"Методические указания по гигиенической оценке новых пестицидов" // Технорма.RU

Утверждаю

Заместитель министра

здравоохранения СССР

П.Н.БУРГАСОВ

5 мая 1969 г. N 286-69

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

ПО ГИГИЕНИЧЕСКОЙ ОЦЕНКЕ НОВЫХ ПЕСТИЦИДОВ

ПРЕДИСЛОВИЕ

В 1957 году Главным Государственным санитарным инспектором СССР утверждены "Методические указания по гигиенической и токсикологической оценке новых ядохимикатов, предложенных для внедрения в сельское хозяйство". Этими указаниями свыше 10 лет руководствовались исследователи при выполнении заданий Министерства здравоохранения СССР по гигиенической оценке новых пестицидных препаратов. Они сыграли положительную организующую и научно-методическую роль и способствовали накоплению сопоставимых научных данных для теоретических обобщений.

За прошедший период гигиена применения пестицидов получила большое развитие. В ходе непрерывного количественного и качественного роста научных исследований возникли новые аспекты, новые проблемы, новые методические подходы и приемы. Обобщение достижений гигиены применения пестицидов послужило основанием для создания более совершенных методических указаний.

Настоящие "Методические указания по гигиенической оценке новых пестицидов" разработаны в соответствии с Приказом Министерства здравоохранения СССР N 388 от 08.05.1968, изданным во исполнение соответствующего Постановления Совета Министров СССР.

В первых методических указаниях (1957 г.) предусматривались: исследования токсических свойств новых препаратов, гигиеническая оценка их и гигиеническое нормирование в воздухе рабочей зоны и в продуктах питания.

В отличие от этого в новых методических указаниях предусмотрены также:

а) методы исследований для выяснения возможных эмбриотоксических, гонадотоксических, мутагенных, бластомогенных и аллергенных свойств;

б) методы изучения пестицидных препаратов в общегигиеническом плане, включая изучение циркуляции их в природных условиях и накопления в отдельных объектах внешней среды;

в) принципы и методы гигиенического нормирования пестицидов в пищевых продуктах, воде, атмосферном воздухе и в воздухе рабочей зоны и регламентация их применения.

В настоящие указания включена гигиеническая классификация пестицидов как научная основа гигиенических требований к пестицидным препаратам, которая в первых указаниях была отражена весьма схематично.

В целях ускорения исследований, исключения дублирования и снижения стоимости научных работ в настоящих указаниях, в соответствии с приказом Министерства здравоохранения СССР, изложены научно-организационные вопросы и регламентированы сроки завершения научных исследований.

I. ОБЩАЯ ЧАСТЬ

а) Общие положения

1. Настоящие Методические указания обязательны для исследователей, работающих в лабораториях и на кафедрах институтов, подведомственных Министерствам здравоохранения СССР и союзных республик, Академии медицинских наук СССР, изучающих, по поручению Главного санитарного врача СССР, новые препараты, предложенные в качестве химических средств борьбы с вредителями и болезнями растений и животных, переносчиками болезней, бытовыми паразитами, сорной растительностью на полях и в водоемах.

2. Задания Главного санитарного врача СССР по изучению конкретных препаратов и условий их применения являются обязательными для перечисленных в пункте 1 научных учреждений. Исследования проводятся в целях вооружения органов санитарного надзора СССР объективными и научными данными для решения вопроса о допустимости внедрения того или иного препарата в народное хозяйство и установления гигиенических регламентов его применения.

3. Изучение новых пестицидных препаратов является первой по времени научной стадией предупредительного санитарного надзора за внедрением пестицидных препаратов, а исследователь выполняет функцию ученого-эксперта Главного санитарного врача СССР.

4. Выступая в роли эксперта, исследователь несет ответственность за качество и срок исследований, за научную достоверность полученных данных и за обоснованность окончательных заключений и рекомендаций.

5. Главные задачи исследователей - выявление возможных патогенных свойств изучаемого вещества, определение его количеств, способных вызвать тот или иной патологический эффект и, что самое главное, научное прогнозирование реальной опасности для здоровья населения, с учетом свойств препарата и разнообразных условий его применения.

6. Планы изучения новых пестицидных препаратов утверждаются Главным санитарным врачом - заместителем министра здравоохранения СССР - на каждый год.

7. Директора научно-исследовательских институтов и ректоры медицинских институтов несут ответственность за высококачественное проведение исследований в установленный срок. Утвержденная для института тематика обеспечивается штатами, лабораторным оснащением, лабораторными животными, реактивами и другими средствами, в первую очередь, в пределах общей сметы расходов института.

8. Отчеты по исследованиям, заключения и гигиенические рекомендации представляются в головной институт (ВНИИГИНТОКС) в установленные сроки.

9. Заключения по каждому препарату рассматривает Комитет по изучению и регламентации ядохимикатов Главного санэпидуправления Минздрава СССР, работающий на базе головного института, с обязательным участием заинтересованных учреждений, ведомств и организаций, и представляет свое решение на утверждение Главному санитарному врачу СССР.

10. Предусмотренные настоящими Методическими указаниями методы исследований являются обязательным минимумом для всех исследователей. Однако они не являются препятствием для использования других и создания новых эффективных методов исследований.

