"Методические указания по идентификации гамма-ГХЦГ, его изомеров (альфа-, бета- и дельта-ГХЦГ) и метаболитов (полихлорированных фенолов) в биологических жидкостях (крови), органах, тканях и субклеточных фракциях печени теплокровных животных методом тонкос // Технорма.RU

Утверждены

Минздравом СССР

3 января 1985 г. N 3194-85

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

ПО ИДЕНТИФИКАЦИИ ГАММА-ГХЦГ, ЕГО ИЗОМЕРОВ (АЛЬФА-, БЕТА

И ДЕЛЬТА-ГХЦГ) И МЕТАБОЛИТОВ (ПОЛИХЛОРИРОВАННЫХ ФЕНОЛОВ)

В БИОЛОГИЧЕСКИХ ЖИДКОСТЯХ (КРОВИ), ОРГАНАХ, ТКАНЯХ И

СУБКЛЕТОЧНЫХ ФРАКЦИЯХ ПЕЧЕНИ ТЕПЛОКРОВНЫХ ЖИВОТНЫХ

МЕТОДОМ ТОНКОСЛОЙНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ

Краткая характеристика препаратов приведена в таблице 9.

Таблица 9

ХАРАКТЕРИСТИКА ПРЕПАРАТОВ

┌──────────────────────────┬────────────┬───────────────────────┬──────────────┐

│ Пестицид │Молекулярная│ Температура, °C │Давление паров│

│ │ масса ├─────────────┬─────────┤при 20 °C, Па │

│ │ │ плавления │ кипения │ │

├──────────────────────────┼────────────┼─────────────┼─────────┼──────────────┤

│1,2,3,4,5,6- │291 │112,8 │ │4,0 │

│Гексахлорциклогексан, │ │ │ │ │

│гамма-изомер (линдан, │ │ │ │ │

│гамма-ГХЦГ) │ │ │ │ │

│1,2,3,4,5,6- │291 │157,5 - 158,5│ │2,67 │

│Гексахлорциклогексан, │ │ │ │ │

│альфа-изомер ГХЦГ │ │ │ │ │

│1,2,3,4,5,6- │291 │309 │ │6,67 │

│Гексахлорциклогексан, │ │ │ │ │

│бета-изомер ГХЦГ │ │ │ │ │

│1,2,3,4,5,6- │291 │138 - 139 │ │2,67 │

│Гексахлорциклогексан, │ │ │ │ │

│дельта-изомер ГХЦГ │ │ │ │ │

│4-Хлорфенол (4-ХФ) │128,5 │49,9 │217 │- │

│2,4-Дихлорфенол (2,4-ДХФ) │163 │45 │210 │- │

│2,4,5-Трихлорфенол │197,5 │- │- │- │

│(2,4,5-ТХФ) │ │ │ │ │

│2,4,6-Трихлорфенол │197,5 │60 │246 │- │

│(2,4,6-ТХФ) │ │ │ │ │

│2,3,4,6-Тетрахлорфенол │221,5 │- │- │- │

│(2,3,4,6-ТеХФ) │ │ │ │ │

│2,3,4,5,6-Пентахлорфенол │226 │191 │310 │0,01 │

│(ПХФ) │ │ │ │ │

│Гексахлорбензол (ГХБ) │284,8 │231 │322 │- │

└──────────────────────────┴────────────┴─────────────┴─────────┴──────────────┘

Принцип метода. Методика основана на тонкослойном хроматографическом определении гамма-гексахлорциклогексана, его альфа-, бета- и дельта-изомеров и метаболитов при совместном присутствии в биологическом материале теплокровных.

Метрологическая характеристика метода приведена в таблице 10. Пределы обнаружения изомеров и метаболитов гексахлорциклогексана указаны в таблице 11.

