Утверждаю

Начальник

Главного управления

карантинных инфекций

В.П.СЕРГИЕВ

ИНСТРУКЦИЯ

ПО БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКОМУ И СЕРОЛОГИЧЕСКОМУ

ИССЛЕДОВАНИЯМ ПРИ КОКЛЮШЕ И ПАРАКОКЛЮШЕ

(для бактериологических лабораторий

санитарно-эпидемиологических станций и больниц)

Инструкция по бактериологическому и серологическому исследованиям при коклюше и паракоклюше составлена научными сотрудниками Московского НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского.

Массовые прививки против коклюша значительно изменили клиническое течение заболевания, что затруднило своевременную постановку диагноза. С помощью лабораторных исследований возможно подтверждение клинического диагноза, выявление атипичных форм заболевания, обнаружение бактерионосителей в окружении больного, а также установление ретроспективного диагноза.

В настоящей Инструкции нашли отражение результаты научных исследований последних лет в области изучения биологических свойств бактерий рода Bordetella, разработки питательных сред и др. Инструкция предусматривает дифференциальную диагностику всех представителей рода бордетелла: B. pertussis, B. parapertussis и B. bronchiseptica на основе выделения чистой культуры и изучения всего комплекса биологических признаков.

ХАРАКТЕРИСТИКА МИКРОБОВ РОДА БОРДЕТЕЛЛА

Клинический синдром коклюша может быть вызван тремя возбудителями: B. pertussis, B. parapertussis и в единичных случаях B. bronchiseptica <*>. Бактериологическое исследование является единственным методом дифференциальной диагностики этих заболеваний, а также случаев смешанной инфекции.

--------------------------------

<*> Бронхисептические микробы являются частыми обитателями дыхательных путей животных (кролики, морские свинки, кошки, собаки и др.).

Возбудители клинического синдрома коклюша относятся к микробам рода Bordetella семейства Halobacterium. Все они грамотрицательные мелкие палочки (коккобактерии), располагаются по одиночке или группами, имеют нежную капсулу, неподвижные (B. pertussis и B. parapertussis) или подвижные (B. bronchiseptica), строгие аэробы. Для роста бордетелл необходимо присутствие различных аминокислот (цистин, пролин, метионин, серин, глютамин и др.), а также никотиновой кислоты, различных солей и др. Оптимальная температура для их роста 35 - 37 °C. Бордетеллы обладают низкой ферментативной активностью: не образуют индола, не разжижают желатин, не ферментируют сахаров. Особенно биохимически мало активна палочка коклюша.

Микробы рода бордетелла имеют общие для всего рода антигены (родовые) и специфические, характерные для каждого вида возбудителя (видовые). Наличие общих родовых антигенов обуславливает положительную реакцию агглютинации с гомологичными и гетерологичными неадсорбированными сыворотками (коклюшные и паракоклюшные) и свидетельствует о наличии у больного микробов рода бордетелла. Видовые антигены (агглютиногены) бордетелл являются специфическим антигенным комплексом (фактором) и условно обозначены для коклюшного микроба цифрой 1, паракоклюшного микроба - 14 и бронхисептического - 12. Адсорбированные монорецепторные сыворотки к видовым антигенам (факторам), 1, 14 и 12 используют для дифференциации вида у представителей рода бордетелла.

Различают 4 сероварианта (серовара) коклюшного микроба, которые определяют с помощью реакции агглютинации на стекле со специфическими монорецепторными сыворотками к антигенам (факторам), обозначенным цифрами 1, 2, 3. Методика постановки реакции показана в приложении к сывороткам. По сочетанию факторных антигенов различают сероварианты коклюшного микроба, обозначенные как 1, 2 <...> - 1, 2, 0 <*> - 1, 0, 3 - 1, 0, 0.

--------------------------------

<*> 0 - отсутствие факторных антигенов.

Характеристика различных свойств микробов рода бордетелла представлена в таблице 1.

Таблица 1

ХАРАКТЕРИСТИКА МИКРОБОВ РОДА БОРДЕТЕЛЛА

┌─────────────────────────────┬──────────────────────────────────┐

│            Тест             │           Вид микроба            │

│                             ├─────────┬─────────────┬──────────┤

│                             │коклюшный│паракоклюшный│бронхисеп-│

│                             │         │             │тический  │

├─────────────────────────────┼─────────┼─────────────┼──────────┤

│Сроки появления колоний      │48 - 72  │24 - 48      │18 - 24   │

│(в час)                      │         │             │          │

│Размер колоний (в мм)        │1 - 2    │2 - 4        │2 - 4     │

│Окраска по Граму             │-        │-            │-         │

│Подвижность                  │-        │-            │+         │

│Рост на простом агаре        │-        │+            │+         │

│Изменение цвета питательных  │-        │+            │-         │

│сред (побурение)             │         │             │          │

│Расщепление мочевины         │-        │+            │+         │

│Утилизация цитратов          │-        │-            │+         │

│Образование пигмента из      │-        │+            │-         │

│тирозина                     │         │             │          │

│Агглютинация видовыми специ- │+        │+            │+         │

│фическими неадсорбированными │         │             │          │

│коклюшными и паракоклюшными  │         │             │          │

│сыворотками                  │         │             │          │

│Агглютинация монорецепторными│         │             │          │

│сыворотками к агглютиногенам │         │             │          │

│(факторам)                   │         │             │          │

│  фактор - 1                 │+        │-            │-         │

│  фактор - 14                │-        │+            │-         │

│  фактор - 12                │-        │-            │+         │

└─────────────────────────────┴─────────┴─────────────┴──────────┘

Условные обозначения:

"-" отсутствие признака

"+" наличие признака.

ПОКАЗАНИЯ К ЛАБОРАТОРНОМУ ИССЛЕДОВАНИЮ

Лабораторная диагностика заболеваний коклюшем и паракоклюшем осуществляется двумя методами: бактериологическим, при котором выделяют возбудителя из слизи с задней стенки глотки, и серологическим, при котором определяют специфические антитела в сыворотке больного или переболевшего. Бактериологический метод обследования является методом ранней диагностики заболеваний, серологический - используют для ретроспективного установления диагноза.

Бактериологическое исследование проводят с диагностической целью и по эпидемическим показаниям.

С диагностической целью обследуются:

1. Дети с подозрением на коклюш и коклюшеподобные заболевания по клиническим показаниям.

2. Дети, которые кашляют в течение 5 - 7 и более дней, независимо от указаний на контакт с больным коклюшем или паракоклюшем.

3. Взрослые с подозрением на коклюш и коклюшеподобные заболевания, которые работают в родильных домах, детских больницах, санаториях, яслях, детских садах, школах, а также в закрытых детских коллективах для детей дошкольного и школьного возраста.

4. Взрослые, работающие с детьми в указанных выше учреждениях, которые кашляют в течение 5 - 7 и более дней, независимо от указаний на контакт с больным коклюшем или паракоклюшем.

По эпидемическим показаниям обследуются лица, общавшиеся с больными коклюшем или паракоклюшем:

1. Дети, посещающие ясли, детские сады, закрытые детские коллективы для детей ясельного и дошкольного возраста или находящиеся в детских больницах, санаториях, а также дети до 7 лет, общавшиеся с больным коклюшем или паракоклюшем в домашних условиях.

2. Взрослые, работающие в указанных выше учреждениях и общавшиеся с больными коклюшем или паракоклюшем в домашних условиях.

БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКАЯ ДИАГНОСТИКА

Основным методом лабораторной диагностики является бактериологический, при котором производится посев исследуемого материала на оптимальные питательные среды и выделение чистой культуры с последующей идентификацией возбудителя. Бактериологическое исследование с диагностической целью следует проводить в ранние сроки заболевания (но не позднее 3-й недели) двукратно ежедневно или через день, так как в более поздние сроки высеваемость возбудителя резко снижается. Необходимость обследования в детских учреждениях и его сроки устанавливает эпидемиолог.

ВЗЯТИЕ МАТЕРИАЛА

Исследуемым материалом является слизь из верхних дыхательных путей, осаждающаяся при кашле на задней стенке глотки. Взятие материала может проводиться двумя способами: а) заднеглоточным тампоном и б) "кашлевыми пластинками".

Заднеглоточным тампоном материал забирают как с диагностической целью, так и по эпидемическим показаниям. Метод "кашлевых пластинок" используют только с диагностической целью при наличии кашля. У детей грудного возраста рекомендуется брать материал заднеглоточным тампоном.

Взятие материала заднеглоточным тампоном должно проводиться специально выделенным инструктированным персоналом: медицинскими сестрами детских поликлиник и детских учреждений, помощниками эпидемиологов, лаборантами. Материал берут в детских поликлиниках в специально выделенном помещении, исключающем контакт с другими детьми, а также в детских учреждениях и на дому. При заборе материала должна быть полностью исключена возможность взаимного заражения обследуемых. Материал забирают натощак или через 2 - 3 часа после еды.

Взятие материала у взрослых производят в бактериологических лабораториях санэпидстанций и в детских учреждениях при обследовании на коклюш и паракоклюш.

Для взятия материала используют два вида тампонов, предварительно изогнутых под тупым углом (до его стерилизации): а) сухой и б) увлажненный. Материал, взятый сухим тампоном, засевают немедленно на одну из рекомендуемых питательных сред, а при взятии материала увлажненным тампоном его доставляют для посева в лабораторию, но не позднее 2 - 4 часов после взятия материала.

Методика взятия материала сухим и увлажненным тампонами одинакова и сводится к следующему. Медицинский работник левой рукой фиксирует с помощью шпателя корень языка, а правой вводит тампон в полость рта, продвигая его за корень языка. Тампон не должен касаться слизистой щек, языка и миндалин. Кончиком тампона и выпуклой его частью касаются задней стенки глотки, проводя по ней справа-налево 2 - 3 раза. Затем также осторожно над шпателем извлекают тампон из полости рта. В обоих случаях посев желательно производить на 2 чашки Петри. Если ребенок проявляет признаки беспокойства, то стоящий за его спиной помощник сзади фиксирует голову.

Взятие материала "кашлевыми пластинками", кроме медицинского персонала, можно поручить родителям, хорошо проинструктировав их. Сбор материала производят на 2 чашки с питательной средой. Во время приступа кашля левой рукой снимают крышку чашки, а правой подносят ее ко рту на расстоянии 10 - 12 см так, чтобы капельки слизи из дыхательных путей попали на поверхность среды. Чашку в таком положении держат некоторое время (в течение 6 - 8 кашлевых толчков). При непродолжительном покашливании можно эту чашку поднести повторно. На питательную среду не должны попадать слюна, рвотные массы, мокрота. Затем чашку с питательной средой закрывают крышкой и доставляют в лабораторию.

При посеве материала с диагностической целью рекомендуется использовать 2 чашки со средой КУА, а по эпидемическим показаниям - 1 чашку.

Для увеличения числа положительных находок коклюшного и паракоклюшного микробов сбор материала рекомендуется производить двумя тампонами: сухим и смоченным забуференным физиологическим раствором по прописи Е.А. Кузнецова <*>. Взятие материала сухим тампоном стимулирует кашель и повышает возможность выделения возбудителя при взятии материала вторым влажным тампоном. Материал с сухого тампона засевают на чашку Петри обязательно на месте взятия его, а с влажного посев можно произвести после доставки тампона в лабораторию.

--------------------------------

<*> См. Приложение.

ДОСТАВКА МАТЕРИАЛА И ОФОРМЛЕНИЕ НАПРАВЛЕНИЯ

Материал на увлажненных тампонах и посевы материала, сделанные в учреждении, необходимо направлять в лабораторию. При транспортировке следует оберегать материал от прямых солнечных лучей, сохраняя его в температурных пределах от +4 до +37 °C. Для чего рекомендуется помещать весь материал в специальные ящики, биксы с защищающей прокладкой (марлевые ватники, грелки и др.). На доставляемый в лабораторию материал должно быть оформлено направление, где указывается:

а) Наименование учреждения, направившего материал на исследование.

б) Фамилия, имя, отчество, возраст и домашний адрес обследуемого.

в) Причина обследования.

г) Дата заболевания.

д) Дата и время взятия материала.

е) Число обследований.

ж) Наименование материала и метод взятия его.

з) Подпись лица, взявшего материал.

БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКИЙ МЕТОД ИССЛЕДОВАНИЯ

Бактериологический метод исследования предусматривает выделение возбудителя заболевания путем посева на плотные питательные среды, выделение чистой культуры и идентификацию возбудителей рода бордетелла до вида. Исследование продолжается в течение 5 - 7 дней.

Первый день исследования

1. Посев материала, взятого тампоном, производят последовательно на 1 - 2 чашки с питательной средой, предварительно обработанной пенициллином или бициллином для подавления сопутствующей микрофлоры <*>. Обработку антибиотиками можно проводить двумя способами: а) путем нанесения его на поверхность питательной среды; б) путем добавления в среду (см. Приложение). Для получения изолированных колоний посев материала производят путем тщательного втирания его тампоном вначале по периферии среды чашки Петри в виде 4 - 5 площадок, а затем Z-образным штрихом в центре чашки. Та же методика посева применяется на второй чашке. Стерильным шпателем растирают центральные части посева, не касаясь площадок.

--------------------------------

<*> При взятии материала "кашлевыми пластинками" среду антибиотиками не обрабатывают.

2. Засеянные чашки (тампоном или "кашлевыми пластинками") помещают в термостат при температуре 35 - 37 °C на 3 суток (72 часа). Для увлажнения воздуха в термостат ставят сосуд с водой.

3. В качестве питательной среды для посева исследуемого материала применяют среды, содержащие кровь: картофельно-глицериновый агар (среда Борде-Жангу) и молочно-кровяной агар или среды без крови; казеиново-угольный агар (КУА). Среды могут быть приготовлены в самих лабораториях (см. Приложение) или приобретены в Дагестанском НИИ питательных сред, который выпускает сухую питательную среду КУА.

Четвертый день исследования (3 сутки, 72 часа)

1. Просматривают посевы на чашках с питательной средой с целью отбора подозрительных колоний микробов рода бордетелла. Просмотр колоний производят при помощи бинокулярного стереоскопического микроскопа (МБС-1, МБС-2, МБС-3) или бинокулярной лупы с большим фокусным расстоянием (БМ-31-2).

2. Колонии микробов рода бордетелла при росте на плотных питательных средах выпуклые, влажные, гладкие, блестящие с ровными краями, серого цвета с голубоватым, жемчужным или металлическим, а иногда желтоватым или беловатым оттенком. Колонии всех трех видов бордетелла имеют мягкую (маслянистую) консистенцию и легко снимаются. При пересмотре колоний в стереоскопическом микроскопе можно наблюдать узкий луч света ("хвостик"), отходящий от ее центра.

