"Методические указания по определению котофора в семенах хлопчатника методом хроматографии в тонком слое" // Технорма.RU

Утверждаю

Заместитель Главного

государственного

санитарного врача СССР

А.И.ЗАИЧЕНКО

19 октября 1979 г. N 2092-79

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

ПО ОПРЕДЕЛЕНИЮ КОТОФОРА В СЕМЕНАХ ХЛОПЧАТНИКА МЕТОДОМ

ХРОМАТОГРАФИИ В ТОНКОМ СЛОЕ

Настоящие Методические указания предназначены для санитарно-эпидемиологических станций и научно-исследовательских учреждений Минздрава СССР, а также ветеринарных, агрохимических, контрольно-токсикологических лабораторий Минсельхоза СССР и лабораторий других министерств и ведомств, занимающихся анализом остаточных количеств пестицидов и биопрепаратов в продуктах питания, кормах и внешней среде.

Методические указания апробированы и рекомендованы в качестве официальных группой экспертов при Госкомиссии по химическим средствам борьбы с вредителями, болезнями растений и сорняками при МСХ СССР.

Методические указания согласованы и одобрены отделом перспективного планирования санэпидслужбы ИМПиТМ им. Е.И. Марциновского и лабораторным советом при Главном санитарно-эпидемиологическом управлении Минздрава СССР.

1. Характеристика анализируемого пестицида

Котофор, 2-этил-тио-4,6-бис-(изопропиламино)-симм-триазин, ГС 16068, санкап.

N / 3

CH -CH -S-/ \\-NH-CH

3 2 ││ │ \

N N CH

\ // CH 3

│ / 3

NH-CH

C H N S.

11 21 5

Молекулярная масса 255,39.

Химически чистый препарат представляет собой белый порошок с температурой плавления 104 - 106 °С. Трудно растворяется в воде (16 мг/л), хорошо - в органических растворителях - хлороформе, ацетоне, метаноле.

Технический препарат котофора представляет собой смачивающийся порошок, содержащий 80% действующего вещества.

Препарат котофор малотоксичен для теплокровных (для крыс ЛД - 4760

мг/кг, для мышей ЛД - 2800 мг/кг), относится к группе веществ умеренно

кумулирующих (k - 2,6).

кум

ДОК котофора в хлопковом масле - 4,5 мг/кг, в жмыхе - 0,38 мг/кг. ПДК котофора в воде составляет 1,0 мг/л, а при поступлении в организм с водой - 5,0 мг/л.

Как и прочие симм-триазины котофор стоек во внешней среде. В почве и воде он сохраняет свою активность от 10 до 14 месяцев в зависимости от нанесенного количества.

2. Методика определения котофора в семенах хлопчатника методом тонкослойной хроматографии

2.1. Основные положения

2.1.1. Принцип метода

Методика основана на хроматографировании котофора в тонком слое пластинок "Силуфол" или тонком слое силикагеля КСК в системе н-гексан - ацетон или четыреххлористый углерод - диэтиловый эфир после экстрактации метанолом и очистки экстракта 1 N соляной кислотой.

2.1.2. Метрологическая характеристика методики

Диапазон определяемых концентраций 0,06 мг/кг - 1,0 мг/кг. Предел

обнаружения 3 мкг в анализируемой пробе, что соответствует 0,06 мг/кг.

Среднее значение определения стандартных количеств С = 84%, число

параллельных определений n = 5, дисперсия 28,6, стандартное отклонение S =

5,348, величина точного измерения (доверительный интервал) ДЕЛЬТА =

0,95-4

5, относительное стандартное отклонение S = 5,9% (по величине точного

измерения). Среднее значение определения стандартных количеств и

доверительный интервал среднего (84 +/- 5%) приведены для 3-х концентраций,

находящихся в определяемом диапазоне концентраций (0,06 мг/кг, 0,1 мг/кг,

0,2 мг/кг).

Определению остаточных количеств котофора в семенах хлопчатника близкие по строению и области применения пестициды (например, прометрин) не мешают.

2.2. Реактивы и материалы

Метиловый спирт, х.ч., ГОСТ 6995-67.

Ацетон, ч.д.а., ГОСТ 2603-71.

н-Гексан, х.ч., ТУ 6-09-3375-73.

Хлороформ, ч.д.а., ГОСТ 3160-51.

Этиловый эфир наркозный.

Углерод четыреххлористый, х.ч., ГОСТ 20288-74.

Натрий сернокислый безводный, х.ч., ГОСТ 4166-66.

Силикагель КСК, ГОСТ 3956-76, ТУ 6-09-2523-72.

Кальций сернокислый, ч.д.а., ГОСТ 3210-66.

Бромфеноловый синий водорастворимый, индикатор, ч.д.а., ТУ 6-09-3719-74.

Серебро азотнокислое, х.ч., ГОСТ 1277-75.

Лимонная кислота, х.ч., ГОСТ 3652-69.

Соляная кислота, х.ч., ГОСТ 3118-67.

Натр едкий, х.ч., ГОСТ 4328-66.

Фильтры бумажные 11,0 см, ТУ 6-09-1678-72.