Таблица 10

МЕТРОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА

МЕТОДА ОПРЕДЕЛЕНИЯ ИЗОМЕРОВ ГХЦГ И ХЛОРФЕНОЛОВ

ТОНКОСЛОЙНОЙ ХРОМАТОГРАФИЕЙ В БИОСРЕДАХ

┌─────────┬───────────────┬────────────┬───────────┬─────────────┬─────────────┐

│Пестицид │ Анализируемый │ Среднее │Стандартное│Относительное│Доверительный│

│ │ объект │ значение │отклонение,│ стандартное │ интервал, │

│ │ │определения,│ +/- % │отклонение, %│ +/- % │

│ │ │ % │ │ │ │

├─────────┼───────────────┼────────────┼───────────┼─────────────┼─────────────┤

│ГХБ │Кровь │44,00 │5,47 │0,12 │6,78 │

│ │Почки │59,40 │16,79 │0,28 │20,81 │

│ │Печень │53,40 │14,52 │0,27 │17,99 │

│ │Сердце │63,00 │7,42 │0,12 │9,20 │

│ │Мозг │93,00 │15,65 │0,17 │19,39 │

│ │Жир │53,50 │19,64 │0,37 │24,34 │

│ │Митохондрии │83,33 │10,79 │0,13 │26,84 │

│ │Ядра │90,00 │7,07 │0,08 │17,59 │

│ │Постмикросо- │85,00 │11,18 │0,13 │27,81 │

│ │мальная фракция│ │ │ │ │

│альфа- │Кровь │50,00 │0 │0 │0 │

│ГХЦГ │Почки │59,03 │6,01 │0,10 │14,95 │

│ │Печень │27,77 │11,82 │0,42 │29,40 │

│ │Сердце │79,37 │12,62 │0,17 │31,39 │

│ │Мозг │55,56 │11,82 │0,21 │29,40 │

│ │Жир │41,67 │0 │0 │0 │

│ │Ядра │86,67 │15,99 │0,18 │39,77 │

│ │Митохондрии │86,67 │24,04 │0,28 │59,79 │

│ │Микросомальная │66,67 │12,47 │0,19 │31,02 │

│ │фракция │ │ │ │ │

│ │Постмикросо- │70,00 │10,00 │0,14 │24,87 │

│ │мальная фракция│ │ │ │ │

│гамма- │Кровь │50,00 │0 │0 │0 │

│ГХЦГ │Почки │86,81 │6,01 │0,07 │14,95 │

│ │Печень │27,77 │11,82 │0,42 │29,40 │

│ │Сердце │62,50 │0 │0 │0 │

│ │Мозг │69,45 │12,02 │0,17 │29,90 │

│ │Жир │41,67 │0 │0 │0 │

│ │Ядра │86,67 │5,76 │0,07 │14,33 │

│ │Митохондрии │90,00 │0 │0 │0 │

│ │Микросомальная │70,00 │10,00 │0,14 │24,87 │

│ │фракция │ │ │ │ │

│ │Постмикросо- │80,00 │20,00 │0,25 │49,75 │

│ │мальная фракция│ │ │ │ │

│бета-ГХЦГ│Кровь │80,00 │0 │0 │0 │

│ │Почки │83,34 │0 │0 │0 │

│ │Печень │31,25 │10,01 │0,32 │24,90 │

│ │Сердце │79,87 │6,94 │0,09 │17,26 │

│ │Мозг │76,39 │12,02 │0,16 │29,90 │

│ │Жир │34,39 │12,04 │0,35 │29,95 │

│ │Ядра │96,67 │5,76 │0,06 │14,33 │

│ │Митохондрии │96,67 │5,57 │0,06 │13,85 │

│ │Микросомальная │70,00 │10,00 │0,14 │24,87 │

│ │фракция │ │ │ │ │

│ │Постмикросо- │80,00 │20,00 │0,25 │49,75 │

│ │мальная фракция│ │ │ │ │

│дельта- │Кровь │56,67 │5,77 │0,10 │17,61 │

│ГХЦГ │Почки │86,81 │6,01 │0,07 │14,95 │

│ │Печень │41,67 │0 │0 │0 │

│ │Сердце │55,56 │12,03 │0,22 │29,92 │

│ │Мозг │48,61 │12,02 │0,25 │29,90 │

│ │Жир │52,09 │10,41 │0,20 │25,89 │

│ │Ядра │100,00 │0 │0 │0 │

│ │Митохондрии │93,33 │13,03 │0,14 │32,41 │

│ │Микросомальная │66,67 │12,47 │0,19 │31,02 │

│ │фракция │ │ │ │ │

│ │Постмикросо- │80,00 │0 │0 │0 │

│ │мальная фракция│ │ │ │ │