Колонии бронхисептического микроба в субкультуре могут быть двух видов: сходные с коклюшными и более плоские, с приподнятым центром.

Сроки появления колоний различны: колонии бронхисептического микроба появляются через 18 - 24 часа, паракоклюшного - через 24 - 48 часов и коклюшного - через 48 - 72 часа. Различная скорость роста отражается на величине колоний при просмотре их через 72 часа (см. таблицу). На средах с кровью вокруг колоний почти всегда образуется зона слабого гемолиза.

Рост коклюшного и бронхисептического микробов на питательной среде не сопровождается изменением ее цвета. Паракоклюшные микробы при обильном росте на среде КУА вызывают диффузное окрашивание среды в буровато-коричневый цвет, что выявляется при просмотре в проходящем свете, а также вызывают потемнение среды с кровью.

3. При наличии на среде выращивания подозрительных колоний производят выделение чистой культуры путем отсева их на скошенный КУА или в чашки Петри с одной из питательных сред. При этом поверхность среды делят на несколько секторов и отсевают каждую колонию на отдельный сектор, тщательно втирая ее в среду круговыми движениями.

4. При наличии значительного количества однотипных подозрительных колоний (см. § 2), помимо выделения чистой культуры, из оставшихся колоний делают мазки в физиологическом растворе, определяя морфологию культуры при окраске по Граму. Одновременно определяют также отсутствие спонтанной агглютинации. Микробы рода бордетелла имеют вид мономорфных мелких овоидных палочек (коккобактерий), равномерно располагаются в мазке, грамотрицательны. Иногда паракоклюшные микробы, особенно со среды Борде-Жангу, могут иметь вид удлиненных полиморфных палочек. Культуру из оставшихся колоний проверяют в реакции агглютинации на стекле со специфическими видовыми неадсорбированными сыворотками <*>, разведенными 1:10, и по возможности с адсорбированными монорецепторными сыворотками к агглютиногенам (факторам) 1 и 14 <**>. Если число подозрительных колоний значительно, то возможна постановка пробы Заксе для определения наличия фермента уреазы.

--------------------------------

<*> ИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи АМН СССР выпускает коммерческие видовые специфические сыворотки "Коклюшная агглютинирующая сыворотка" и "Паракоклюшная агглютинирующая сыворотка".

<**> "Сыворотки к агглютиногенам (факторам) 1, 2, 3 коклюшного микроба и 14 - паракоклюшного микроба" выпускаются ИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи; сыворотка к агглютиногену 12 будет выпущена в ближайшее время.

5. На основании изучения характера колоний и морфологии клеток в мазках, окрашенных по Граму, положительной реакции агглютинации с видовыми неадсорбированными и адсорбированными сыворотками к факторам 1 и 14 на третьи сутки можно выдать предварительный ответ.

6. При отсутствии роста подозрительных колоний на среде выращивания чашки Петри вновь помещают в термостат на 24 - 48 часов и просматривают повторно в соответствующие сроки.

Пятый-шестой день исследования (4 - 5 сутки, 96 - 120 час.)

1. Просматривают посевы, произведенные для выделения чистой культуры, и отмечают изменение цвета среды: паракоклюшные микробы диффузно окрашивают среду выращивания (КУА) в буровато-коричневый цвет.

2. На предметном стекле в капле физиологического раствора готовят мазки и окрашивают их по Граму, определяют морфологию выделенной культуры, ее чистоту, а также отсутствие спонтанной агглютинации.

3. Серологические свойства проверяют в реакции агглютинации на стекле со специфическими неадсорбированными коклюшными и паракоклюшными сыворотками, разведенными 1:10, а также с адсорбированными монорецепторными сыворотками к факторам 1 и 14. Серовариант коклюшного микроба определяют агглютинацией с монорецепторными сыворотками к факторам 1, 2, 3.

4. Для проверки биохимических свойств производят посевы чистой культуры на агаровую среду с тирозином (определение наличия тирозиназы), определяют наличие уреазы пробой Заксе (см. ниже) или посевом на бульон Хоттингера с мочевиной (см. Приложение). При подозрении на выделение чистой культуры бронхисептического микроба определяют утилизацию цитрата на среде Симмонса и подвижность путем посева на среду полужидкий агар (0,5% агар-агара).

B. pertussis биохимически инертна: не растет на мясопептонном агаре, не изменяет цвета агаровой среды с тирозином, не имеет фермента уреазы (проба Заксе отрицательная), не утилизирует цитраты.

B. parapertussis дает рост на простых питательных средах, изменяет среды с тирозином в коричневый цвет, обладает ферментом уреазой (проба Заксе положительная).

B. bronchiseptica отличается быстрым ростом на простых питательных средах, подвижностью, не изменяет цвета среды с тирозином, способна утилизировать цитраты на среде Симменса (см. табл. 1).

5. На основании изучения чистой культуры: морфологии колоний и клеток, реакции агглютинации с видовыми неадсорбированными сыворотками и адсорбированными монорецепторными сыворотками к факторам 1 и 14, результатов пробы на уреазу, изменения цвета среды с тирозином, утилизации цитратов может быть выдан окончательный положительный ответ.

6. Если в течение пяти суток (6 день исследования) на среде выращивания не обнаружены колонии, подозрительные для бактерий рода бордетелла, наблюдение прекращают и выдают окончательный отрицательный ответ.

МЕТОДИКА ИЗУЧЕНИЯ ФЕРМЕНТАТИВНОЙ АКТИВНОСТИ И ЕЕ УЧЕТ

1. Для определения уреазной активности микробов смесь реактивов А (1 часть) и Б (19 частей) разливают по 0,1 - 0,2 мл в стерильные агглютинационные пробирки (с пробками) и вносят 1 - 2 петли испытуемой культуры. Пробирки помещают в термостат при 35 - 37° на 30 минут. Учет результатов производят после инкубирования, а при отсутствии изменения цвета смеси пробирки оставляют при комнатной температуре и результат учитывают на следующий день. Одновременно ставят контроль реактива без внесения культуры. При наличии у микробов фермента уреазы происходит расщепление мочевины до аммиака, что приводит к защелачиванию среды, изменяя ее цвет из желтого в малиновый.

2. Для определения потребности в цитратах делают посев испытуемой культуры на скошенный агар среды Симмонса. Пробирки инкубируют при 37° одни сутки. Цитратассимилирующие бактерии хорошо растут, подщелачивают среду и вызывают окрашивание ее в синий цвет. Микробы, не ассимилирующие цитраты на этой среде, не растут и не меняют ее цвета.

3. Для определения пигментообразования производят посев выделенной культуры на простой питательный агар с 0,1% тирозина с инкубацией в течение суток при 37 °C. При расщеплении тирозина среда окрашивается в желто-коричневый цвет.

СХЕМА БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКОГО ИССЛЕДОВАНИЯ

1-е сутки. 1. Посев исследуемого материала на среды выращивания и инкубирование в термостате при 35 - 37°.

3-е сутки (через 72 часа).

1. Изучение характера колоний на средах выращивания с использованием стереоскопического микроскопа.

2. Отсев колоний для получения чистой культуры микроба.

