Утверждаю

Заместитель Главного

государственного

санитарного врача СССР

А.И.ЗАИЧЕНКО

22 мая 1985 г. N 3890-85

ВРЕМЕННЫЕ МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

ПО ОПРЕДЕЛЕНИЮ ОСТАТОЧНЫХ КОЛИЧЕСТВ ПРЕПАРАТА 320-К

В ЗЕРНЕ И ВОДЕ ТОНКОСЛОЙНОЙ ХРОМАТОГРАФИЕЙ

Настоящие Методические указания предназначены для санитарно-эпидемиологических станций и научно-исследовательских учреждений Минздрава СССР, а также ветеринарных, агрохимических, контрольно-токсикологических лабораторий Агропрома СССР и лабораторий других министерств и ведомств, занимающихся анализом остаточных количеств пестицидов и биопрепаратов в продуктах питания, кормах и внешней среде.

Срок действия временных методических указаний устанавливается до утверждения гигиенических регламентов.

Методические указания апробированы и рекомендованы в качестве официальных Группой экспертов при Госкомиссии по химическим средствам борьбы с вредителями, болезнями растений и сорняками Госагропрома СССР.

Методические указания согласованы и одобрены отделом перспективного планирования санэпидслужбы ИМПиТМ им. Марциновского Е.И. и Лабораторным советом при Главном санитарно-эпидемиологическом управлении Минздрава СССР.

1. Краткая характеристика препарата

Препарат 320-К - новый отечественный гаметоцид для стерилизации пыльцы зерновых культур и подсолнечника. Действующее начало препарата - калиевая соль цис-2-метил-3-циклогексенкарбоновой кислоты.

       CH

       │ 3

      / \   COOK                                        C H  O K.

     /   \ /                                             8 11 2

    ││    │

    ││    │                                             Мол. масса 178,264.

     \   /

      \ /

    В  чистом  виде  соль  320-К  -  твердое  вещество белого цвета, весьма

гигроскопичное,  хорошо  растворимое  в  воде,  практически нерастворимое в

органических растворителях.

    ЛД    для  белых беспородных  мышей - 1,417  г/кг, введение препарата в

      50

желудок  белых  крыс  на  уровне 1000 мг/кг массы тела не  вызывало  гибели

животных.

ПДК в зерне и воде еще не установлено.

2. Методика определения препарата 320-К в зерне и воде

тонкослойной хроматографией

2.1. Основные положения

2.1.1. Принцип метода

Метод основан на превращении соли 320-К в кислоту 320 (цис-2-метил-3-циклогексенкарбоновую) и экстракции последней ацетоном, обработкой измельченного зерна смесью 0,1 н HCl и ацетона. После упаривания ацетона кислоту 320 извлекают из водного слоя бензолом. Конечное определение проводят хроматографией на пластинках Silufol UV 254.

2.1.2 Метрологическая характеристика метода

    Диапазон измеряемых концентраций

      0,1 - 0,5 мг/кг в зерне

      0,002 - 0,02 мг/кг в воде

    Предел обнаружения - 2 - 10 мкг в хроматографируемой пробе.

    Предел обнаружения - 0,1 мг/кг в зерне и 0,002 мг/кг в воде.

                                                                      _

    Среднее  значение  определения  стандартных  количеств  препарата с при

    n = 15

      85,0% в зерне

      80,0% в воде

    Стандартное отклонение S при n = 15

      +/- 10,0% для зерна

      +/- 8,0% для воды

    Относительное стандартное S

                               2

      +/- 12,9 для зерна

      +/- 10,3 для воды

    Доверительный интервал среднего при р = 0,95 и n = 5

      85,0 +/- 12,9% для зерна

      80,0 +/- 10,3% для воды

    Размах варьирования R

      70 - 100% для зерна

      70 - 95% для воды

2.1.3. Избирательность метода

Метод селективен. Хлорорганические и фосфорорганические пестициды определению не мешают.

2.2. Реактивы и материалы

Ацетон, ГОСТ 2603-71, осч

Бензол, ГОСТ 5955-75, осч

Диоксан, ГОСТ 10455-63, хч

Хлороформ, ТУ 6-09-4263-76, хч

Спирт этиловый 96-процентный, ТУ 6-09-1710-77

Муравьиная кислота, ГОСТ 5848-73, хч

Уксусная кислота, ГОСТ 18290-72, хч

Натрий углекислый кислый, ГОСТ 4283-79, хч

Натрий фосфорнокислый двузамещенный, ГОСТ 11773-76, хч

Магний сернокислый, ГОСТ 4523-77, хч

Соляная кислота, ГОСТ 3118-77, хч

Цис-2-метил-3-циклогексенкарбоновая кислота (320)