│ПХФ │Кровь │36,67 │5,76 │0,16 │17,61 │

│ │Почки │26,48 │9,01 │0,35 │14,43 │

│ │Печень │21,08 │2,83 │0,07 │2,93 │

│ │Сердце │41,19 │5,35 │0,13 │5,61 │

│ │Мозг │51,28 │10,00 │0,20 │24,87 │

│ │Жир │49,52 │5,12 │0,10 │6,35 │

│ │Ядра │16,00 │7,07 │0,44 │17,56 │

│ │Митохондрии │80,00 │20,00 │0,25 │49,75 │

│ │Микросомальная │32,00 │8,00 │0,25 │19,90 │

│ │фракция │ │ │ │ │

│ │Постмикросо- │53,33 │24,04 │0,28 │59,79 │

│ │мальная фракция│ │ │ │ │

│2,3,4,6- │Кровь │41,67 │2,88 │0,07 │8,80 │

│ТеХФ │Почки │71,43 │0 │0 │0 │

│ │Печень │61,09 │9,08 │0,15 │22,58 │

│ │Сердце │79,89 │13,06 │0,16 │13,71 │

│ │Мозг │85,00 │18,71 │0,22 │23,19 │

│ │Жир │86,00 │21,91 │0,25 │27,15 │

│ │Ядра │36,67 │5,76 │0,16 │14,33 │

│ │Митохондрии │60,00 │20,00 │0,33 │49,75 │

│ │Микросомальная │17,33 │4,62 │0,27 │11,49 │

│ │фракция │ │ │ │ │

│ │Постмикросо- │80,00 │34,64 │0,43 │86,16 │

│ │мальная фракция│ │ │ │ │

│2,4,5-ТХФ│Кровь │40,00 │0 │0 │0 │

│ │Почки │78,17 │11,11 │0,14 │27,63 │

│ │Печень │32,78 │10,46 │0,32 │16,64 │

│ │Сердце │71,90 │7,45 │0,10 │9,23 │

│ │Мозг │62,22 │7,97 │0,13 │19,82 │

│ │Жир │56,07 │7,92 │0,14 │12,60 │

│ │Ядра │40,00 │0 │0 │0 │

│ │Митохондрии │86,67 │12,47 │0,14 │31,02 │

│ │Микросомальная │16,00 │4,00 │0,25 │9,95 │

│ │фракция │ │ │ │ │

│ │Постмикросо- │86,67 │12,47 │0,14 │31,02 │

│ │мальная фракция│ │ │ │ │

│2,4-ДХФ │Кровь │28,33 │2,82 │0,10 │8,61 │

│ │Почки │38,00 │7,42 │0,20 │9,20 │

│ │Печень │44,00 │11,18 │0,25 │13,85 │

│ │Сердце │36,00 │5,48 │0,15 │6,78 │

│ │Мозг │30,00 │0 │0 │0 │

│ │Жир │40,00 │10,00 │0,25 │12,39 │

│ │Ядра │33,33 │12,47 │0,37 │31,02 │

│ │Митохондрии │57,33 │24,72 │0,43 │61,48 │

│ │Микросомальная │17,33 │4,62 │0,27 │11,49 │

│ │фракция │ │ │ │ │

│ │Постмикросо- │66,67 │24,04 │0,36 │59,79 │

│ │мальная фракция│ │ │ │ │

│4-ХФ │Кровь │37,50 │5,00 │0,13 │7,96 │

│ │Почки │30,00 │5,77 │0,19 │9,18 │

│ │Печень │20,00 │10,00 │0,50 │24,87 │

│ │Сердце │37,50 │17,09 │0,46 │27,19 │

│ │Мозг │40,00 │8,19 │0,20 │13,03 │

│ │Жир │35,00 │5,77 │0,16 │9,18 │

│ │Субклеточные │44,00 │12,00 │0,27 │29,85 │

│ │фракции печени │ │ │ │ │

└─────────┴───────────────┴────────────┴───────────┴─────────────┴─────────────┘

Таблица 11

ПРЕДЕЛЫ ОБНАРУЖЕНИЯ ГАММА-ГХЦГ,

ЕГО ИЗОМЕРОВ И МЕТАБОЛИТОВ В БИОСУБСТРАТАХ

┌───────────┬───────────────────────┐┌────────────┬───────────────────────┐

│ Пестицид │ Анализируемый объект ││ Пестицид │ Анализируемый объект │

│ ├───────────────┬───────┤│ ├───────────────┬───────┤

│ │ кровь, │органы,││ │ кровь, │органы,│

│ │ субклеточные │ткани, ││ │ субклеточные │ткани, │

│ │фракции печени,│ мг/кг ││ │фракции печени,│ мг/кг │

│ │ мг/л │ ││ │ мг/л │ │