3. При наличии большого числа колоний на среде выращивания:

а) приготовление мазков, окраска их по Граму, микроскопия;

б) постановка реакции агглютинации на стекле со специфическими неадсорбированными коклюшными и паракоклюшными сыворотками в разведении 1:10 и специфическими монорецепторными сыворотками к агглютиногенам (факторам) 1 и 14;

в) постановка пробы на уреазу.

4. Выдача предварительного положительного результата проведенного исследования.

4-е сутки (через 96 часов).

1. Изучение выделенной чистой культуры в случае наличия в исследуемом материале паракоклюшного или бронхисептического микробов: а) изучение характера роста чистой культуры и изменения цвета питательной среды, б) приготовление мазков и окраска их по Граму, микроскопия, в) постановка реакции агглютинации на стекле с видовыми неадсорбированными и монорецепторными сыворотками к агглютиногенам (факторам) 1, 14 и 12, г) постановка пробы на уреазу и учет результатов, д) посев на среду с МПА с тирозином, ж) при необходимости определение подвижности путем посева в столбик полужидкого агара и е) посев на среду Симмонса.

5-е сутки (через 120 часов).

1. Изучение выделенной культуры коклюшного микроба или в случае позднего роста паракоклюшного по схеме 4-х суток исследования.

2. Учет результатов 4-х суток исследования.

3. Определение сероварианта коклюшного микроба.

4. Выдача окончательного ответа: положительного или отрицательного.

Примечание: При отсутствии роста подозрительных колоний на третьи сутки исследования чашки со средой выращивания просматривают на четвертые и пятые сутки. Дальнейший ход исследования продолжается по схеме.

АТИПИЧНЫЕ ШТАММЫ КОКЛЮШНОГО МИКРОБА

В очагах коклюшной инфекции могут быть обнаружены атипичные штаммы коклюшного микроба. Они отличаются от типичных культур морфологическими свойствами и характером колоний. В среде выращивания (КУА) такие штаммы образуют через 72 часа роста иногда более крупные колонии, с плоской поверхностью, западающим центром, имеют беловатый, бурый, желтоватый или слегка розоватый и зеленоватый цвет, маслянистую консистенцию. Морфология клеток в мазках из колоний может отличаться от типичной: встречаются более длинные палочки, раздутые овоидные палочки с ослизненным концом, формы в виде стрептобацилл. Чистая культура, выделенная из таких колоний, обладает типичными для коклюшного микроба свойствами. Биохимические и серологические свойства атипичных штаммов характерны для коклюшного микроба: они не разлагают мочевину и тирозин, агглютинируются на стекле специфическими видовыми неадсорбированными сыворотками, типируются моноспецифическими рецепторными сыворотками к факторам 1, 2, 3.

Примечание: В ряде случаев из зева детей и взрослых могут быть выделены грамотрицательные бактерии, сходные с коклюшным микробом по морфологии, виду колоний и серологическим свойствам. В чистой культуре они представляют собой грамотрицательные овоидные палочки, образуют сходные с типичными коклюшными микробами колонии, агглютинируются на стекле видовыми неадсорбированными коклюшными и паракоклюшными сыворотками, дают положительную реакцию агглютинации в пробирках в разведениях до 1:320 и не агглютинируются монорецепторными сыворотками. Специальные исследования в реакции иммуноэлектрофореза показали, что они не имеют антигенов, характерных для коклюшного и паракоклюшного микробов, и хорошо растут на простых питательных средах.

В случае обнаружения грамотрицательных бактерий, которые не могут быть идентифицированы как возбудители коклюша и паракоклюша, культуру можно пересылать в микробиологический отдел МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского <*>.

--------------------------------

<*> 125212, Москва, ул. Адмирала Макарова, 10.

Учитывая наличие атипичных штаммов коклюшного микроба, рекомендуется при выделении чистой культуры производить отсев с питательной среды максимального числа колоний всех видов, в среднем не менее пяти.

СРОКИ ВЫДАЧИ И ФОРМУЛИРОВКА ОТВЕТОВ

Ответ при исследовании на коклюш и паракоклюш выдается, как правило, на 3 - 5 сутки. Предварительный положительный ответ может быть выдан на третьи сутки с формулировкой: "Обнаружены микробы, подозрительные на бактерии рода бордетелла, исследование продолжается". Окончательный положительный ответ может быть выдан на 5 - 6 сутки и формулируется: "Обнаружены коклюшные (паракоклюшные, бронхисептические) микробы". Отрицательный ответ выдается на 5 сутки при отсутствии подозрительных колоний для бактерий рода бордетелла и формулируется: "Коклюшные (паракоклюшные, бронхисептические) микробы не обнаружены".

В случае замедленного роста микробов или выделения нетипичной культуры предварительный и окончательный ответы могут быть выданы позже (6 - 7 сутки).

СЕРОЛОГИЧЕСКАЯ ДИАГНОСТИКА

Серологическая диагностика коклюша и паракоклюша заключается в обнаружении в исследуемой сыворотке специфических антител. Исследования производят на 2 - 3 неделе заболевания, когда в крови больных появляются специфические антитела. В связи с широкой иммунизацией против коклюша результаты серологических реакций могут иметь диагностическое значение только при изучении их в динамике, исследуя парные сыворотки больного не менее чем 2 - 3 раза с интервалом 1 - 2 недели. Серологические реакции следует ставить параллельно с коклюшным и паракоклюшным диагностикумами.

Кровь для исследования можно взять из пальца (0,8 - 1,0 мл) с соблюдением обычных правил асептики. Вытекающую кровь собирают, приложив к месту укола оттянутый (не слишком тонко) конец короткой пастеровской пипетки. Кровь из пипетки выдувают в центрифужную пробирку, которую затем помещают на 10 - 15 минут в термостат. Образовавшийся сгусток отделяют от стенки пробирки и помещают ее в холодильник до отделения сыворотки. Сыворотку отсасывают пастеровской пипеткой, разводят физиологическим раствором 1:5 или 1:10, плотно закрывают пробкой и хранят в холодильнике.

В случае когда удается взять кровь в лишь небольшом количестве, ее набирают в количестве 0,2 или 0,5 мл и вносят в пробирку, куда предварительно наливают 1,8 мл стерильного физиологического раствора. После центрифугирования смесь сыворотки с физиологическим раствором (разведение сыворотки соответственно 1:20 или 1:10) переносят в стерильную пробирку и из нее делают последующие 2-кратные разведения (1:20, 1:40 и т.д.).

Наиболее доступна в условиях практических лабораторий реакция агглютинации.

Реакция агглютинации <*>

--------------------------------

<*> Для реакции агглютинации ИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи АМН СССР выпускает коммерческие препараты: "Коклюшный диагностикум" и "Паракоклюшный диагностикум".

Из исследуемой сыворотки готовят 9 - 10 последующих разведений: 1:5, 1:10 и т.д. до 1:1280 или 1:2560. В 10-ю (или 11-ю) пробирку наливают вместо сыворотки 0,25 мл физиологического раствора (контроль). Реакцию агглютинации ставят в объеме 0,5 мл: к 0,25 мл соответствующего разведения сыворотки добавляют 0,5 мл диагностикума. Пробирки помещают в термостат при 37° на 2 часа и оставляют затем при комнатной температуре. Результаты учитывают на следующий день с помощью агглютиноскопа. Конечным титром считают разведение, при котором отмечается четкая агглютинация на два креста (++), однако реакция учитывается как положительная лишь при наличии в предыдущих пробирках четкой агглютинации на четыре или три креста (4+ или 3+).

