Утверждены

Минздравом СССР

27 апреля 1984 г. N 3024-84

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

ПО УНИФИЦИРОВАННОМУ МЕТОДУ ИММУНОФЛЮОРЕСЦЕНТНОГО ВЫЯВЛЕНИЯ

БАКУЛОВИРУСОВ В ВОЗДУХЕ РАБОЧЕЙ ЗОНЫ

Настоящие Методические указания распространяются на определение содержания в воздухе рабочей зоны полиэдров и гранул бакуловирусов, являющихся действующим началом вирусных инсектицидных препаратов, что необходимо при разработке санитарно-гигиенических регламентов, санитарно-гигиеническом контроле, а также в научных исследованиях.

Краткая характеристика бакуловирусных инсектицидов. Известные в настоящее время отечественные вирусные препараты, разрабатываемые или применяемые в качестве инсектицидов против гусениц вредных насекомых, содержат в качестве действующего начала вирусы насекомых семейства бакуловирусов. Вирусы в препаратах представлены в виде телец-включений типа полиэдров или гранул, размеры от 0,3 - 1,5 мк (полиэдры) и до 0,25 - 0,8 мк (гранулы), в которых содержатся различные количества вирионов. Бакуловирусы обладают выраженной специфичностью в отношении насекомого-вредителя.

Вирусные тельца-включения получают из тканей и больных или погибших от вирусной инфекции гусениц соответствующего вида насекомых.

    Вирусные  препараты  представляют  собой  концентрат-суспензию

полиэдров или гранул в 50-процентном глицерине (жидкие  формы) или

порошок   светло-серого   цвета,   состоящий   из  соответствующих

компонентов  действующего  начала  и наполнителя (каолин, силикон,

тальк  и  т.д.).  Препараты  содержат  полиэдры  в  концентрации в

                 9                    10

среднем  1  x  10   пдр/мл, или 1 x 10   грн/мл. Применяются путем

опрыскивания (авиа-, тракторного, ранцевого) при норме расхода 100

-  200  мл  препарата на 1 га с добавлением поверхностно-активного

вещества ОП-7 из расчета 0,6 - 4,0 г на 10 л воды.

По данным КНИИЭИБ, изученные отечественные вирусные энтомопатогенные препараты вирин-ЭНШ, вирин-ЭКС, вирин-АББ, вирин-КШ, вирин-диприон не токсичны и не патогенны для человека и теплокровных животных. Изученные энтомопатогенные вирусы не репродуцируются в теплокровном организме, не вызывают явной или скрытой инфекции, безопасны в эпидемиологическом отношении. В условиях производства оказывают сенсибилизирующее действие на организм, что может приводить к развитию иммунопатологических состояний у работающих.

Принцип метода. Метод основан на специфическом взаимодействии антигенов (бакуловирусов) с антителами против полиэдров конкретного вируса. Образовывающийся комплекс, соединенный с флюоресцирующим красителем, выявляется в виде локализованного специфического свечения в лучах сине- и УФ-света на люминесцентных микроскопах.

Методика определения бакуловирусов в воздухе основана на использовании иммунофлюоресценции, широко применяемой в медицинской вирусологии для индикации различных вирусов (метод Кунса, 1941). Применяют непрямой вариант метода.

    Метрологическая характеристика метода.  Данным  методом  можно

определить  концентрацию  телец-включений  в  1  куб. м воздуха от

        2

0,5 x 10  и более.

Избирательность метода. При использовании качественной гипериммунной антисыворотки против полиэдров или гранул определяемого вируса и устранении неспецифического свечения в исследуемых препаратах-отпечатках метод расценивается как высокоспецифический и чувствительный.

    Реактивы   и   материалы.  Ацетон.  Хлористый   натрий   х.ч.,

0,85-процентный   раствор,   pH   7,4  -  7,6.   Нефлюоресцирующее

иммерсионное    масло    или    диметилфталат.    Синька    Эванса

(C  H  N Na O   ).  Меченная   ФИТЦ  сыворотка  против  глобулинов

  34 24 6  4 144

кролика.   Специфическая   антибакуловирусная   сыворотка   против

определяемого вируса.

Приборы и посуда. Люминесцентный микроскоп МЛ-2 или МЛ-3. Окуляр с сеткой. Объект-микрометр. Электроаспиратор ПАБ-1 или ПОВ-1. Аналитические аэрозольные фильтры марки АФА-ВП-10. Чашки Петри. Предметные стекла. Пипетки Пастера.

Подготовка к определению. До проведения исследования необходимо подготовить люминесцентный микроскоп. При работе на микроскопах МЛ-2, МЛ-3 используют фильтры ФС-1-2, СС-15-2, БСК-8-2. Запирающий фильтр Т-2Н, объектив 90x, окуляры 8x или 10x, сила тока при микроскопии 4 - 4,5 А.

    Для    микроскопии    следует    применять   нефлюоресцирующее

иммерсионное масло   или   диметилфталат  х.ч.  Чтобы   подсчитать

количество   телец-включений   в   исследуемой  пробе,  необходимо

определить с помощью объект-микрометра сторону квадрата  окулярной

сетки, а затем  ее  площадь.  При  отсутствии  окулярной  сетки  с

помощью объект-микрометра  определяют  диаметр поля зрения и затем

                                           2

площадь поля  зрения  по  формуле  S = пи r .  Найденную  величину

(площадь окулярной сетки или площадь  поля  зрения)  подставляют в

формулу для определения количества  телец-включений  в исследуемой

пробе (см. ниже).