├───────────┼───────────────┼───────┤├────────────┼───────────────┼───────┤

│ГХБ │0,02 │0,1 ││2,3,4,6-ТеХФ│0,01 │0,05 │

│альфа-ГХЦГ │0,1 │0,5 ││2,4,6-ТХФ │0,01 │0,05 │

│гамма-ГХЦГ │0,1 │0,5 ││2,4,5-ТХФ │0,01 │0,05 │

│бета-ГХЦГ │0,1 │0,5 ││2,4-ДХФ │0,02 │0,1 │

│дельта-ГХЦГ│0,1 │0,5 ││4-ХФ │0,02 │0,1 │

│ПХФ │0,01 │0,05 ││ │ │ │

└───────────┴───────────────┴───────┘└────────────┴───────────────┴───────┘

Избирательность метода. Метод избирателен в присутствии ГХБ, ГХПК, ГПХ, 2,4'- и 4,4'-ДДТ, ДДД, ДДЭ и некоторых других ХОП.

Реактивы и растворы. Ацетон ч. н-Гексан ч. Спирт этиловый ректиф. 2-Феноксиэтанол ч. Аммиак водный 25-процентный ч. Пероксид водорода ч. Сульфат натрия безводный ч. (прокаленный). Хлорид натрия х.ч. Нитрат серебра х.ч.

Проявляющие реагенты. N 1: к раствору 0,5 г нитрата серебра в 5 мл дистиллированной воды добавляют 7 - 10 мл 25-процентного водного аммиака. Полученную смесь разбавляют ацетоном до 100 мл и перемешивают. Хранят в склянке темного стекла.

N 2: к раствору 0,1 г нитрата серебра в 1 мл дистиллированной воды добавляют 10 мл 2-феноксиэтанола, 190 мл ацетона, 1 - 2 капли пероксида водорода, тщательно перемешивают. Хранят в склянке темного стекла.

Стандартные растворы препаратов в н-гексане с концентрацией 100 и 10 мкг/мл хранят в холодильнике в посуде с пришлифованными пробками.

Приборы и посуда. Аппарат для встряхивания. Баня водяная.

Испаритель ротационный ИР-1М. Микроизмельчитель тканей РТ-2.

Облучатель ртутно-кварцевый настольный ОКН-11. Установка

компрессорная. Центрифуга лабораторная клиническая ОПН-3. Воронки

делительные и конические. Камеры хроматографические. Колбы:

конические, грушевидные на шлифе, мерные. Микропипетки

вместимостью 0,1 мл. Микрошприцы на 10 мкл МШ-10. Пипетки мерные.

Пробирки мерные на шлифе. Пульверизаторы стеклянные. Цилиндры

мерные. Пластинки хроматографические стандартные "Силуфол" или

"Кизельгель 60" F размером 20 x 20 см.

254

Отбор и хранение проб. Пробы отбирают в лабораторных условиях и сразу же помещают в испарительную камеру холодильника (хранят на льду не дольше 5 сут.).

Ход анализа. Экстракция. Существуют два способа экстракции препарата из проб крови.

1. Цельную кровь (1 - 5 мл) помещают в мерную пробирку на шлифе, приливают 3 - 5 мл н-гексана, перемешивают и далее экстрагируют на аппарате для встряхивания со средней интенсивностью в течение 5 - 7 мин.

После разделения слоев гексановый экстракт (верхний слой) отделяют с помощью пипетки, соединенной с резиновой грушей, и фильтруют через слой безводного сульфата натрия, помещенного в коническую воронку с подложкой из обезжиренной ваты. Экстракцию повторяют, экстракты объединяют.