Диагностическим титром реакции агглютинации у непривитых и неболевших детей считают разведение 1:80. У иммунизированных детей и взрослых положительные результаты реакции учитывают только при исследовании парных сывороток крови, взятых с интервалом в 1 - 2 недели при нарастании титра не менее чем в 4 раза.

Существуют и другие серологические реакции (РПГА, РСК и люминесцентно-серологический метод), не применяемые из-за отсутствия коммерческих препаратов.

Приложение

МЕТОДЫ ПРИГОТОВЛЕНИЯ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД

КАЗЕИНОВО-УГОЛЬНЫЙ АГАР

(по методике ИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи АМН СССР в модификации

Московской городской санитарно-эпидемиологической станции)

Приготовление гидролизата казеина

Для приготовления казеинового гидролизата рекомендуется использовать казеин кислотный технический первого сорта, ГОСТ 1211-41, и пищевой кислотный, ТУ 153-54; активированный древесный уголь осветляющий марки А, ГОСТ 4453-48 (может быть использован активированный уголь и другой марки); соляную кислоту химически чистую с удельным весом 1,19.

Казеин отмывают 0,2-процентным раствором уксусной кислоты в течение 6 - 7 дней (25 мл 80-процентной уксусной кислоты на 10 л воды). В первый день раствор меняют три раза, а в последующие 5 - 6 дней по одному разу в день. Затем казеин промывают дистиллированной водой, хорошо отжимают и высушивают при температуре от 60 до 70° или при комнатной температуре.

Гидролизат казеина получают под давлением с помощью крепкой соляной кислоты. Для этого в стеклянной посуде (колба или бутыль емкостью в 2 л) смешивают 400 г казеина, 400 мл соляной кислоты и 200 мл дистиллированной воды. Смесь автоклавируют при 127° в течение 3 - 4 час. После автоклавирования гидролизат двукратно разводят дистиллированной водой, фильтруют через полотно или бумагу. Затем объем фильтрата доводят дистиллированной водой до 3 л и осветляют активированным углем. Для этого добавляют 50 г угля на 1 л фильтрата. Смесь кипятят в течение 10 мин. и пропускают через бумажный фильтр. Из указанного выше количества казеина получается примерно 3 л гидролизата, который представляет собой прозрачную жидкость слегка желтоватого цвета. После фильтрации в готовом гидролизате определяют количество аминного азота методом формольного титрования (методика количественного определения аминного азота приводится ниже). Гидролизат можно хранить при комнатной температуре при добавлении 0,5% хлороформа в течение нескольких месяцев.

Методика количественного определения аминного азота <*>

--------------------------------

<*> В соответствии с Методическими указаниями МЗ СССР по применению физико-химических методов контроля питательных сред. М., 1977.

Принцип метода основан на блокировании формальдегидом при pH = 7,0 свободных аминогрупп и титровании щелочью эквивалентного количества карбоксильных групп. Начало и конец титрования определяют потенциометрически.

Реактивы:

1. Едкий натр 0,1 н раствор

2. Соляная кислота 0,1 н раствор

3. Формалин (40% раствор формальдегида). Перед каждым определением pH формалина доводят до 7,0.

Ход определения

Для анализа используют определенный объем "B" жидкого образца или раствора сухого образца с содержанием аминного азота 1,5 - 5 мг. "B" равно для жидких гидролизатов низкой степени расщепления (0,1 - 0,2% аминного азота) - 3 мл; средней степени расщепления (0,3 - 0,6% аминного азота) - 1 мл; высокой степени расщепления (0,7 - 1,3% аминного азота) - 0,5 мл; для жидких питательных сред (0,08 - 0,14% аминного азота) - 3 мл; для жидких экстрактов (0,02 - 0,04% аминного азота) - 0 мл. При анализе сухих образцов, таких как сухие гидролизаты, сухие питательные среды, сухие экстракты с содержанием аминного азота 1,5 - 4,0% "В" равно 10 мл 1% раствора (анализируемая навеска образца составляет 100 мг).

В стакан емкостью 50 мл наливают объем "В" анализируемого раствора образца и доводят общий объем дистиллированной водой до 20 мл. Электроды потенциометра погружают в исследуемый раствор, pH которого доводят до 7,0 с помощью 0,1 н раствора NaOH или 0,1 н раствора соляной кислоты. Во время определения электроды должны оставаться погруженными в раствор. К нейтрализованному раствору добавляют 2 мл нейтрального формалина, перемешивают и, не вынимая электродов, титруют содержимое 0,1 н раствором едкого натра до pH 9,1. При титровании следует использовать микробюретку на 5 мл.

Содержание аминного азота в исследуемом образце в % вычисляют по формуле:

Для жидкого образца:

                                A x K x 1,4 x 100

                          X  =  -----------------,

                           1        B x 1000

где:

А - количество 0,1 н раствора NaOH в мл, пошедшее на титрование испытуемой пробы;

K - поправка к титру 0,1 н раствора NaOH;

                                       -

    1,4 - количество аминного азота в м , эквивалентное 1 мл 0,1 н раствора

NaOH;

100 - коэффициент пересчета в проценты;

B - количество жидкого образца в мл, взятое на анализ;

1000 - коэффициент пересчета мг в г.

Для сухого образа:

                               A x K x 1,4 x 100

                          X  = -----------------,

                           2          C

где С - анализируемая навеска сухого образца в мг, содержащаяся в титрируемом объеме "В".

Остальные обозначения смотри выше.

Приготовление диализата дрожжей

Свежие хлебные дрожжи (прессованные) в количестве 1 кг размешивают в 1 л дистиллированной воды до состояния гомогенной массы, которую переливают в целлофановый мешок, предварительно промытый дистиллированной водой. Мешок завязывают, обмывают под струей водопроводной воды, а затем дистиллированной водой и погружают в эмалированную посуду (кастрюля, бак), в которую предварительно наливают 1,3 л дистиллированной воды. Мешок должен быть полностью погружен в воду. Диализ ведут при температуре от 60° до 80° в течение 6 часов (за это время количество воды в кастрюле должно уменьшиться примерно в 2 раза). Затем жидкость из кастрюли переливают в стерильную бутыль.

Для повышения выхода диализата можно повторить диализ этих же дрожжей следующим образом: мешок с дрожжами заливают второй раз таким же количеством дистиллированной воды, предварительно нагретой до 70°; сосуд, в котором проводится диализ, в целях сохранения тепла накрывают ватником и оставляют на ночь. На следующий день жидкость из кастрюли смешивают с первой порцией, добавляя хлороформ (0,5%); сохраняют при температуре от 5° до 7° до 3 месяцев.

Приготовление экстракта дрожжей

Свежие хлебные дрожжи (прессованные) в количестве 1 кг суспензируют в 1 л дистиллированной воды, стерилизуют текучим паром (100 °C) в течение 30 мин., затем отстаивают в холодильнике (+4 °C) в течение 5 - 6 суток. Надосадочную жидкость декантируют (осторожно сливают), разливают во флаконы и вновь стерилизуют при 100 °C в течение 30 минут. Последующее хранение дрожжевого экстракта рекомендуют в холодильнике.

