике не более 7 - 10 суток.

4.2.7.2. Эмульсия яичных желтков.

Асептически отделяют от яиц 2 желтка, как описано в п. 4.2.5.3. К желткам добавляют 10 куб. см стерильного физиологического раствора, тщательно встряхивают для получения гомогенной массы.

4.2.7.3. Солевой полимиксиновый агар с 2,3,5-трифенилтетразолием хлористым.

К (1000 +/- 5) куб. см 2-процентного питательного или мясо-пептонного агара добавляют (60,0 +/- 0,1) г хлористого натрия, 200000 - 400000 ЕД полимиксина "М", 0,1 - 0,2 г 2,3,5-трифенилтетразолия хлористого, эмульсию двух желтков.

Полимиксин, 2,3,5-тетразолий хлористый и эмульсию желтков добавляют в агар после расплавления и охлаждения до (45 +/- 5) °C, хорошо перемешивают и разливают в чашки Петри. Хранят среду в холодильнике не более 7 - 10 суток.

4.2.7.4. Кровяной агар.

К 100 куб. см расплавленного и остуженного до (45 +/- 5) °C 2-процентного мясо-пептонного агара добавляют 5 куб. см дефибринированной крови <*> человека, барана или кролика, тщательно перемешивают и разливают в стерильные чашки Петри. Приготовленную среду хранят в холодильнике до 5 суток.

--------------------------------

<*> В качестве антикоагулянта применяют 5% раствор лимоннокислого натрия или 5% раствор щавелевокислого натрия (или калия). Антикоагулянт берут из расчета 1 объем на 9 объемов крови (1:9).

4.2.7.5. Среда с маннитом.

В дистиллированную воду прибавляют 1% пептона и 0,5% хлористого натрия. Растворяют при нагревании, прибавляют 0,1% спиртового (1,6%) раствора бромкрезолового пурпурного в спирте (можно бромтимолового синего), нагревают до 80 °C и устанавливают pH (7,2 +/- 0,1), проверяя значение на потенциометре. Затем среду кипятят 5 минут, фильтруют и доливают до первоначального объема дистиллированной водой. Добавляют 0,5 - 1% маннита, разливают по пробирками с поплавками. Стерилизуют автоклавированием при 0,5 атм. (15 +/- 1) мин.

4.2.7.6. 1,6-процентный раствор бромкрезолового пурпурного в спирте.

Взвешивают (1,6 +/- 0,01) г индикатора бромкрезолпурпурного и количественно переносят в мерную колбу вместимостью 100 куб. см. Добавляют 96-процентным этиловым спиртом до метки. При необходимости фильтруют через бумажный фильтр. Хранят в колбе со шлифом в условиях холодильника.

4.2.8. Среды и реактивы для выделения дрожжевых и плесневых грибов.

4.2.8.1. Приготовление раствора пенициллина.

Во флакон с пенициллином, содержащим 500000 ЕД, добавляют 5 - 7 куб. см стерильной дистиллированной воды, тщательно перемешивают для растворения. Содержимое флакона переносят в стерильную мерную колбу вместимостью 100 куб. см и доводят до метки стерильной дистиллированной водой при температуре (35 - 40) °C. Получают раствор пенициллина, содержащий 5000 ЕД/куб. см.

При использовании флаконов с пенициллином другой активности (250000 ЕД, 125000 ЕД) его растворяют в мерных колбах соответствующей вместимости.

4.2.8.2. Приготовление раствора стрептомицина.

400 мг стрептомицина вносят в стерильную мерную колбу вместимостью 100 куб. см, добавляют 10 - 20 куб. см стерильной дистиллированной воды при температуре 35 - 40 °C, перемешивают до растворения, затем доливают стерильной дистиллированной водой до метки. Массовая доля стрептомицина в растворе - 0,4%.

4.2.8.3. Приготовление раствора неомицина.

500 мг неомицина вносят в стерильную мерную колбу вместимостью 100 куб. см, добавляют 10 - 20 куб. см стерильной дистиллированной воды при температуре (35 - 40) °C, перемешивают до растворения, затем доливают стерильной дистиллированной водой до метки. Массовая доля неомицина в растворе - 0,5%.

4.2.8.4. Приготовление раствора левомицетина (хлорамфеникола). 400 мг левомицетина вносят в стерильную мерную колбу вместимостью 100 куб. см, добавляют 10 - 20 куб. см стерильной дистиллированной воды при температуре 35 - 40 °C, перемешивают до растворения, затем доливают стерильной дистиллированной водой до метки. Массовая доля левомицетина в растворе - 0,4%.

4.2.8.5. Приготовление солодового сусла.

Неохмеленное пивное солодовое сусло фильтруют через ватно-марлевый фильтр или фильтровальную бумагу, стерилизуют в автоклаве при (107 - 110) °C 30 мин. Затем в сусле определяют содержание сухих веществ ареометром, считая каждые 5 делений равными 1% сухих веществ. Сусло разбавляют водопроводной водой до массовой доли сухих веществ 7 - 8%, разливают в колбы и стерилизуют при (116 +/- 1) °C в течение (20 +/- 1) мин. Солодовое сусло можно заменить виноградным суслом, доводя массовую долю сухих веществ в этих растворах до 7 - 8%.

4.2.8.6. Сусловый агар.