Если образуется устойчивая эмульсия и фазы разделить трудно, в пробирку вносят несколько капель этанола или 0,1 - 0,2 г (на кончике скальпеля) хлорида натрия.

2. Пробу крови (1 - 5 мл) тщательно растирают с избыточным количеством безводного сульфата натрия (до сыпучего состояния). Помещают в плоскодонную колбу на шлифе и экстрагируют н-гексаном, взятым в 1,5-кратном по отношению к гомогенату объеме. Экстракт осторожно декантируют, дополнительно фильтруя через слой безводного сульфата натрия.

Пробу субклеточной фракции экстрагируют н-гексаном (см. способ 1 для крови). При образовании устойчивой эмульсии следует провести центрифугирование смеси при 3000 - 5000 об./мин. в течение 3 - 5 мин.

Гексановый экстракт отделяют и фильтруют через слой безводного сульфата натрия. Экстракцию повторяют, экстракты объединяют.

Навеску органов и тканей (печени, почек, сердца и др.) тщательно измельчают ножницами, затем помещают в тефлоновую пробирку, заливают н-гексаном (5 мл растворителя на 1 г пробы) и гомогенизируют на микроизмельчителе тканей при 3000 - 5000 об./мин. в течение 5 мин. Экстракт декантируют через слой безводного сульфата натрия в приемную колбу. Экстракцию повторяют, экстракты объединяют.

Концентрирование экстрактов проводят в вакууме на ротационном испарителе при температуре водяной бани 35 - 38 °C, затем в токе азота особой чистоты до объема 0,1 - 0,2 мл.

Хроматографирование в тонком слое сорбента. Аликвотную часть

(0,1 мл) экстракта с помощью микропипетки (микрошприца) наносят на

хроматографическую пластинку "Силуфол" или "Кизельгель 60" F .

254

Рядом с пробой наносят различные количества стандартных растворов

изомеров ГХЦГ, хлорированных фенолов (по 0,2; 1; 2; 5 мкг каждого

компонента).

Пластинку помещают в камеру для хроматографирования,

содержащую смесь н-гексана с ацетоном в соотношении 4:1

("Силуфол") или 6:1 ("Кизельгель 60" F ). Время насыщения камеры

254

30 мин.

После хроматографирования (длина пробега растворителя 15 - 17 см) пластинку проветривают в горизонтальном положении, а затем обрабатывают одним из проявляющих реагентов с помощью пульверизатора, подключенного к воздушному компрессору.

Зоны локализации гамма-, альфа-, бета- и дельта-ГХЦГ,

пентахлорфенола, 2,3,4,6-тетрахлорфенола, 2,4,6- и

2,4,5-трихлорфенола, 2,4-дихлорфенола, 4-хлорфенола обнаруживаются

на хроматограммах после облучения УФ-светом в виде бурых пятен

(величины R приведены в таблице 12).

Таблица 12

ВЕЛИЧИНЫ R ИЗОМЕРОВ ГЕКСАХЛОРЦИКЛОГЕКСАНА

И НЕКОТОРЫХ ХЛОРИРОВАННЫХ ФЕНОЛОВ НА ПЛАСТИНКАХ

"СИЛУФОЛ" И "КИЗЕЛЬГЕЛЬ 60" F

254

┌─────────────────────────┬─────────────────────┬─────────────────────────┐

│ Пестицид │"Кизельгель 60" F ,│"Силуфол", подвижная фаза│

│ │ 254 │ гексан - ацетон (4:1) │

│ │ подвижная фаза │ │

│ │гексан - ацетон (6:1)│ │

├─────────────────────────┼─────────────────────┼─────────────────────────┤

│ГХБ │0,96 │- │

│альфа-ГХЦГ │0,87 │0,98 │

│гамма-ГХЦГ │0,79 │0,81 │

│бета-ГХЦГ │0,73 │0,77 │

│дельта-ГХЦГ │0,64 │0,74 │

│2,3,4,5,6-Пентахлорфенол │0,18 │0,69 │

│2,3,4,6-Тетрахлорфенол │0,39 │0,71 │

│2,4,6-Трихлорфенол │0,57 │0,73 │

│2,4,5-Трихлорфенол │0,43 │0,68 │

│2,4-Дихлорфенол │0,42 │0,65 │

│4-Хлорфенол │0,34 │0,60 │

└─────────────────────────┴─────────────────────┴─────────────────────────┘

Количественную оценку содержания изомеров ГХЦГ и полихлорированных фенолов в пробе проводят визуально или денситометрически на приборе типа "Оптон".