Состав приготовления казеиново-угольного агара

Для приготовления 1 литра среды КУА необходимы следующие ингредиенты:

1. Казеиновый гидролизат - из расчета, чтобы в готовой среде содержалось 130 - 150 мг% аминного азота (расчет количества гидролизата приводится ниже)

    2. KH PO  - 0,5 г

         2  4

    3. MgCl  - 0,4 г или 2 мл 20% раствора

           2

    4. Крахмал растворимый - 1,5 г

    5. CaCl  - 0,01 г или 1 мл 1% раствора

           2

    6. FeSO  - 0,01 г или 1 мл 1% раствора

           4

    7. CuSO  - 0,005 г или 1 мл 0,5% раствора

           4

8. Цистин или цистеин L- и LD-формы - 0,03 г или 2 мл 1,5% раствора

9. Дрожжевой диализат или дрожжевой экстракт - 100 мл

10. Агар-агар <*> - 22 г

11. Уголь активированный - 3 г.

--------------------------------

<*> Качество питательной среды, приготовленной с новой партией агар-агара, обязательно проверяется по методике, указанной ниже.

Количество гидролизата казеина, которое берут для приготовления казеиново-угольного агара, не является постоянным, а меняется в зависимости от содержания в гидролизате аминного азота. Количество гидролизата, которое следует взять для приготовления среды, определяют следующим образом: если, например, в казеиновом гидролизате содержится 800 мг% аминного азота, а в изготовляемой среде должно содержаться его 150 мг%, то производят расчет:

    1000 мл x 150 мг%

    ----------------- = 187 мл гидролизата на 1 л среды.

         800 мг%

Казеиновый гидролизат и дистиллированную воду (примерно 600 мл) смешивают в эмалированной кастрюле соответствующей емкости и нейтрализуют 20% едким натром до pH 7,0 по бромтимолсинему (до зеленого цвета). Затем вносят навески различных солей по прописи. Крахмал предварительно растворяют в небольшой порции горячей воды и вносят в виде раствора. Агар-агар промывают под струей водопроводной воды в течение нескольких часов или замачивают на 1 - 2 часа и вносят в смесь, после чего кипятят 10 мин. для расплавления агар-агара над пламенем горелки. Затем к смеси добавляют цистин или цистеин, дрожжевой диализат или дрожжевой экстракт. Устанавливают pH <...>,3 по компаратору (метанитрофенол) и вносят активированный уголь, тщательно перемешивая. Среду разливают во флаконы или пробирки. Стерилизуют при 110° в течение 20 мин. Среду во флаконах после стерилизации охлаждают до 45 - 50°, тщательно перемешивают для равномерного распределения угля и разливают по чашкам, а среду в пробирках после охлаждения и перемешивания скашивают. Оставшуюся впрок среду во флаконах (матрацах) по мере необходимости растапливают в водяной бане или аппарате Коха (текучим паром) до полного расплавления агара. Излишнее прогревание среды не рекомендуется. Готовая среда должна иметь черный цвет, конденсационная вода не должна содержать частиц угля. Среда, разлитая в чашки Петри, хранится в холодильнике в течение недели.

Для улучшения качества питательной среды одновременно с цистином можно добавить 0,03 г на 1 литр ее пролина или глютанина.

Сухой казеиново-угольный агар

В 100 мл дистиллированной воды тщательно размешивают 4,5 - 5,0 г порошка, доводят до кипения, автоклавируют 30 мин. при 110°. Среду перемешивают и разливают в чашки Петри или пробирки. Повторное растапливание среды не рекомендуется. Для улучшения качества казеиново-угольной среды можно добавлять 3 - 5 мл стерильной крови (дифибринированной) барана, лошади, крупного рогатого скота, кролика, человека на 100 мл стерильной остуженной среды. Среду тщательно перемешивают и разливают в чашки Петри или пробирки. Вместо крови для улучшения роста можно добавить до автоклавирования среды 0,5% активированного угля марки "А" или другой марки одновременно с дрожжевым диализатом или экстрактом (50 мл на 1 л среды), предварительно нейтрализованным (по бромтимоловому синему до зеленого цвета) до pH 7,0.

Методика проверки качества казеиново-угольного агара

В связи с довольно сложным составом казеиново-угольной среды и большой чувствительностью ее к режиму стерилизации следует периодически проверять качество готовой среды. Для этой цели необходимо пользоваться свежевыделенными культурами коклюшного микроба <*>. В стерильных пробирках делают 8 различных разведений взвеси 2 - 3-суточной культуры. Густота взвеси в первой пробирке должна соответствовать 5 млрд. микробных тел в 1 мл по стандарту мутности для коклюшных микробов <**>. Во 2 - 6 пробирки наливают по 4,5 мл стерильного физиологического раствора, в 7-ю наливают 2 мл и в 8-ю - 1 мл. Поверхность одной или двух чашек Петри с используемой средой делят на 2 - 4 или 8 секторов (в зависимости от питательной среды): 0,5 мл взвеси из 1 пробирки переносят стерильной пипеткой во 2 пробирку и этой же пипеткой наносят 0,1 мл взвеси на сектор 1. Другой стерильной пипеткой перемешивают содержимое второй пробирки (вдуванием и выдуванием), переносят из нее 0,5 мл в 3-ю пробирку и 0,1 мл наносят на сектор 2 и т.д. Для каждого разведения следует употреблять отдельную стерильную пипетку, перемешивая ею содержимое пробирки. В 8-ю пробирку переносят из 7-й 1 мл взвеси, также перемешивая стерильной пипеткой, и наносят 0,1 мл на сектор 8.

--------------------------------

<*> При отсутствии свежевыделенных культур в лаборатории их можно получить в ГИСК им. Л.А. Тарасевича.

<**> Стеклянный стандарт мутности для оптической стандартизации бактерийных взвесей выпускает ГИСК им. Л.А. Тарасевича.

Чашку Петри осторожно, крышкой кверху (чтобы капли не слились) ставят в термостат и выдерживают в течение 3 - 5 суток. Если среда приготовлена правильно, то на первых трех секторах рост имеет вид сплошных бляшек, на секторах 4, 5 и 6 вырастают тесно расположенные колонии, а на секторах 7 и 8 - небольшое количество изолированных колоний. Если нет роста на последних 2 секторах, то средой пользоваться нельзя.

При использовании питательных сред с добавлением крови чашки Петри делят на 2 сектора, а при использовании сухих сред (КУА) с добавлением дрожжевого экстракта - на 4 сектора.

В районных лабораториях СЭС можно использовать метод проверки качества питательной среды, предложенный Е.А. Кузнецовым. Посев колонии коклюшного микроба производят на 1/16 поверхности чашки со средой КУА, разлитой в чашки Петри. Всего проверяют 5 - 10 колоний. Учет роста культуры проводят через 48 часов. В случае роста культуры по всему сектору - среда хорошего качества, при росте на 1/2 сектора - замедленный рост коклюшного микроба; рост только на посевной площадке - среда плохая.

