"Временные Методические указания по определению ровраля методом хроматографии в тонком слое в биосубстратах" // Технорма.RU

Утверждаю

Заместитель Главного

государственного

санитарного врача СССР

А.И.ЗАИЧЕНКО

31 июля 1984 г. N 3076-84

ВРЕМЕННЫЕ МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

ПО ОПРЕДЕЛЕНИЮ РОВРАЛЯ МЕТОДОМ ХРОМАТОГРАФИИ

В ТОНКОМ СЛОЕ В БИОСУБСТРАТАХ

(Дополнение к Методическим указаниям N 2422-81)

1. Краткая характеристика препарата

Ровраль - 1-изопропилкарбамоил-3-/3,5-дихлорфенил/-3-гидантоин.

N-CONHCH(CH )

/\ 3 2

/ \=O

│ . │

│ │ ___Cl

O=└────┘N __// \\

\ ___ /

--- \ C H O N Cl .

Cl 13 13 3 3 2

Молекулярная масса: 330,17.

Синонимы и торговые названия: ипродион, афнор, ВСИ, 26019 РН, РОП 500ф,

НРС 910, ЛФА 2071, гликофен.

Химически чистый препарат представляет собой белое кристаллическое

вещество без запаха с точкой плавления 136 °C, растворимое в этаноле,

ацетонитриле, толуоле, бензоле, ацетоне, дихлорметане и практически

-7

нерастворимое в воде. Упругость паров незначительна: при 20 °C - 2 x 10

мм рт. ст.

ЛД внутрижелудочно для белых крыс - 3500 мг/кг, для мышей - 4000

мг/кг. Раздражающее действие отсутствует.

Ровраль - фунгицид, применяемый в борьбе с серой гнилью на винограде и овощных культурах.

2. Методика определения ровраля

в биосубстратах хроматографическим методом

2.1. Основные положения

2.1.1. Принцип метода

Метод основан на извлечении действующего вещества препарата из анализируемых проб органическим растворителем - ацетонитрилом или метиленом хлористым, солянокислотной очистке упаренных экстрактов, экстракции из солянокислых растворов метиленом хлористым и последующем определении методом тонкослойной хроматографии.

2.1.2. Метрологическая характеристика метода

Метрологическая характеристика метода приведена в таблице 1 (см. Приложение).

2.1.3. Избирательность метода

Определению ровраля не мешают препараты дерозал, бенлат, зупарен, применяемые, как и ровраль, при борьбе с серой гнилью.

2.2. Реактивы и материалы

Ацетонитрил ч, ТУ 6-09-3534-74.

н-Гексан хч, ТУ 6-09-3375-78.

Толуол чда, ГОСТ 5789-78.

Натрий сернокислый безводный чда, ГОСТ 4166-76.

Метилен хлористый хч, ТУ 6-09-2662-77.

Ацетон ОП-2 осч, 9 - 5, ТУ 6-09-3513-75.

Гептан хч, ТУ 6-09-4520-77.

Этиловый эфир (медицин.) фарм.

Натрия гидроокись хч, ГОСТ 4328-77, 1 н водный раствор.

Кали едкое осч, 18 - 3 ОСТ 6-01-301-74, 15-процентный водный раствор.

Этиловый спирт хч, ТУ 6-09-1710-77.

Хлороформ хч, ГОСТ 215-74.

Соляная кислота хч, ГОСТ 3118-77, 0,1, 1 и 5 н водные растворы.

Натрий азотистокислый хч, ГОСТ 4197-74.

Аммоний хлористый осч, 2 - 4 ТУ 6-09-587-75.

Силикагель КСК, ТУ 6-09-2525-72 (0,10 - 0,14 мм).

Кальций сернокислый безводный чда, ТУ 6-09-706-76.

Фильтры бумажные "синяя лента", ТУ 6-09-1678-77.

N-(1-Нафтил)этилендиамин дигидрохлорид ч, ТУ 6-09-15-420-80.

Аммоний сульфаминовокислый ч, ТУ 6-09-15-364-78, 5-процентный раствор в 0,1 н соляной кислоте.