Оставшуюся часть экстракта при необходимости также подвергают хроматографированию после экспресс-очистки концентрированной серной кислотой.

К экстракту, количественно перенесенному в центрифужную пробирку, прибавляют 2 - 3 капли концентрированной серной кислоты, после чего содержимое встряхивают. После разделения фаз (через 5 - 7 мин.) экстракт наносят с помощью микропипетки на хроматографическую пластинку и далее поступают так же, как описано выше. В этом случае обнаруживаются все перечисленные компоненты, кроме 4-хлорфенола.

Обработка результатов анализа. Содержание гамма-ГХЦГ, его изомеров и метаболитов в анализируемом объекте (X, мг/кг, мг/л) рассчитывают по формуле:

X = K ---,

V P

где:

K - поправочный коэффициент, приведенный в таблице 13;

A - содержание препарата, обнаруженное в аликвоте экстракта,

взятой для хроматографирования, мкг;

V - объем аликвоты экстракта, нанесенной на

хроматографическую пластину, мл;

V - конечный объем экстракта, мл;

P - масса (объем) пробы, г (мл).

Таблица 13

ПОПРАВОЧНЫЙ КОЭФФИЦИЕНТ К РАСЧЕТАМ СОДЕРЖАНИЯ ГАММА-ГХЦГ,

ЕГО ИЗОМЕРОВ И МЕТАБОЛИТОВ В БИОСУБСТРАТАХ

┌────────────────┬───┬──────┬──────┬─────┬───────┬───┬────────┬──────┬──────┬────┬────┐

│ Объект │ГХБ│альфа-│гамма-│бета-│дельта-│ПХФ│2,3,4,6-│2,4,6-│2,4,5-│2,4-│4-ХФ│

│ исследования │ │ ГХЦГ │ ГХЦГ │ГХЦГ │ ГХЦГ │ │ ТеХФ │ ТХФ │ ТХФ │ДХФ │<*> │

├────────────────┼───┼──────┼──────┼─────┼───────┼───┼────────┼──────┼──────┼────┼────┤

│Кровь │2,3│2,0 │2,0 │1,7 │1,8 │2,7│2,4 │2,7 │2,5 │3,5 │2,7 │

│Почки │1,7│1,7 │1,2 │1,2 │1,2 │3,9│1,4 │1,4 │1,3 │2,6 │3,3 │

│Печень │1,9│3,6 │3,6 │3,2 │2,4 │4,7│1,6 │1,2 │3,0 │2,3 │5,0 │

│Сердце │1,6│1,3 │1,6 │1,3 │1,8 │2,4│1,1 │1,2 │1,4 │2,8 │2,7 │

│Мозг │1,1│1,8 │1,4 │1,3 │2,0 │1,9│1,2 │1,2 │1,6 │3,3 │2,5 │

│Жир │1,9│2,4 │2,4 │2,9 │1,9 │2,0│1,8 │1,2 │1,8 │2,5 │2,8 │

│Ядра │1,1│1,2 │1,2 │1,0 │1,0 │6,0│2,7 │2,7 │2,5 │3,0 │2,3 │

│Митохондрии │1,2│1,2 │1,1 │1,0 │1,1 │1,3│1,7 │1,7 │1,2 │1,7 │2,3 │

│Микросомальная │- │1,5 │1,4 │1,4 │1,5 │3,1│2,9 │2,7 │6,0 │5,7 │2,3 │

│фракция │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │

│Постмикросомаль-│1,2│1,4 │1,3 │1,3 │1,3 │1,9│1,7 │1,2 │1,2 │1,5 │2,3 │

│ная фракция │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │

└────────────────┴───┴──────┴──────┴─────┴───────┴───┴────────┴──────┴──────┴────┴────┘

--------------------------------

<*> Без применения очистки экстракта серной кислотой.

Требования безопасности. Необходимо соблюдать общепринятые правила безопасности при работе с органическими растворителями и токсичными веществами. Не допускать попадания полихлорированных фенолов на кожу!