К (1000 +/- 1) куб. см солодового неохмеленного сусла с массовой долей сухих веществ 7 - 8% прибавляют 20 - 30 г агара. Среду нагревают до печного расплавления агара и фильтруют через гигроскопическую вату или фильтровальную бумагу. Охлаждают до (50 +/- 5) °C и устанавливают pH (4,5 +/- 0,5). Фильтруют, разливают в колбы или пробирки и стерилизуют 15 - 20 минут при (116 +/- 1) °C. Готовую среду хранят в холодильнике при температуре (5 +/- 1) °C не более 14 суток.

4.2.8.7. Среда Сабуро.

К (1000 +/- 5) куб. см дистиллированной воды добавляют (18 +/- 0,1) г агара и оставляют на (30 +/- 1) мин. для его набухания, затем добавляют (40 +/- 0,1) г мальтозы или глюкозы и (10 +/- 0,1) г пептона и плавят среду, поднимая температуру до (120 +/- 2) °C (без выдержки) в автоклаве. Давлению дают упасть, расплавленную среду фильтруют через ватно-марлевый фильтр, разливают и стерилизуют при (115 +/- 1) °C в течение (20 +/- 3) мин. pH среды после стерилизации должен составлять (6,5 +/- 0,1).

4.2.8.8. Среда для определения дрожжей и плесеней в молоке и молочных продуктах из сухих питательных сред производства СКФ ВНИИМС.

Среда готовится по прописи на этикетке.

4.2.8.9. Для повышения элективности питательных сред (п. п. 4.2.8.6, 4.2.8.7, 4.2.8.8), применяемых для определения дрожжей и плесневых грибов, добавляют антибиотики согласно нижеприведенной схеме:

СХЕМА ДОБАВЛЕНИЯ АНТИБИОТИКОВ В ПИТАТЕЛЬНЫЕ СРЕДЫ

┌────────────┬───────────────────────────────────────────────────┐

│Объем пита- │Объем добавляемых к средам растворов антибиотиков, │

│тельной сре-│                      куб. см                      │

│ды, куб. см ├───────────┬────────────┬────────────┬─────────────┤

│            │пенициллин │стрептомицин│  неомицин  │ левомицетин │

├────────────┼───────────┼────────────┼────────────┼─────────────┤

│    990     │    10     │     10     │     -      │      -      │

│    930     │    -      │     -      │     70     │      -      │

│    975     │    -      │     -      │     -      │      25     │

└────────────┴───────────┴────────────┴────────────┴─────────────┘

Водные растворы антибиотиков, приготовленные согласно п. п. 4.2.8.1, 4.2.8.2, 4.2.8.3, 4.2.8.4, добавляют к расплавленной и охлажденной до 45 - 47 °C питательной среде.

Пенициллин и стрептомицин добавляются сочетанно, неомицин и левомицетин - раздельно, в зависимости от того, какой из антибиотиков имеется в наличии.

Допускается левомицетин стерилизовать вместе с питательной средой в течение (15 +/- 1) мин. при температуре (121 +/- 1) °C.

Среды с антибиотиками хранению не подлежат.

5. Литература

1. Инструкция о порядке расследования, учета и проведения лабораторных исследований в учреждениях санитарно-эпидемиологической службы при пищевых отравлениях. Утверждена зам. министра здравоохранения СССР 20.12.73 N 1135-73.

2. Инструкция по микробиологическому контролю производства на предприятиях молочной промышленности. Утверждена Минмясомолпромом СССР 07.05.76, г. Москва, 1978.

3. Инструкция по микробиологическому контролю производства на молочно-консервных комбинатах детских продуктов. М., 1979.

4. Инструкция по микробиологическому контролю производства жидких и пастообразных детских молочных продуктов. Утверждена 07.01.80.

5. Калина Г.П., Чистович Г.Н. Санитарная микробиология. М., 1969.

6. Королева Н.С., Семенихина В.Ф. Санитарная микробиология молока и молочных продуктов. М., Пищевая промышленность, 1980.

7. Методические указания по санитарно-бактериологическому контролю на предприятиях общественного питания и торговли пищевыми продуктами. Утверждены зам. гл. гос. сан. врача СССР 31.12.82 N 2657-82.

8. Методическая инструкция по санитарно-микробиологическому контролю производства кулинарных изделий из рыбы и нерыбных объектов морского промысла. Утверждена Минрыбхозом СССР 15.12.77 и зам. гл. гос. сан. врача СССР 09.03.78.

9. Методические указания по проведению санитарно-бактериологических исследований на предприятиях, вырабатывающих кондитерские кремовые изделия. Утверждены зам. гл. гос. сан. врача СССР 26.09.75 N 1351-75.

10. Микробиологические аспекты гигиены пищевых продуктов. Доклад Комитета экспертов ВОЗ с участием ФАО. СТД. 598, Женева, 1978.

11. Молоко и молочные продукты. Методы микробиологических исследований. ГОСТ 9225-68.

12. Молоко и молочные продукты. Отбор проб и подготовка их к испытанию. ГОСТ 3622-68.

13. Пищевые продукты с промежуточной влажностью. М., Пищевая промышленность, 1980.

14. Санитарно-технологические требования к производству продуктов детского и лечебного питания на молочной основе. Утверждены Министерством мясной и молочной промышленности СССР 16.09.80.

15. Сборник инструкций по производству сухих молочных смесей для детского питания. Москва, 1980.

16. Смеси молочные сухие для детского питания. Технические условия. ТУ 49.689-82.

17. Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследования. М., Медицина, 1973.

18. Справочник по санитарной микробиологии. Кишинев, 1981.

19. Шаманова Г.П., Киселева Р.М. Производство сухих молочных продуктов детского питания. М., Пищевая промышленность, 1978.

20. Краткий определитель бактерий Берги. М., Мир, 1980.