"Методические указания по определению метилнитрофоса и фенитрооксона в зерне и продуктах переработки зерна хроматоэнзимным и газохроматографическим методом" // Технорма.RU

Утверждаю

Заместитель Главного

государственного

санитарного врача СССР

А.И.ЗАИЧЕНКО

28 января 1980 г. N 2132-80

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

ПО ОПРЕДЕЛЕНИЮ МЕТИЛНИТРОФОСА И ФЕНИТРООКСОНА

В ЗЕРНЕ И ПРОДУКТАХ ПЕРЕРАБОТКИ ЗЕРНА ХРОМАТОЭНЗИМНЫМ

И ГАЗОХРОМАТОГРАФИЧЕСКИМ МЕТОДОМ

Настоящие Методические указания предназначены для санитарно-эпидемиологических станций и научно-исследовательских учреждений Минздрава СССР, а также ветеринарных, агрохимических, контрольно-токсикологических лабораторий Минсельхоза СССР и лабораторий других министерств и ведомств, занимающихся анализом остаточных количеств пестицидов и биопрепаратов в продуктах питания, кормах и внешней среде.

Методические указания апробированы и рекомендованы в качестве официальных группой экспертов при Госкомиссии по химическим средствам борьбы с вредителями, болезнями растений и сорняками при МСХ СССР.

Методические указания согласованы и одобрены отделом перспективного планирования санэпидслужбы ИМПиТМ им. Е.И. Марциновского и лабораторным советом при Главном санитарно-эпидемиологическом управлении Минздрава СССР.

1. Краткая характеристика пестицидов

Метилнитрофос - O,O-диметил-O-(3-метил-4-нитрофенил)-тиофосфат.

S ____ 3

|| // \\

(CH O) P-O- NO C H O NPS

3 2 \____/ 2 9 12 5

---- Мол. масса 277,2.

Синонимы: метатион, сумитион, фенитротион, фолитион, польвадофос, вататион, динатион, новотион, препарат 56600, Байер 41831, агратион-20.

Химически чистый препарат - светлая жидкость со слабым неприятным

запахом. Т - 95 °С при 0,01 мм рт. ст.; плотность 1,308; коэффициент

кип

-6

преломления 1,5505; давление паров при 20 °С - 6 х 10 мм рт. ст.;

летучесть 0,82 мг/куб. м при 20 °С; 2,33 мг/куб. м при 30 °С; 6,11 мг/куб.

м при 40 °С. Растворимость в воде около 30 мг/л, хорошо растворяется в

большинстве органических растворителей.

Препарат гидролизуется в щелочной среде (в 0,1 н NaOH при 30 °С период полураспада 30 минут). При нагревании выше 100 °С изомеризуется и может разлагаться со взрывом. Хранить препарат необходимо в эмалированной или стеклянной таре, железо способствует разложению препарата. Выпускается в форме 30-процентного к.э. и 50-процентного к.э.

ПДК в воздухе рабочей зоны 0,1 мг/куб. м. ДОК в полевых культурах утверждены 0,1 мг/кг. В настоящее время рекомендованы ДОК в зерне 1 мг/кг, муке 0,3 мг/кг, хлебе 0,1 мг/кг. Применяется в качестве контактного инсектицида и акарицида для борьбы с вредителями овощных, технических, плодовых культур, обработки незагруженных зернохранилищ, рекомендован для обработки зерна.

Фенитрооксон - O,O-диметил-O-(3-метил-4-нитрофенил)-фосфат - токсический метаболит метилнитрофоса.

O ____/ 3

|| // \\ C H O NP

(CH O) P-O- NO 9 12 6

3 2 \____/ 2 Относ. мол. масса 261,1.

В чистом виде - светлая жидкость со слабым неприятным запахом.

2. Методика определения метилнитрофоса и фенитрооксона

в зерне, муке, хлебе, отрубях хроматоэнзимным

и газохроматографическим методом

2.1. Основные положения

2.1.1. Принцип метода

Метод основан на извлечении метилнитрофоса (МНФ) и его токсического метаболита фенитрооксона из зерна, муки, хлеба, отрубей смесью органических растворителей (н-гексан - диэтиловый эфир, 7:3), очистке охлажденным ацетоном и параллельном определении их в аликвотных частях пробы методом газожидкостной хроматографии и хроматографии в тонком слое с энзимным проявлением.

Газожидкостной хроматографией (ГЖХ) определение проводится на

хроматографе марки "Цвет" с термоионным детектором (ТИД) с использованием в

качестве неподвижной фазы 5% SE-30 на хроматоне N-AW-ДМСS, газа-носителя -

азота. Этот метод позволяет раздельно определять метилнитрофос (t 3,8) и

уд.