1-Нафтол чда, ГОСТ 5838-79, 1-процентный раствор в этиловом спирте.

Дифениламин чда, ГОСТ 5825-70.

Цинк хлористый чда, ГОСТ 4529-69.

Пластинки хроматографические "Силуфол" UV-254 (ЧССР).

Диазореактив: к 10 г азотистокислого натрия приливают 20 мл конц. соляной кислоты и доводят объем жидкости до 50 мл дистиллированной водой. Раствор используется свежеприготовленным.

Проявляющий реактив N 1: <...> г едкого калия растворяют в 50 мл дистиллированной воды и добавляют 0,1 г 1-нафтола. Раствор устойчив в течение 7 дней при хранении в холодильнике.

Проявляющий реактив N 2: 0,5 г дифениламина растворяют в 100 мл ацетона и добавляют 0,5 г цинка хлористого. Раствор используется свежеприготовленным.

Стандартный раствор ровраля с содержанием 100 мкг действующего вещества в 1 мл хлороформа, ацетона или этилового спирта готовят из хч или технического препарата с учетом % содержания действующего вещества. Раствор устойчив в течение 10 - 15 дней.

2.3. Приборы, аппаратура и посуда

Испаритель ротационный, ТУ 25-11-917-74, тип ИР-1M.

Камера для хроматографирования, ГОСТ 10565-74.

Камера для опрыскивания хроматографических пластинок, ГОСТ 11413-74.

Воронки делительные, ГОСТ 861-75, на 100 мл.

Воронки химические, ГОСТ 8613-75.

Колбы конические, ГОСТ 10394-72, на 100 мл.

Колбы мерные, ГОСТ 1770-74, на 100 и 1000 мл.

Пипетки, ГОСТ 20292-74, на 1, 2, 5 мл.

Микропипетки, ГОСТ 20292-74.

Пульверизаторы стеклянные, ГОСТ 19391-65.

Шкаф сушильный, ТУ 64-1-1081-73.

Вентилятор или фен.

Колбы круглодонные со шлифом 29, ГОСТ 10394-72, на 100 мл.

Чашки Петри, ГОСТ 10973-75.

Чашки выпарительные N 3, 4, ГОСТ 9147-73.

Баня водяная, ТУ 46-22-608-75.

Водоструйный насос, ГОСТ 10696-75.

Стекловата.

2.4. Описание определения

2.4.1. Экстракция и очистка

Кровь, легкие, печень, почки, мозг. 5 г навески органов (5 мл крови) измельчают и помещают в коническую колбу на 100 мл, перемешивают с 3 г безводного сульфата натрия и заливают 30 мл ацетонитрила, помешивают 2 - 3 минуты и оставляют на 10 - 15 минут, затем фильтруют через бумажный фильтр "синяя лента" в фарфоровую чашу. Экстракцию оставшегося в колбе биосубстрата повторяют еще дважды ацетонитрилом по 30 мл. Объединенный экстракт упаривают в фарфоровой чаше на бане досуха. К сухому остатку добавляют 2 - 3 мл 5 н соляной кислоты, тщательно ополаскивая остаток со стенок чаши, и сливают через слой стекловаты в делительную воронку на 100 мл. Чашу еще трижды ополаскивают по 2 мл 5 н соляной кислоты и сливают в ту же воронку. Из раствора соляной кислоты ровраль экстрагируют метиленом хлористым трижды по 15 мл. Органический слой отделяют, проводя его через воронку с безводным сульфатом натрия (слой 2 см) в круглодонную колбу на 100 мл для упаривания на испарителе. Растворитель выпаривают досуха, остаток растворяют в минимальном количестве ацетона и наносят количественно на хроматографическую пластинку.

Моча. 5 мл мочи помещают в делительную воронку на 100 мл и экстрагируют встряхиванием в течение 2 - 3 минут 15 мл метилена хлористого, отделяют метилен хлористый, проводя через слой (2 см) безводного сульфата натрия в 100 мл круглодонную колбу для выпаривания. Экстракцию проводят еще 2 раза метиленом хлористым по 15 мл. Экстракт упаривают досуха на роторном испарителе, остаток растворяют в минимальном количестве ацетона и наносят количественно на хроматографическую пластинку.