Отбор проб воздуха. Для отбора проб воздуха применяют приборы ПАБ-1 или ПОВ-1, производительность которых до 150 - 250 л/мин. и 20 - 25 л/мин. соответственно. Эти приборы работают по принципу электростатического или инерционного осаждения частиц аэрозоля из потока исследуемого воздуха на поверхность анализируемых фильтров. Применяют фильтры АФА-ВП-10. Для отсоса воздуха фильтры монтируют на фильтровальной воронке или на патроне для отбора проб пыли и подключают к аспиратору. Рабочая площадь фильтра АФА-ВП-10 равна 10 кв. см. Фильтры изготовлены из перхлорвиниловой ткани ФПП, обладают малым аэродинамическим сопротивлением, что позволяет протягивать воздух с большой скоростью (до 100 л/мин.).

В исследуемых помещениях пробы отбирают в разных местах (5 точек конвертообразно) на уровне 150 - 200 см от пола в зоне дыхания людей. На каждую пробу пропускают не менее 100 л воздуха (5 мин. при скорости 20 л/мин.).

После аспирации воздуха аналитические фильтры снимают, кладут лицевой стороной (с отпечатком аэрозоля) вверх на предметные стекла, которые помещают в чашки Петри на две стеклянные палочки. На дно чашек наливают ацетон и закрывают их. В парах ацетона фильтры обесцвечиваются. Когда фильтр станет прозрачным, предметные стекла с зафиксированными на них отпечатками аэрозоля можно хранить при 4 °C до проведения исследования (не более 30 сут.).

Ход анализа. Исследованию подвергают зафиксированные на предметных стеклах отпечатки аэрозоля, полученные на обесцвеченных аналитических фильтрах. На стекла с отпечатками наносят водный раствор (1:10000) синьки Эванса на 15 мин., затем стекла промывают в проточной воде и подсушивают на воздухе (для ускорения подсушивания можно применять комнатный вентилятор). На высушенный препарат наносят специфическую антиполиэдренную антивирусную иммунную сыворотку в рабочем разведении, выдерживают 20 мин. во влажной камере при 37 °C. Сыворотку смывают в проточной воде, препарат подсушивают и наносят антивидовую меченную ФИТЦ сыворотку на 20 мин. при 37 °C, затем промывают в проточной воде. Подсушенный препарат готов к просмотру в люминесцентном микроскопе. При наличии в отпечатках телец-включений бакуловирусов они будут выявляться в микроскопе по яркому специфическому желто-зеленому свечению. Более интенсивно светятся тельца-включения по их периферии в виде яркого ободка полиэдров или гранул на общем красноватом фоне препарата.

В случае получения отпечатков на нескольких фильтрах можно проводить окраску каждого или группы отпечатков разными специфическими иммунными сыворотками и таким образом осуществлять экспресс-идентификацию выявляемого бакуловируса. Этим способом также выявляется степень серологического родства видов бакуловирусов.

Обработка результатов анализа. Кроме визуального определения телец-включений бакуловирусов (качественный анализ) можно провести количественный анализ на единицу объема.

Подсчитывают число телец-включений в 100 - 500 полях зрения, при этом общее количество подсчитанных частиц должно быть не менее 400. Затем определяют среднее количество включений в одном поле зрения или в одном квадрате окулярной сетки.

Число включений в 1 куб. м воздуха (M) определяют по формуле:

                                 aSn

                             M = ---,

                                 VS

                                   1

    где:

    a - среднее число включений  в  квадрате окулярной сетки (поле

зрения);

    S - площадь мембранного фильтра, кв. мм;

    V - объем  пропущенного  воздуха,  приведенный   к  нормальным

условиям, л;

    S  - площадь квадрата окулярной сетки (поле зрения);

     1

    n - переводной коэффициент на 1 куб. м, равный 10.

    Пример. Для анализа получены предметные  стекла  с отпечатками

аэрозоля.  Препараты  покрасили  по  непрямому  методу  Кунса, как

описано   выше.   При   просмотре  препаратов  под  люминесцентным

микроскопом  установлено,  что  в  одном  квадрате окулярной сетки

обнаруживается  в среднем 0,5 включений со специфическим свечением

(полиэдров);  a  =  0,5.  Сторона  квадрата  окулярной  сетки  при

объективе  90x,  окуляре  8x  равна  0,12 мм (определили с помощью

объект-микрометра).  Площадь  квадрата окулярной сетки S  = 0,0144

                                                        1    4

кв.  мм;  площадь  мембранного фильтра S = 10 кв. см, т.е. 10  кв.

мм; объем пропущенного воздуха V = 100 л; n = 10.

    Определяем число включений в 1 куб. м воздуха:

                4

        0,5 x 10  x 10

    M = -------------- = 34722,2.

         100 x 0,0144

    Таким  образом,  в  1 куб. м воздуха  рабочей  зоны содержится

              4

около 3,5 x 10  определяемых полиэдров.

Требования безопасности. Соблюдаются меры безопасности, обычно рекомендуемые при работе с микроорганизмами IV группы (условно-патогенные).