фенитрооксон (t 3 минуты); чувствительность определения каждого - 0,001

уд.

мкг (т.е. 0,02 мг/кг при навеске муки, хлеба, отрубей 20 г). Количественное

определение проводится по высоте пиков. Определению фенитрооксона мешает

присутствие метафоса (t 3,16 мин.). Для идентификации в этом случае

уд.

используется хроматоэнзимный метод.

Тонкослойно-хроматографическое определение с энзимным проявлением

(ТСХЭ) основано на разделении соединений в тонком слое силикагеля КСК с

подвижной фазой н-гексан - ацетон 4:1 и обнаружении их по способности

угнетать холинэстеразу (ХЭ). При этом идентификация их проводится как по

величинам R (R МНФ 0,48; фенитрооксона 0,28), так и по условиям

f f

обработки. Так, обнаружение фенитрооксона, являющегося Р = 0 аналогом

метилнитрофоса, может быть проведено непосредственно после обработки

пластинки субстратом, а для обнаружения МНФ необходима предварительная

активация пестицида на пластинке бромом. Этот метод позволяет раздельно

определять МНФ и фенитрооксон; чувствительность определения МНФ без

активации 0,10 - 0,15 мкг, а с активацией бромом - 0,001 мкг (0,02 мг/кг);

чувствительность определения фенитрооксона без активации 0,001 мкг (0,02

мг/кг). Определению метилнитрофоса мешает метафос (R метафоса 0,47).

2.1.2. Метрологическая характеристика метода:

- диапазон определяемых концентраций 0,5 - 50 мкг МНФ и фенитрооксона в анализируемой пробе;

- предел обнаружения МНФ и фенитрооксона 0,001 мкг (0,025 мг/кг);

- размах варьирования для МНФ и фенитрооксона 80 - 85% методом ГЖХ и 75 - 105% - методом ТСХЭ;

- среднее значение определения стандартных количеств МНФ и фенитрооксона 81% (ГЖХ) и 89% (ТСХЭ);

- стандартное отклонение при ГЖХ - 4,2%, при ТСХЭ - 8,3%;

- относительное стандартное отклонение при ГЖХ - 0,05, при ТСХЭ - 0,09;

- доверительный интервал среднего при р = 0,95 и n = 5 для МНФ и фенитрооксона методом ГЖХ 81 +/- 4,9, методом ТСХЭ - 89 +/- 9,8%.

Сочетание указанных методов позволяет идентифицировать метилнитрофос и фенитрооксон в присутствии близкого к ним по химической структуре пестицида метафоса.

2.2. Реактивы и растворы

Основной стандартный раствор пестицидов (А) - смесь стандартных растворов метилнитрофоса и фенитрооксона по 100 мкг/мл каждого (по 10 мг каждого вещества растворяют в ацетоне в мерной колбе емкостью 100 мл).

Рабочие стандартные растворы готовят разбавлением основного раствора "А".

Раствор "Б" - 0,5 мл раствора "А" доводят в мерной колбе до 100 мл ацетоном (содержание каждого вещества составляет 0,5 мкг/мл).

Раствор "В" - 5 мл раствора "Б" доводят в мерной колбе до 25 мл (содержание каждого вещества 0,1 мкг/мл).

2.2.1. Для экстракции

н-Гексан, х.ч.

Диэтиловый эфир медицинский.

Ацетон, х.ч.

Фильтры бумажные (красная лента).

2.2.2. К методу ГЖХ

Стационарная фаза - метилсиликоновый полимер SE-30 в количестве 5% на хроматоне N-AW-ДМСS, 100 - 120 меш.

Водород.

Азот особой чистоты (содержание O не должно превышать 0,003%).

Стекловата.

2.2.3. К методу ТСХ с энзимным проявлением

Силикагель КСК, раздробленный и просеянный через сито, 100 меш.

Кальций сернокислый (CaSO х 2H O), прокаленный в течение 6 часов при

4 2

160 °С.

Бром.

Индоксилацетат, ч.д.а., ТУ-711-57-69.

Калий железосинеродистый - 0,05 М раствор (1,645 г растворяют в 100 мл дистиллированной воды).

Калий железистосинеродистый - 0,05 М раствор (2,110 г - в 100 мл H O).

Ортофосфорная кислота, х.ч.

Борная кислота, х.ч.

Уксусная кислота, ледяная.

Едкий натр, х.ч.

Буферный раствор pH = 8,69 - готовят раствор смеси ортофосфорной (2,1 мл), уксусной (2,3 мл), борной (2,47 г) кислот и доводят дистиллированной водой до 1 л. Для получения буфера с pH = 8,69 к 100 мл указанного раствора прибавляют 65 мл 0,2 н раствора едкого натра, который готовят растворением 0,800 г NaOH в дистиллированной воде в мерной колбе емкостью 100 мл.