Кал. 5 г кала помещают в коническую колбу на 100 мл, заливают 50 мл ацетонитрила, помешивают содержимое колбы 2 - 3 минуты и оставляют на 10 - 15 минут. Фильтруют экстракт в фарфоровую чашу через бумажный фильтр. Экстракцию повторяют еще дважды по 30 мл ацетонитрила.

Объединенные экстракты упаривают до 15 - 20 мл, помещают в делительную воронку, ополоснув ацетонитрилом (5 мл x 2) чашу. Ацетонитрильный слой промывают дважды 30 мл гексана, гексановые вытяжки собирают в отдельную делительную воронку и промывают 10 мл ацетонитрила. Объединяют ацетонитрильные слои в фарфоровой чаше и упаривают досуха на водяной бане. Далее поступают аналогично анализу крови, легких и т.д.

2.4.2. Хроматографирование

Хроматографирование проводят нисходящим способом. Хроматографические пластинки "Силуфол" сгибают от верхнего края на 2 см. Пробы и стандартные растворы наносят на пластинку на расстоянии 2 см от линии сгиба. Гнутый конец пластинки помещают в лодочку, в которую налит подвижный растворитель: смесь гептана и этилового эфира (1:4) или смесь толуола и этанола (93:7). Лодочка помещена в камеру для хроматографирования. После окончания хроматографирования пластинку вынимают из камеры и оставляют на несколько минут на воздухе (под вытяжкой) для удаления следов растворителей. Условия проявления хроматограммы следующие (в зависимости от проявляющего реагента):

А. 1. Опрыскивание смесью 1 н раствора гидроокиси натрия и этилового спирта (50 x 50)(около 10 мл на пластинку).

2. Выдерживание пластинок в сушильном шкафу при 120 °C в течение 10 минут.

3. Опрыскивание 5 н соляной кислотой (8 мл на пластинку).

4. Опрыскивание последовательно растворами:

а) 2 г натрия азотистокислого в 100 мл 0,1 н раствора соляной кислоты (4 мл на пластинку);

б) 5 г аммония хлористого или аммония сульфаминовокислого в 100 мл 0,1 н раствора соляной кислоты (8 мл на пластинку).

5. Высушивание пластинок в токе воздуха.

6. Опрыскивание раствором N-(1-нафтил)этилендиамин дигидрохлорида (5 г на 100 мл 1 н раствора соляной кислоты) или 1-процентным раствором 1-нафтола в этаноле (около 10 мл на пластинку).

Следует обратить внимание на то, что расход всех реактивов для обработки хроматограмм должен быть минимальным, а струя раствора - рассеянной.

Б. Опрыскивание пластинок 15-процентным спиртовым раствором едкого калия и термическая обработка при 150 °C в течение 20 минут. Затем пластинки последовательно обрабатывают диазореактивом и проявляющим реактивом N 1 или N 2.

При наличии ровраля в пробе на хроматограммах проявляются

розово-фиолетовые пятна в случае N-(1-нафтил)этилендиамин дигидрохлорида,

оранжевые пятна в случае применения 1-нафтола или малиновые в случае

применения дифениламина. R пятен 0,35 (гептан - диэтиловый эфир (1:4)) и

0,50 - 0,55 (толуол - этанол (93:7)).

2.5. Обработка результатов анализа

Количественная оценка хроматограмм проводится путем сравнения площадей и интенсивности окраски пятен проб и стандартных растворов.

Содержание препарата в исследуемой пробе вычисляют по формулам:

в крови и моче -

X = -,

где:

X - концентрация исследуемого препарата, мкг/мл;

A - количество вещества, обнаруженное на хроматограмме, мкг;

V - объем взятой для анализа крови или мочи, мл;

в печени, почках, мозге, легких, кале -

X = -,

где:

X - концентрация исследуемого препарата, мкг/мл;

A - количество вещества, обнаруженное на хроматограмме, мкг;

P - навеска биосубстрата, г.