Пластинки для хроматографии "Силуфол" (ЧССР).

Вата обезжиренная (гигроскопическая).

Вода дистиллированная.

Раствор бромфенолового синего в ацетоне - 0,4%.

Водный раствор азотнокислого серебра - 2%.

Водный раствор лимонной кислоты - 4%.

Водный раствор соляной кислоты - 1 н.

Водный раствор едкого натра - 1 н.

Стандартный раствор котофора, х.ч., в хлороформе - 100 мкг/мл.

2.3. Приборы, аппаратура, посуда

Аппарат для встряхивания жидкости в лабораторной посуде, ТУ 64-1-1081-73.

Шкаф вытяжной химический.

Шкаф сушильный электрический общелабораторного назначения, ТУ 16-531-299-71.

Испаритель ротационный ИР-1М, ТУ 25-11-917-74.

Баня водяная, ТУ 46-22-608-75.

Камера для опрыскивания.

Камера для хроматографирования, ГОСТ 10565-75.

Пульверизатор стеклянный.

Воронка делительная на 250 мл, ГОСТ 8613-75.

Воронки простые конусообразные с коротким стеблем N 5, ГОСТ 8613-75, ТУ 25-11-1061-75.

Колбы лабораторные конические на 250 мл, ГОСТ 10394-72.

Колбы лабораторные круглодонные короткогорлые на 100 мл, ГОСТ 10394-72.

Колбы мерные с коническим шлифом на 100 мл, ГОСТ 1770-74.

Капилляры стеклянные.

Пипетки с делениями на 10 мл, ГОСТ 20292-74.

Микропипетки на 0,1 мл с ценой деления 0,001 мл.

Сито лабораторное с диаметром отверстий 2 мм.

Пластинки стеклянные для нанесения тонкого слоя сорбента 90 х 120 мм.

Колбы мерные с коническим шлифом на 1000 мл, ГОСТ 1770-74.

2.4. Подготовка к определению

2.4.1. Приготовление стандартного и других растворов

Приготовление стандартного раствора. 10 мг котофора х.ч. растворяют в 100 мл хлороформа. В 1 мл такого раствора содержится 100 мкг котофора. Хранят в холодильнике в плотно закрытой склянке. Срок хранения 3 месяца. Химически чистый котофор можно получить из технического препарата. Способ очистки технического препарата, содержащего 80% действующего вещества, заключается в двукратной перекристаллизации из хлороформа. Полнота очистки контролируется по температуре плавления 104 - 106 °С.

Приготовление 1 н раствора соляной кислоты. 86 мл 36-процентной соляной кислоты (d = 1,1789 г/куб. см) доводят в мерной колбе до 1 л дистиллированной водой. Раствор можно приготовить из фиксанала. Хранить в прохладном месте в плотно закрытой склянке. Срок хранения 3 месяца.

Приготовление 1 н раствора едкого натра. 40 г едкого натра растворяют в дистиллированной воде и доводят до 1 л. Рекомендуется использовать свежеприготовленные растворы едкого натра.

Приготовление 0,4-процентного раствора бромфенолового синего в ацетоне. 0,4 г бромфенолового синего растворяют в 125,9 мл ацетона. Хранят в холодильнике в плотно закрытой склянке. Срок хранения 2 недели.

Приготовление 2-процентного водного раствора азотнокислого серебра. 2 г азотнокислого серебра растворяют в 98 мл дистиллированной воды. Хранят в холодильнике в плотно закрытой склянке. Срок хранения 1 неделя.

Приготовление проявляющего реактива N 1. Смешивают равные объемы 0,4-процентного раствора бромфенолового синего в ацетоне и 2-процентного водного раствора азотнокислого серебра. Рекомендуется свежеприготовленная смесь.

Приготовление 4-процентного водного раствора лимонной кислоты (проявляющий реактив N 2). 4 г лимонной кислоты растворяют в 96 мл дистиллированной воды. Хранить в холодильнике в плотно закрытой склянке. Срок хранения 1 месяц.

2.4.2. Приготовление хроматографических пластинок

Тщательно промытую содой, хромовой смесью, дистиллированной водой и высушенную стеклянную пластинку 90 х 120 мм протирают этиловым спиртом или диэтиловым эфиром и покрывают сорбционной массой, приготовляемой из 35 г силикагеля КСК, 2 г кальция сернокислого и 90 мл дистиллированной воды. Силикагель предварительно очищают от примеси. Для чего заливают на 18 - 20 часов разбавленной соляной кислотой (1:1), кислоту сливают, промывают силикагель водой и кипятят 2 - 3 часа с разбавленной азотной кислотой (1:1), промывают водопроводной водой, затем дистиллированной водой до нейтральной реакции промывных вод, сушат в сушильном шкафу 4 - 6 часов при температуре 130 °С. Силикагель дробят и просеивают через сито 100 меш. Хранят в склянке с притертой пробкой.

10 г сорбционной массы равномерно распределяют по всей поверхности пластинки путем ее покачивания. Сушат пластинки при комнатной температуре 18 - 20 часов. Хранят в эксикаторе.