Ферментный препарат получают из печени крупного рогатого скота (свежую, однократно замороженную и сохраняемую в дальнейшем в холодильнике печень можно использовать в течение 6 месяцев). Для приготовления ферментного раствора 1 г печени растирают в ступке с 9 мл буферного раствора и фильтруют через вату. К 1 мл полученной сыворотки прибавляют 4 мл буферного раствора и используют этот раствор для опрыскивания пластинок. Используют свежеприготовленный раствор.

Проявляющий реактив: 10 мг индоксилацетата растворяют в 6 мл этанола, прибавляют 6 мл дистиллированной воды (pH = 8,69), 2 мл раствора железосинеродистого и 2 мл железистосинеродистого калия и хорошо перемешивают. Раствор готовят непосредственно перед опрыскиванием. На пластинку расходуется 3 - 4 мл смеси.

2.3. Приборы и посуда

2.3.1. Для экстракции

Колбы конические плоскодонные с пробками емкостью 250 и 100 мл.

Воронки фильтровальные.

Ротационный испаритель с набором колб емкостью 50 и 100 мл.

Пробирки мерные с пробками емкостью 5 - 10 мл.

2.3.2. Для ГЖХ

Хроматограф марки "Цвет" с термоионным детектором.

Баллон с азотом особой чистоты.

Баллон с водородом.

Колонки стеклянные, длина - 1 м, внутренний диаметр - 3 мм.

Микрошприц на 10 мкл.

2.3.3. Для ТСХЭ

Стеклянные пластинки размером 9 х 12 см.

Камера для хроматографирования.

Пульверизаторы стеклянные.

Камера для опрыскивания.

Компрессор или баллон с азотом или сжатым воздухом для равномерного мелкодисперсного опрыскивания пластинок.

Пипетки на 1 мл, 5 мл, 10 мл.

Мерные колбы емкостью 25 мл, 100 мл.

Микрошприцы на 10 мкл или микропипетки до 0,1 мл для нанесения стандартных растворов и проб.

Термостат СШ-35 с температурой нагрева 37 - 40 °С.

Ступка керамическая.

Эксикатор.

2.4. Подготовка к определению

2.4.1. Подготовка колонок для ГЖХ

Используют готовую фазу SE-30 5% на хроматоне N-AW-ДМСS. Если нет готовой фазы, 0,7 г SE-30 растворяют в небольшом количестве хлористого метилена и приливают в круглодонную колбу со шлифом, в которой находится 14 г носителя (хроматон N-AW-ДМСS), залитого полностью тем же растворителем. Тщательно перемешивают всю массу и выпаривают растворитель на ротационном испарителе досуха. Сухой остаток подсушивают в сушильном шкафу 4 часа при температуре 80 °С. Приготовленный носитель хранят в склянке с притертой пробкой.

Для заполнения колонки один конец ее закрывают стеклянной ватой, а в другой через воронку засыпают носитель. Заполняют колонку постукиванием, закрывают второй конец тампоном из стеклянной ваты.

2.4.2. Приготовление пластинок для ТСХЭ

Для приготовления 12 пластинок берут 35 г силикагеля КСК, 2 г сернокислого кальция, приготовленного как описано выше, и 90 мл дистиллированной воды. Силикагель с гипсом растирают в фарфоровой ступке, прибавляют воду и размешивают до образования однородной массы. 10 г суспензии наносят на пластинку и равномерно распределяют по поверхности. Сушат пластинки строго в горизонтальном положении в течение 18 - 20 часов при комнатной температуре, хранят в эксикаторе.

2.5. Описание определения метилнитрофоса и фенитрооксона в зерне, муке, отрубях, хлебе

2.5.1. Экстракция

Для проведения исследований отбирается средняя проба зерна, муки, отрубей, хлеба весом 1 кг. Из каждой пробы (хлеб измельчают) для анализа методом квартования отбирается три навески по 20 г (из зерна по 50 г). Пробу заливают 50 мл смеси н-гексан - диэтиловой эфир, 7:3, и оставляют на час, периодически встряхивая. Сливают растворитель через фильтр, пробу заливают новой порцией экстрагента и экстрагируют еще час. Объединяют обе порции экстракта, сушат безводным сернокислым натрием в течение 15 мин. и переносят в прибор для отгонки растворителей. Упаривают растворитель до объема ~ 1 мл под вакуумом на ротационном испарителе при температуре бани не более 45 °С, т.к. летучесть МНФ резко увеличивается с повышением температуры. Остатку растворителя дают испариться на воздухе при комнатной температуре. Сухой остаток смывают охлажденным при 0 °С ацетоном и, фильтруя раствор через бумажный фильтр, переносят в мерную пробирку. Оставляют на 15 мин., а затем доводят объем ацетона до 5 мл при комнатной температуре. Из этой пробы проводят определение методом ГЖХ и ТСХЭ.