Индикаторная универсальная бумага, ТУ 6-09-1181-71

Бромфеноловый синий индикатор, ТУ 6-09-1058-76, чда

Метиловый красный индикатор, ТУ 6-09-4070-75, чда

Стандартные растворы кислоты 320 в бензоле с содержанием 100 мкг (раствор А) и 10 мкг (раствор Б)

Спиртовой раствор бромфенолового синего и метилового красного (раствор В)

Водный 0,1 М раствор натрия фосфорнокисл. двузамещен. (раствор Г)

Пластинки Silufol UV 254 15 х 15 см

0,1 н раствор соляной кислоты

5-процентный раствор бикарбоната натрия

2.3. Приборы, аппаратура и посуда

Гомогенизатор тканей типа РТ-1

Магнитная мешалка типа ММ 2А (Чехословакия)

Ротационный вакуумный испаритель типа Unipan-350 (Польша)

Весы аналитические типа ВЛА-200М

Микрошприц на 10 мкл типа МШ-10, ТУ 2-833-106

Колбы мерные, ГОСТ 1770-74, емкостью 100 мл

Колбы плоскодонные с притертыми пробками, ГОСТ 10394-72, на 100 мл

Колбы круглодонные с притертыми пробками, ГОСТ 10394-72, емкостью 100 мл и 20 мл

Воронки Бюхнера, ГОСТ 9147-81

Пипетки, ГОСТ 1770-74, на 1 мл и 10 мл

Цилиндры мерные, ГОСТ 1770-74, на 100 мл, 50 мл и 10 мл

Камеры хроматографические, ГОСТ 10565-75

Воронки делительные, ГОСТ 10054-75, на 250 мл и 1500 мл

Пульверизатор стеклянный, ГОСТ 10391-74

Пробирки калиброванные, ГОСТ 10394-72, на 5 мл

2.4. Подготовка к определению

2.4.1. Приготовление стандартных растворов кислоты 320 в бензоле

Для приготовления стандартного раствора А в мерной колбе емкостью 100 мл взвешивают 100 мг кислоты 320 с точностью +/- 0,0002 г. Содержимое колбы растворяют в 30 мл бензола и затем доводят объем раствора до метки тем же растворителем. Для приготовления раствора Б из раствора А пипеткой отбирают 10 мл, переносят в мерную колбу емкостью 100 мл и добавлением бензола доводят объем раствора до метки.

Растворы А и Б при хранении при комнатной температуре стабильны в течение года.

2.4.2. Приготовление растворов для проявления хроматограмм

Для приготовления раствора В в мерной колбе на 100 мл взвешивают 20 мг бромфенолового синего и 60 мг метилового красного, растворяют красители в 50 мл спирта и прибавлением спирта доводят объем раствора до метки.

Раствор красителей при хранении в течение месяца в холодильнике стабилен.

    Для  приготовления  раствора  Г  в мерной колбе на 100  мл  растворяют:

г Na HPO  х 12 H O в 50 мл воды и доводят объем раствора до 100 мл.

    2   4       2

Раствор Г стабилен при хранении при комнатной температуре в течение года.

Раствор для проявления хроматограмм опрыскиванием готовят непосредственно перед употреблением смешиванием равных объемов растворов В и Г.

2.5. Отбор проб

Отбор проб для анализа проводят в соответствии с утвержденными Министерством здравоохранения СССР "Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, продуктов питания и объектов внешней среды для определения микроколичеств пестицидов" (N 2051-79 от 21.08.79).

Из партии зерна, подлежащей анализу, отбирают 11 г (при необходимости зерно предварительно подсушивают), измельчают с помощью гомогенизатора тканей и отбирают навеску массой 10 г.

2.6. Проведение определения

    Навеску  измельченного  зерна (10 г) помещают в коническую плоскодонную

колбу  емкостью  100 мл, добавляют 10 мл 0,1 н HCl и 20 мл ацетона. Кислоту

320  экстрагируют  перемешиванием  в  течение  часа  на  магнитной мешалке.

Экстракт  отделяют  от  зерна  фильтрованием  на воронке Бюхнера с бумажным

фильтром, собирая в круглодонную колбу емкостью 100 мл. Экстракцию ацетоном

(порциями  по  20  мл) повторяют еще два раза. Из объединенного экстракта с

помощью ротационного вакуумного испарителя упаривают ацетон (на поверхности

водного  остатка  появляются  жирные  пятна).  Водный  остаток  переносят в

делительную  воронку  емкостью 250 мл, колбу дважды смывают подкисленной до

pH = 3 водой (порциями по 5 мл) и дважды бензолом (порциями по 5 мл). Сливы

также  переносят в делительную воронку. Далее водный слой отделяют и трижды

экстрагируют бензолом (объем бензола каждый раз равен объему водного слоя).