3. Требования безопасности

При проведении исследований по вышеприведенной Методике необходимо соблюдать правила предосторожности, требуемые при работе с ядовитыми, взрыво- и легковоспламеняющимися веществами.

Приложение

Таблица 1

МЕТРОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА МЕТОДА

┌─────────┬───────────────────────────────────────────────────────────────┐

│Метроло- │ Анализируемый объект │

│гические ├────────┬────────┬────────┬────────┬────────┬────────┬─────────┤

│параметры│ печень │ почки │ легкие │ мозг │ кровь │ кал │ моча │

├─────────┼────────┼────────┼────────┼────────┼────────┼────────┼─────────┤

│Диапазон │0,1 - 10│0,1 - 10│0,1 - 10│0,1 - 10│0,1 - 10│0,2 - 10│0,04 - 10│

│определя-│мкг/г │мкг/г │мкг/г │мкг/г │мкг/г │мкг/г │мкг/г │

│емых │ │ │ │ │ │ │ │

│концент- │ │ │ │ │ │ │ │

│раций │ │ │ │ │ │ │ │

│ │ │ │ │ │ │ │ │

│Предел │0,5 │0,5 │0,5 │0,5 │0,5 │1,0 │0,2 │

│обнаруже-│ │ │ │ │ │ │ │

│ния, мкг │ │ │ │ │ │ │ │

│ │ │ │ │ │ │ │ │

│Предел │0,1 │0,1 │0,1 │0,1 │0,1 │0,2 │0,04 │

│обнаруже-│мкг/г │мкг/г │мкг/г │мкг/г │мкг/мл │мкг/г │мкг/мл │

│ния, мкг/│ │ │ │ │ │ │ │

│г, мкг/мл│ │ │ │ │ │ │ │

│ │ │ │ │ │ │ │ │

│Среднее │86,0 │88,0 │89,0 │85,4 │94,0 │85,4 │98,2 │

│значение │ │ │ │ │ │ │ │

│определе-│ │ │ │ │ │ │ │

│ния стан-│ │ │ │ │ │ │ │

│дарных │ │ │ │ │ │ │ │

│количеств│ │ │ │ │ │ │ │

│_ │ │ │ │ │ │ │ │

│C, % │ │ │ │ │ │ │ │

│ │ │ │ │ │ │ │ │

│Стандарт-│1,58 │3,87 │1,58 │3,64 │3,08 │3,65 │0,84 │

│ное от- │ │ │ │ │ │ │ │

│клонение │ │ │ │ │ │ │ │

│_ │ │ │ │ │ │ │ │

│S │ │ │ │ │ │ │ │

│ │ │ │ │ │ │ │ │

│Дов. │+/- 1,96│+/- 4,80│+/- 1,96│+/- 4,51│+/- 3,82│+/- 4,54│+/- 1,04 │

│интервал │ │ │ │ │ │ │ │

│среднего │ │ │ │ │ │ │ │

│значения │ │ │ │ │ │ │ │

│при │ │ │ │ │ │ │ │

│p = 0,95 │ │ │ │ │ │ │ │

│и n = 5, │ │ │ │ │ │ │ │

│% │ │ │ │ │ │ │ │

│ │ │ │ │ │ │ │ │

│Относи- │1,0 │4,0 │1,0 │4,0 │3,0 │4,2 │0,08 │

│тельное │ │ │ │ │ │ │ │

│стандарт-│ │ │ │ │ │ │ │

│ное │ │ │ │ │ │ │ │

│отклоне- │ │ │ │ │ │ │ │

│ние S , %│ │ │ │ │ │ │ │

│ 2 │ │ │ │ │ │ │ │

│ │ │ │ │ │ │ │ │

│Погреш- │+/- 2,27│+/- 5,45│+/- 2,20│+/- 5,28│+/- 4,06│+/- 5,3 │+/- 1,059│

│ность │ │ │ │ │ │ │ │

│определе-│ │ │ │ │ │ │ │

│ния │ │ │ │ │ │ │ │

│дельта, %│ │ │ │ │ │ │ │

└─────────┴────────┴────────┴────────┴────────┴────────┴────────┴─────────┘