2.5.2. Метод аналитического определения

2.5.2.1. Газожидкостная хроматография

-10

Условия хроматографирования. Шкала электрометра 2 х 10 А. Скорость

движения ленты самописца 200 мм/час. Температура колонки 190 °С, испарителя

- 220 °С. Расход газа: азота 22 - 24 мл/мин.; водорода 15 - 17 мл/мин.;

воздуха 24 л/час. Вводимый объем 2 - 5 мкл раствора. Линейность

детектирования соблюдается для метилнитрофоса в пределах от 1 до 10 нг, для

фенитрооксона - от 0,5 до 6 нг.

Время удерживания препаратов: метилнитрофос 3,8 мин.; фенитрооксон 3 мин.; время удерживания по метафосу: метилнитрофоса 1,2; фенитрооксона 0,95.

Содержание препаратов в пробе вычисляют по формуле:

C х V х H х 1000

X = ----------------,

V х H х P

а а

где:

X - содержание пестицида в пробе, мг/кг;

C - количество пестицида в стандарте, мкг;

V - объем экстракта, введенного в хроматограф, мкл;

V - общий объем экстракта (5 мл), мл;

H - высота пика пробы, мм;

H - высота пика стандартного раствора, мм;

P - масса пробы, взятой для анализа, г.

2.5.2.2. Тонкослойная хроматография с энзимным проявлением

С целью уменьшения краевого эффекта с хроматографической пластинки снимают с краев вдоль направления движения подвижной фазы (со стороны 12 см) по 2 - 3 мм слоя сорбента. Затем вдоль этой же стороны пластинку разделяют полосами на 4 равные части. На 1-ю и 3-ю полосы на расстоянии 1,5 см от нижнего края наносят по 10 мкл стандартных растворов "Б" и "В", т.е. по 0,001 мкг и 0,005 мкг действующих веществ, на 2-ю и 4-ю - 2 и 10 мкл соответственно пробы. Пластинку с нанесенными растворами помещают в хроматографическую камеру, в которую налита смесь н-гексан - ацетон, 4:1, за 30 мин. до хроматографирования.

Когда фронт растворителя поднимется на 10 см, пластинку вынимают из

камеры и дают растворителю испариться. Пластинку помещают на 1 мин. в

эксикатор, насыщенный парами брома. Затем после удаления избытка брома с

пластинки (~ 60 мин.) ее обрабатывают ферментным раствором и инкубируют в

течение 40 - 50 мин. в насыщенном водными парами термостате при температуре

38 °С (для увлажнения в сушильном шкафу ставят чашку Петри с водой). После

инкубации пластинки опрыскивают проявляющим раствором и помещают в

термостат при 38 °С. Метилнитрофос и фенитрооксон проявляются в течение 10

- 30 мин. в виде белых пятен на голубом фоне, R 0,48 и 0,28

соответственно, чувствительность обнаружения каждого 0,001 мкг.

П-нитрокрезол этим методом не обнаруживается. Фенитрооксон может быть также

обнаружен указанным методом, если исключить стадию активации; в этом случае

чувствительность обнаружения метилнитрофоса на 4 порядка ниже.

Количественное определение проводят путем сравнения площади пятна пробы с наиболее близкой к нему по величине площадью стандарта. Пропорциональная зависимость площади пятна от концентрации соблюдается в пределах от 0,001 мкг до 0,01 мкг. Содержание препарата в пробе (мг/кг) рассчитывают по формуле:

а х S х V х 1000

X = -----------------,

S х V х P

1 1

где:

а - содержание препарата в стандарте, мкг;

S - площадь пятна стандарта, кв. мм;

S - площадь пятна пробы, кв. мм;

V - объем экстракта, нанесенного на пластинку, мкл;

V - общий объем экстракта, мл;

P - масса пробы, взятой для анализа, г.

2.6. Обработка результатов анализа

Обработка результатов анализа, проведенного методом ГЖХ, приведена в п. 2.5.2.1, методом ТСХЭ - в п. 2.5.2.2.

2.7. Настоящие Методические указания разработаны М.А. Клисенко, М.В. Письменной, ВНИИ гигиены и токсикологии пестицидов, полимерных и пластических масс, г. Киев.

3. Требования безопасности

Соблюдаются требования безопасности, обычно рекомендуемые для работы с химическими реактивами.

4. Литература

Н.Н. Мельников. Химия и технология пестицидов. Изд. "Химия", М., 1974, с. 518.