Объединенный   бензольный  экстракт  энергично  перемешивают  10  минут  на

магнитной мешалке с 5-процентным раствором  NaHCO ,  прибавляя  последний в

                                                 3

количестве,  необходимом  для  того,  чтобы  рН  смеси  был  9 - 10.  После

обработки водный  слой  отделяют на делительной  воронке, а бензольный слой

промывают 3 раза водой (объем воды равен 1/4 объема бензольного слоя). Воду

от промывки объединяют с водным слоем. Суммарный водный слой подкисляют 0,1

н HCl до рН  3 и трехкратно экстрагируют бензолом (объем бензола каждый раз

равен  объему  водного слоя). Объединенный  бензольный  экстракт  сушат над

прокаленным  MgSO ,  далее  сушитель   отфильтровывают,   промывают   сухим

                 4

бензолом,  который  после  промывки  объединяют  с  бензольным  экстрактом.

Полученный  бензольный  раствор  упаривают  сначала  с помощью ротационного

вакуумного  испарителя, а затем струей воздуха до объема 0,5 мл и с помощью

капилляра количественно наносят на пластинку Silufol UV 254.

Для обнаружения препарата 320-К в воде пробу воды - 1 литр помещают в делительную воронку емкостью 1500 мл, воду подкисляют конц. HCl до рН 3 и экстрагируют кислоту 320 бензолом трижды порциями по 100 мл. Бензольный экстракт сушат над прокаленным сульфатом магния, фильтруют порциями через бумажный фильтр в круглодонную колбу емкостью 20 мл. Далее поступают, как описано выше для зерна.

Условия хроматографирования.

Сконцентрированный до 0,2 - 0,5 мл экстракт с помощью стеклянного капилляра количественно с помощью бензола переносят на пластинку Silufol UV 254 размером 15 x 15 см. Справа и слева на пластинку наносят серию стандартных растворов кислоты 320 с содержанием последней 1, 2, 3, 4 и 5 мкг. Серию стандартных растворов кислоты 320 получают следующим образом: в градуированные пробирки на 5 мл пипеткой последовательно помещают 0,1, 0,2, 0,3, 0,4 и 0,5 мл стандартного раствора Б, что соответствует 1, 2, 3, 4 и 5 мкг кислоты 320. В последних трех пробирках концентрируют раствор до 0,2 - 0,3 мл струей воздуха. Затем из каждой пробирки капилляром количественно с помощью бензола переносят стандарты на хроматографическую пластинку.

    Хроматограмму  развивают  в системе бензол:диоксан:хлороформ:муравьиная

кислота   (5:1:2:0,02)   или  в  системе  бензол:диоксан:хлороформ:уксусная

кислота (10:2:5:0,02). Хроматограмму сушат на воздухе, а затем обрабатывают

опрыскиванием из пульверизатора проявителем, приготовленным непосредственно

перед  обработкой  смешением  равных  объемов  растворов В и Г. Кислота 320

проявляется  на  хроматограмме  в виде красного пятна на зеленом фоне, R  в

                                                                        f

первой системе - 0,39 +/- 0,1, а во второй - 0,64 +/- 0,4.

2.7. Обработка результатов анализа

Количественное определение препарата 320-К проводят методом соотношения со стандартами по площади и плотности пятна кислоты 320.

Содержание препарата 320-К в мг/кг или в мг/л вычисляют по формуле:

                               А х V х 178,264

                           Х = ----------------,

                               Р х V  х 140,184

                                    а

    где:

    А  -  количество  кислоты  320,  найденное  в  пробе путем сравнения со

стандартами, мкг;

    Р - навеска зерна в г или объем анализируемой воды в мл;

    178,264 - мол. вес препарата 320-К;

    140,184 - мол. вес кислоты 320;

    V - конечный объем раствора, мл;

    V  - объем аликвоты, взятой для хроматографирования, мл.

     а

3. Требования безопасности

Необходимо соблюдать правила безопасности, принятые для работы с легко воспламеняющимися жидкостями и концентрированными кислотами.

4. Настоящая Методика разработана сотрудниками Института биоорганической химии им. Шемякина АН СССР Егоровым И.В. и Граменицкой В.Н.

5. Методические указания апробированы во ВНИИХСЗР (Новикова К.Ф.) и в институте органической химии им. Зелинского (Громова Г.П.).