СХЕМА ПРИГОТОВЛЕНИЯ РАЗВЕДЕНИЙ КОКЛЮШНОЙ КУЛЬТУРЫ

ДЛЯ ПРОВЕРКИ КАЧЕСТВА КУА

┌──────┬───────────┬─────────────────────┬───────────────────────┐

│N про-│Кол-во физ.│Объем вносимой взвеси│  Количество микробов  │

│бирок │р-ра (в мл)│       (в мл)        │        в 1 мл         │

├──────┼───────────┼─────────────────────┼───────────────────────┤

│      │           │                     │                  9    │

│1     │1,0        │1,0 исходной взвеси  │5000000000 (5 x 10 )   │

│      │           │                     │                 8     │

│2     │4,5        │0,5 из 1-й пробирки  │500000000 (5 x 10 )    │

│      │           │                     │                7      │

│3     │4,5        │0,5 из 2-й -"-       │50000000 (5 x 10 )     │

│      │           │                     │               6       │

│4     │4,5        │0,5 из 3-й -"-       │5000000 (5 x 10 )      │

│      │           │                     │              5        │

│5     │4,5        │0,5 из 4-й -"-       │500000 (5 x 10 )       │

│      │           │                     │             4         │

│6     │4,5        │0,5 из 5-й -"-       │50000 (5 x 10 )        │

│      │           │                     │         4             │

│7     │2,0        │0,5 из 6-й -"-       │10000 (10 )            │

│      │           │                     │            3          │

│8     │1,0        │1,0 из 7-й -"-       │5000 (5 x 10 )         │

└──────┴───────────┴─────────────────────┴───────────────────────┘

КАРТОФЕЛЬНО-ГЛИЦЕРИНОВЫЙ АГАР (СРЕДА БОРДЕ-ЖАНГУ)

(приготовление 4 л среды)

Приготовление картофельного отвара

Картофель (Лорх) тщательно моют щеткой с мылом, обтирают спиртом и снимают ножом поверхностный слой, тщательно вырезая все почки. Затем картофель промывают дистиллированной водой, нарезают на куски и отвешивают требуемое количество в чистую посуду. Картофель в количестве 500 г заливают 1 л дистиллированной воды, варят до неполной готовности, добавляют 4% глицерина и варят до полной готовности. Отстоявшуюся жидкость фильтруют через 6 слоев марли, предварительно промытой и высушенной. К оставшемуся в кастрюле картофелю добавляют небольшое количество горячей дистиллированной воды, встряхивают, дают немного отстояться и фильтруют через тот же фильтр, после чего доводят объем жидкости до первоначального (1 л), добавляя горячую воду (дистиллированную) через тот же фильтр. Картофельный отвар можно готовить впрок, стерилизуя при 120° в течение 15 мин.

Приготовление картофельно-глицеринового агара

К 3 литрам дистиллированной воды добавляют 0,75% химически чистой NaCl (из расчета на 3 л) и 4% агар-агара (из расчета на все количество среды). Смесь помещают в автоклав, где агар-агар расплавляется текучим паром в течение часа. После отстаивания (в выключенном автоклаве) агар фильтруют через один слой марли, не выливая осадка. Солевой агар (3 части) и картофельный отвар (1 часть) смешивают в горячем виде, разливают во флаконы и однократно стерилизуют при 120° в течение 30 мин. Реакцию среды не проверяют.

Перед употреблением к растопленному и остуженному до 45° картофельно-глицериновому агару добавляют стерильную дефибринированную кровь в количестве 20 - 25% (цитратная и консервированная кровь непригодна).

МОЛОЧНО-КРОВЯНОЙ АГАР

К 1 л водопроводной воды добавляют 40 - 45 г агара и 10 г хлорида натрия и растапливают в автоклаве. Затем фильтруют через несколько слоев марли. К горячему агару добавляют равное количество обезжиренного молока, подогретого до температуры от 65 до 70°, перемешивают и выдерживают в аппарате Коха при текучем паре в течение 30 - 40 мин. После чего фильтруют также в аппарате Коха через несколько слоев марли, дают отстояться и осторожно декантируют верхний прозрачный слой. После этого среду разливают в бутылки и стерилизуют в автоклаве при 1/2 атм. в течение 40 мин. Перед употреблением к расплавленному и остуженному до 44 °C агару добавляют дефибринированную кровь человека, лошади, кролика или барана в количестве 20 - 25%.

ПИТАТЕЛЬНЫЙ АГАР С ТИРОЗИНОМ

К 100 мл дистиллированной воды добавляют 3,5 г сухого питательного агара и 0,1 г тирозина, расплавляют над пламенем горелки, разливают по пробиркам и стерилизуют при 0,5 атм. 20 - 30 мин.

ПРИГОТОВЛЕНИЕ СРЕДЫ СИММОНСА <*>

--------------------------------

<*> Для приготовления среды Симмонса можно использовать среду Ковера.

1. Дистиллированная вода - 1 л

    2. (NH ) HPO  - 1,5 г

          4 2   4

    3. KH PO  - 1,0 г

         2  4

    4. MgSO  x 7H O - 0,2 г

           4     2

5. Na-цитрат - 3,0 г

6. Агар-агар - 20,0 г

В половинном количестве дистиллированной воды растворяют фосфорнокислый аммоний, фосфорнокислый калий и сернокислый магний. В другой части воды расплавляют агар. Соединяют обе части, предварительно слив с осадка. Добавляют лимоннокислый натрий, нейтральный, устанавливают pH 7,1 - 7,2. Добавляют индикатор - 1,6% раствор бромтимолового синего - 9,4 мл. Стерилизуют при 0,5 атм. 30 мин.

БУЛЬОН ХОТТИНГЕРА С МОЧЕВИНОЙ

К 100 мл бульона Хоттингера pH = 7,0 добавляют 1 г мочевины и 0,2 мл 1,6% спиртового раствора крезолового красного, стерилизуют текучим паром при 100° в течение 15 мин. Посев производят в 1 мл среды петлей, выдерживают 24 часа при 35 - 37 °C.

ПРИГОТОВЛЕНИЕ РЕАКТИВОВ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ УРЕАЗЫ

(по методу Заксе)

    Готовят 2 реактива. Реактив А: 2 г мочевины, 2 мл 96° этилового спирта,

4  мл  дистиллированной  воды.  Реактив  Б:  1  мл 0,2% спиртового раствора

фенол-рота,  0,1  г   однозамещенного   фосфата   калия   (KH PO ),  0,1  г

                                                             2  4

двузамещенного фосфата калия (K HPO ), 100 мл дистиллированной воды, 0,5  г

                               2   4

хлористого натра. Реактив А не стерилизуют и хранят при температуре от 4 до

10°, реактив Б стерилизуют в автоклаве текучим паром.  Перед  употреблением

смешивают 1 часть реактива А и 19 частей реактива Б.

РАСТВОР ДЛЯ СМАЧИВАНИЯ ТАМПОНОВ

(по прописи Е.А. Кузнецова)

    В  конической колбе смешивают 90 - 95 мл предварительно приготовленного

1/15 м раствора Na HPO  (11,876 г на 1 л дистиллированной воды) и 5 - 10 мл

                  2   4

раствора  KH PO   (9,078  г  на  1  л  дистиллированной воды); к этой смеси

            2  4

добавляют  0,5 г агар-агара, стерилизуют при 1 атм. 20 мин. Затем в горячую

смесь  добавляют  0,2  г  активированного  угля  (навеску  угля стерилизуют

отдельно). Смесь готовят впрок и хранят в холодильнике до 2 месяцев.