2.4.3. Условия хроматографирования и способ количественного определения

Пробу и стандартные растворы наносят на хроматографическую пластинку так, чтобы размер пятна не превышал 10 - 12 мм. Центр пятна должен находиться на расстоянии 15 мм от нижнего края пластинки. Нанесение пробы на пластинку производится с помощью пипеток с оттянутым концом или капилляров. Стандартные растворы наносятся микропипеткой. Пластинки с нанесенными пробами помещаются в хроматографическую камеру, представляющую собой стеклянный сосуд с притертой стеклянной крышкой, либо в эксикатор. Камера содержит смесь растворителей н-гексана и ацетона (10:3) либо четыреххлористого углерода и диэтилового эфира (4:1). Перед хроматографированием камера насыщается парами системы подвижных растворителей в течение 30 минут. После подъема фронта растворителей на высоту 10 см хроматографирование прекращается. В вытяжном шкафу удаляются пары растворителей. Затем обрабатывают хроматографическую пластинку в камере под вытяжным шкафом с помощью пульверизатора проявляющим реактивом N 1. Пластинку подсушивают на воздухе и обрабатывают проявляющим реактивом N 2.

Котофор обнаруживается на пластинках в виде синих пятен со следующими

величинами R :

┌─────────────────────────────┬──────────────────────────────────┐

│ Система подвижных │ R │

│ растворителей │ f │

│ ├─────────────────┬────────────────┤

│ │ Силикагель │ Силуфол │

├─────────────────────────────┼─────────────────┼────────────────┤

│Гексан + ацетон (10:3) │0,52 +/- 0,01 │0,50 +/- 0,01 │

├─────────────────────────────┼─────────────────┼────────────────┤

│Четыреххлористый углерод + │0,21 +/- 0,01 │0,29 +/- 0,01 │

│диэтиловый эфир (4:1) │ │ │

└─────────────────────────────┴─────────────────┴────────────────┘

Количество котофора в пробе определяют сравнением размеров и интенсивности окраски пятен пестицида на хроматограммах пробы и стандартного раствора.

2.4.4. Отбор пробы

Отбор пробы производится в соответствии с "Правилами отбора проб для анализа пестицидов", рекомендуемыми специалистами СЭВ. Отобранные пробы семян хлопчатника должны содержаться в сухом месте, в укупоренной защищенной от света (стеклянной или полиэтиленовой) таре.

В процессе подготовки к анализу семена хлопчатника необходимо освободить от волокон ваты, очистить от кожуры и измельчить.

2.5. Проведение определения

50 г измельченных семян хлопчатника помещают в коническую колбу на 250 мл, заливают метиловым спиртом до покрытия пробы и оставляют на ночь. Препарат трижды экстрагируют метиловым спиртом порциями по 75 мл. Метаноловые экстракты объединяют и сливают их через слой безводного сернокислого натрия. Упаривают метаноловый экстракт на водяной бане до небольшого объема (0,1 - 0,2 мл). Остатку метилового спирта дают испариться полностью при комнатной температуре. К сухому остатку прибавляют 5 мл 1 н раствора соляной кислоты, тщательно очищая стенки колбы стеклянной палочкой. Смывы сливают в делительную воронку через слой ваты. Колбу еще трижды ополаскивают 1 н раствором соляной кислоты по 5 мл и сливают в ту же делительную воронку. Водный раствор котофора в ионизированной форме дважды промывают в делительной воронке хлороформом и органические вытяжки отбрасывают. Затем в делительную воронку приливают 1 н раствор едкого натра до нейтральной реакции (по индикаторной бумаге). После этого в воронку прибавляют равный объем хлороформа, предварительно насыщенного водой и встряхивают 1 - 2 минуты. Хлороформный экстракт сливают через воронку с безводным сернокислым натрием в колбу для отгонки растворителя. Экстракцию хлороформом повторяют трижды, сливая хлороформ в ту же колбу. Хлороформ отгоняют на водяной бане либо на приборе для отгонки растворителя до небольшого объема (0,1 - 0,2 мл). Этот объем наносят на хроматографическую пластинку, после чего еще трижды ополаскивают колбу хлороформом (небольшими объемами), смывы также наносят на пластинку в центр пятна.

Затем пластинка (силикагелевая или "Силуфол") помещается в хроматографическую камеру. Далее определение проводят в условиях, изложенных в подразделе 2.4.3.

2.6. Обработка результатов

Содержание остатков котофора в анализируемой пробе вычисляют как среднее из двух параллельных определений.

Допустимое расхождение результатов параллельных определений не должно превышать 2,8 х S.

Расчет содержания остаточных количеств котофора проводят по формуле:

Х = -,

где:

Х - содержание котофора в анализируемой пробе, мг/кг;

А - количество котофора, найденное путем сравнения со стандартными количествами, мкг;

Р - масса пробы, г.

3. Требования безопасности

При определении остаточных количеств котофора необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с ядовитыми, взрыво- и огнеопасными веществами.

4. Методика разработана М.С. Петросян, Ю.А. Бунанян, С.Г. Геворкян (Арм. филиал ВНИИГИНТОКС, Ереван).