Утверждаю

Заместитель Главного

государственного

санитарного врача СССР

А.И.ЗАИЧЕНКО

27 ноября 1984 г. N 3158-84

ВРЕМЕННЫЕ МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

ПО ИЗМЕРЕНИЮ КОНЦЕНТРАЦИЙ ПОКОЯЩИХСЯ СПОР

ЭНТОМОФТОРОВЫХ ГРИБОВ (МИКОАФИДИНА, ЭНТОМОФТОРИНА)

МЕТОДОМ СВЕТОВОЙ МИКРОСКОПИИ В ВОЗДУХЕ РАБОЧЕЙ ЗОНЫ

    Энтомофторовые    грибы,   в   частности   Entomophthora   thaxteriana,

используются   для   производства  средств  защиты  растений  (микоафидина,

энтомофторина  и  др.).  В  состав  микоафидина  входят   покоящиеся  споры

                                      7

указанного вида гриба (не менее 4 x 10  в 1 г), фрагменты мицелия и остатки

питательной  среды.  Препарат  представляет  собой мелкодисперсный аморфный

порошок  желтого или бежевого цвета, имеющий слабый специфический (грибной)

запах.  Гигроскопичен. В воде образует нестойкую суспензию. У энтомофторина

состав и свойства подобны описанным.

    Токсичность  микоафидина и энтомофторина низкая: ЛД   для белых мышей и

                                                       50

крыс  при  введении  в  желудок  превышает 10 г/кг. ПДК (ориентировочная) в

                             3

воздухе рабочей зоны - 5 x 10  спор/куб. м.

Микоафидин и энтомофторин используются в качестве конкретных инсектицидов против тлей. Препараты применяются методом опрыскивания вегетирующих растений.

1. Методика определения покоящихся спор

энтомофторовых грибов в воздухе методом световой

микроскопии

1.1. Основные положения

1. Метод основан на осаждении аэрозоля на аналитические фильтры типа АФА из перхлорвинила, просветлении фильтров в парах ацетона, подсчете покоящихся спор энтомофторовых грибов на фильтрах методом микроскопии в проходящем свете, расчете содержания спор в воздухе.

                                                                    2

    2.  Диапазон  определяемых  количеств  спор на фильтре - 12 x 10  - 6 x

  5

10 .

                                                  2

    3. Предел обнаружения спор на фильтре - 5 x 10 .

4. Среднее значение определения стандартных количеств спор - 82%.

5. Стандартное отклонение отдельного определения - 26,1%.

6. Относительное стандартное отклонение - 0,2.

7. Доверительный интервал среднего при P = 0,05 и n = 5 - +/- 29,4%.

8. Метод избирателен в присутствии посторонней микрофлоры, минеральных и органических частиц. Мешает определению избыток пыли на фильтре - если ее количество превышает 3 - 5 мг.

1.2. Реактивы и материалы

Ацетон хч, ГОСТ 2603-79.

Этанол 96-процентный, ТУ 6-09-1710-77.

Эфир диэтиловый (для наркоза), Фармакопея СССР.

Вода дистиллированная, ГОСТ 6702-72.

Мешки полиэтиленовые хозяйственные, ОСТ 6-19-37-033-82.

Формалин, Фармакопея СССР.

Фильтры АФА-ВП-20 или АФА-ХП-20.

Вата обезжиренная медицинская, ГОСТ 5566-75.

1.3. Приборы, аппаратура и посуда

Аспирационное устройство, ТУ 64-1-862-77.

Аллонжи ИРА-2000, ТУ 690-00-00.

Трубки соединительные резиновые.

Микроскоп МБИ-3 и т.п.

Стекла предметные.

Стекла покровные, 24 x 24 мм, ГОСТ 6672-75.

                                         x

    Микрометр окулярный винтовой МОВ-1-15 , ГОСТ 7865-56.

Объект-микрометр ОМП, ГОСТ 7513-75.

Кювета металлическая (150 x 100 x 30 мм) со стеклянной крышкой.

Баня водяная, ТУ 64-1-2850-76.

Колбы конические на 100 мл, ГОСТ 10394-72.

1.4. Подготовка к определению

Отбор, транспортировку, хранение и анализ проб проводят при соблюдении правил асептики. Аналитические аэрозольные фильтры и аллонжи стерилизуют в парах формальдегида (в полиэтиленовых мешках, завернутыми в бумагу) в течение 24 часов при комнатной температуре. Площадь поля зрения микроскопа определяют при помощи микрометра окулярного и объект-микрометра. Предметные и покровные стекла обрабатывают смесью этанола с эфиром (1:1).

1.5. Отбор проб

Улавливание спор энтомофторовых грибов осуществляют на аналитические аэрозольные фильтры из перхлорвинила путем фильтрации через них исследуемого воздуха. Через фильтр пропускают 50 - 600 л воздуха со скоростью 5 - 20 л/мин. Пробы можно хранить продолжительное время при температуре 2 - 5 °C.

1.6. Проведение определения

Фильтр с пробой помещают на предметное стекло (аэрозольными частицами вверх), свисающие части фильтра отрезают ножницами. Предметное стекло с фильтром помещают в металлическую кювету над слоем кипящего ацетона (подогревают на водяной бане, работу проводят в вытяжном шкафу) и накрывают стеклянной крышкой. Под воздействием паров ацетона происходит просветление фильтра в течение 5 - 15 с. Предметное стекло извлекают из кюветы, ацетон в течение 10 - 20 с испаряется.

Подсчет спор на фильтре проводят путем микроскопии в проходящем свете при увеличении 20 x 7 или 20 x 10 в препарате "раздавленная капля". Для этого на просветленный фильтр наносят на два участка на расстоянии 30 - 35 мм по одной капле дистиллированной воды и накрывают покровными стеклами. Подсчитывают количество покоящихся спор в 50 полях зрения микроскопа (по 5 x 5 на обоих участках фильтра). Для равномерного обзора всего участка фильтра споры подсчитывают в полях зрения, расположенных не подряд, а с интервалами в 2 - 3 поля. Покоящиеся споры энтомофторовых грибов имеют округлую форму и четко различимую двойную оболочку. В центре споры располагается крупная "жировая капля". Спора имеет размеры от 27 до 50 мкм (в среднем 33 мкм), а "жировая капля" - 12 - 20 мкм.

1.7. Обработка результатов

Концентрацию покоящихся спор энтомофторовых грибов в воздухе (X, спор/куб. м) вычисляют по формуле:

                                 S x N x 1000

                            X = -------------,

                                S  x N  x V

                                 1    1    20

    где:

    S  -  площадь  аналитического  аэрозольного  фильтра  (той части, через

которую проходит воздух при закреплении фильтра в аллонже), кв. мм;

    S  - площадь поля зрения микроскопа, кв. мм;

     1

    N - количество подсчитанных спор энтомофторовых грибов, ед.;

    N  - количество просмотренных полей зрения микроскопа, ед.;

     1

    V   - объем воздуха, отобранный для анализа и приведенный к стандартным

     20

условиям, л;

    1000 - коэффициент пересчета литров в метры кубические.

2. Требования безопасности

Соблюдаются общие правила по технике безопасности при работе с легковоспламеняющимися жидкостями и электроприборами. Выполняются меры предосторожности, обычно рекомендуемые для работы с микроорганизмами IV группы (условно патогенные), сущность которых сводится к предупреждению загрязнения проб и соблюдению правил личной гигиены.