ПРИГОТОВЛЕНИЕ И СТЕРИЛИЗАЦИЯ ТАМПОНОВ

А. Сухие ватные тампоны: на один конец металлической легкосгибающейся проволоки плотно наматывают слой гигроскопической ваты. Длина намотки должна быть равной 4 - 5 см (во избежание аспирации ваты). Затем конец проволоки с намоткой ваты (1 - 2 см) изгибают под тупым углом 110 - 120°. Другой конец проволоки монтируют в корковую или ватную пробку. Изготовленный тампон помещают в пробирку и стерилизуют в автоклаве при 112° в течение 30 мин. или в сушильном шкафу при температуре 140 - 150° в течение часа.

Б. Увлажненные тампоны: готовят из легкосгибающейся нержавеющей проволоки (лучше алюминиевой). Намотку ваты, сгибание и стерилизацию проводят так же, как указано для сухих тампонов. Стерильные тампоны перед употреблением смачивают в забуференной смеси путем двукратного погружения в пробирку с жидкостью. После смачивания тампона его помещают в пробирку, а затем используют для взятия материала. Хранить 3 дня в условиях холодильника.

СХЕМА РАЗВЕДЕНИЯ ПЕНИЦИЛЛИНА

Для подавления посторонней микрофлоры при посеве исследуемого материала используют пенициллин или бициллин. Их применяют как при обработке поверхности питательной среды, разлитой в чашки Петри, так и при внесении антибиотика в среду. Для обработки поверхности среды используют антибиотики из расчета 7,5 МЕ, нанося его на поверхность среды шпателем или внося его в растопленный и остуженный КУА из расчета 25 - 50 МЕ на 100 мл среды.

Пенициллин разводят непосредственно перед взятием материала. Для этого во флакон с антибиотиком добавляют стерильный физиологический раствор для получения основного разведения пенициллина. При содержании во флаконе 500000 МЕ в него добавляют 1 мл физиологического раствора, а при содержании 1 млн. МЕ - 2 мл. Полученное основное разведение антибиотика во флаконе можно хранить в условиях холодильника при +4 °C не более недели. Для получения необходимых для работы концентраций антибиотика 0,1 мл основного разведения из флакона (50000 МЕ) растворяют в 9,9 мл стерильного физиологического раствора. 1 мл такого раствора содержит 5000 МЕ на 1 мл. Далее делают разведения до получения 75 МЕ в 1 мл физиологического раствора.

Схема разведения пенициллина или бициллина

1 пробирка - физиологический раствор 9,9 + 0,1 мл основного разведения антибиотика = в 1 мл 5000 МЕ.

2 пробирка - физиологический раствор 8,5 мл + 1,5 мл раствора из 1 проб. антибиотика = в 1 мл 750 МЕ.

3 пробирка - физиологический раствор 4,5 + 0,5 мл раствора из 2 проб. антибиотика = в 1 мл 75 МЕ.

Из третьей пробирки наносят 0,1 мл (7,5 МЕ) на поверхность питательной среды в каждой чашке, тщательно втирая шпателем. Раствор из третьей пробирки можно использовать для внесения его внутрь среды. Для этого 4 мл (300 МЕ) антибиотика добавляют на 1 л среды (из расчета 30 МЕ на 100 мл среды). Это же разведение можно использовать для добавления к смачивающим жидкостям из расчета 0,1 мл на 10 - 12 мл жидкости. Рабочее разведение антибиотика (в последней пробирке) используют только в день приготовления.

Наставление для работы с коклюшными культурами,

необходимыми для проверки качества питательной среды

Коклюшная культура, высушенная из замороженного состояния под вакуумом, может храниться неопределенно долгое время при сохранении вакуума в ампуле и при температуре не выше 10°. Ампулу с высушенным штаммом вскрывают стерильно над лотком. Верхний конец ампулы нагревают на пламени горелки и снимают парафин, затем кусочком стерильной ваты, смоченным в стерильной воде, осторожно прикасаются к оттянутому концу ампулы так, чтобы получилась небольшая трещина, и той же мокрой ватой обводят вокруг носика ампулы. После образования круговой (или неполностью круговой) трещины легким ударом пинцета удаляют конец ампулы.

После вскрытия ампулы в нее стерильно наливают 0,2 - 0,3 мл стерильного физиологического раствора. После растворения сухого содержимого ампулы его переносят пастеровской пипеткой на чашку с питательной средой и 48 - 72 часа выращивают при температуре 35 - 37 °C.

В первых пересевах микробы обладают несколько пониженной жизнеспособностью. Для восстановления полной жизнеспособности требуется 2 - 3 пассажа на оптимальных питательных средах. Рекомендуется для работы пользоваться культурой после второго или третьего пересева. В дальнейшем коклюшные культуры сохраняют на среде Борде-Жангу или КУА с 10% крови, пересевая 1 раз в 3 - 4 недели. Можно пользоваться культурой не более 10 пассажа.

СПОСОБЫ ДЛИТЕЛЬНОГО ХРАНЕНИЯ

(без пересева)

1. Хранение культур коклюшного микроба в консервирующей смеси

(рецепт МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского)

Готовят 2 раствора: 1 - 80% раствор глицерина в буферном физиологическом растворе; 2 - сахарозо-желатиновая среда (10% раствор сахарозы и 1% раствор желатина). Смешивают по 2 мл первого и второго растворов в стерильных агглютинационных пробирках, помещают на дно пробирки 3 - 4 петли 3-суточной культуры коклюшного микроба и хранят в морозильной камере холодильника или в глубоко морозильной камере при -30 °C под ватно-марлевой пробкой до 1 года. При высевах берут петлей часть материала со дна пробирки и высевают на среду КУА с 3 - 4% крови, растирая шпателем.

Приготовление буферного физиологического раствора

    pH  7,2 (на 8 л): NaCl - 69 г 200 мг, Na HPO  - 15 г 360 мг, KH PO  - 3

                                            2   4                  2  4

г 520 мг растворяют в 8 л дистиллированной воды, автоклавируют при 0,3 атм.

в течение 30 минут.

Приготовление сахарозо-желатиновой среды (Ca)

1) На водяной бане при 55 °C растворить в 300 мл дистиллированной воды 10 г желатина, 2) растворить в 300 мл дистиллированной воды 100 г сахарозы. Соединить 1 и 2 растворы, довести дистиллированной водой до 1 л, установить pH 7,0 раствором бикарбоната натрия, стерилизовать текучим паром в автоклаве три дня по 1 часу. Хранить разлитым во флаконы.

80% раствор глицерина стерилизуют в автоклаве при 1,8 атм. в течение 30 минут.

2. Хранение культур коклюшного микроба в полужидком КУА

(с кровью и без крови), предложенный в СЭС г. Москвы

Приготовление полужидкого агара КУА. Казеиново-угольный агар готовится по прописи, но агар-агара добавляют 1 г на 1 л среды (0,1%), разливают по пробиркам (в количестве до 8 мл) и стерилизуют при 0,5 атм. 20 мин. В полужидкий агар КУА можно добавить стерильную дефибринированную кровь крупного рогатого скота, лошади из расчета 0,5 - 1 мл на 8 мл среды.

Культуру коклюшного микроба засевают в среду, выдерживают в термостате 3 - 4 дня, а затем без пересева сохраняют в холодильнике или при комнатной температуре в течение 1 мес.

При хранении культуры коклюшного микроба на плотной среде КУА ее пересевают через 10 - 14 дней.

ЖУРНАЛ ПО БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКЕ КОКЛЮША

И ПАРАКОКЛЮША

Продолжение

Продолжение