б) Порядок представления и перечень материалов,

необходимых для включения нового препарата в план

научно-гигиенических исследований

1. Министерства, ведомства и научные учреждения, заинтересованные во внедрении в отдельные отрасли народного хозяйства и в быт населения пестицидных препаратов, синтезированных научными учреждениями СССР или впервые закупаемых в других странах, обязаны возбудить ходатайство перед Главным санитарным врачом СССР о включении препарата в план гигиенического изучения и о разрешении на широкие производственные испытания его.

2. Ходатайство о внедрении препаратов, предназначенных для сельского хозяйства (полеводства и животноводства), возбуждается через Государственную комиссию по химическим средствам защиты растений при Министерстве сельского хозяйства СССР.

3. Ходатайство о препаратах, предназначенных для лесного хозяйства, борьбы с зарастанием оросительных систем и каналов, с переносчиками болезней и бытовыми насекомыми, а также для продажи населению, возбуждают соответствующие Министерства и ведомства непосредственно перед Главным санитарным врачом СССР.

Разрешение на применение препарата, выданное одному ведомству, не дает права применять его другим ведомствам. Разрешение на применение препарата для одних целей не дает права применять его для других целей.

4. За производственные испытания или применение препаратов без разрешения Главного санитарного врача СССР виновные несут ответственность в соответствии с действующим санитарным законодательством.

5. Министерства и ведомства, заинтересованные в изучении новых препаратов, одновременно с обоснованным письменным ходатайством представляют следующие материалы:

- Наименования препаратов (химическое, товарное, синонимы), структурную формулу действующего начала и физико-химические свойства (стойкость в естественных условиях, летучесть, растворимость и др.), какими средствами могут быть нейтрализованы.

- Назначение препарата (против каких вредителей и возбудителей болезней и на каких объектах предполагается применять), с каким уже используемым препаратом сходно его действие и в чем его преимущество. Сравнительная токсичность для насекомых в сопоставлении с уже используемыми для тех же целей препаратами.

- Перспектива производства или закупки препаратов за рубежом (в тоннах), товарные формы, характеристика наполнителя или растворителя, предполагаемые способы, методы и календарные сроки применения, нормы расхода, концентрации, кратность обработки растений, животных и других объектов.

- Химические методы определения микроколичеств вещества в продуктах растениеводства и животноводства, в воде, воздухе, почве.

6. Для заключения договора с иностранными торговыми организациями на закупку препаратов предварительно требовать:

а) сведения о токсических и других патогенных свойствах закупаемого вещества;

б) подробное изложение воспроизводимых и чувствительных методов химического определения микроколичеств препаратов в объектах внешней среды;

в) сведения об остаточных количествах его в пищевых продуктах в мг/кг.

7. Перечисленные выше сведения о новом препарате рассматриваются Комитетом по изучению и регламентации ядохимикатов. Заключение Комитета о включении препарата в план гигиенических исследований для выяснения возможности широких производственных испытаний и его внедрения утверждается Главным санитарным врачом СССР.

8. После решения о включении препарата в план исследований ставят в известность заинтересованную организацию, которая в течение одного месяца с момента уведомления должна направить в соответствующий институт технический или чистый препарат, а также, при необходимости, товарные формы его в количествах, необходимых для проведения исследований, и одновременно уведомить об этом головной институт (ВНИИГИНТОКС).

9. Сельскохозяйственные и другие научные учреждения, изучающие эффективность нового препарата в производственных условиях, обязаны известить ВНИИГИНТОКС и институт - исполнитель темы о календарных сроках работ и содействовать гигиеническим научным учреждениям в проведении исследований по изучению условий применения нового препарата. Продукты от обработанных растений, животных и другие объекты (воду, почву и др.) направлять в институты-исполнители в указанные ими сроки для соответствующих исследований.

в) Порядок и сроки составления планов

научно-исследовательских работ, отчетность и контроль

1. Комитет по изучению и регламентации ядохимикатов Главного санэпидуправления СССР рассматривает вопросы о включении отдельных препаратов в план исследований и составляет список новых пестицидных препаратов, подлежащих изучению, определяет институты-исполнители и конкретные задания и сроки, учитывая наличие подготовленных кадров, опыта и оснащения. Указанный список-план ежегодно, не позднее 15 июня, направляется Главному санитарному врачу СССР на утверждение.

2. Планирование, координацию и контроль за ходом выполнения научно-исследовательских работ осуществляет проблемная комиссия Ученого совета Минздрава СССР "Научные основы гигиены и токсикологии пестицидов".

3. Проблемная комиссия, кроме тем, предусмотренных списком новых пестицидных препаратов, намечает темы по изучению механизма действия уже применяемых пестицидов и изысканию антидотных средств, изучению циркуляции и судьбы пестицидов во внешней среде, по гигиенической оценке новых машин и аппаратов, по совершенствованию методов химического анализа пестицидов в объектах внешней среды и другие, диктуемые потребностями практики, темы.

Исследования по изучению новых пестицидных препаратов проводятся в точном соответствии с настоящими Методическими указаниями, а при выполнении вышеперечисленных и других тем применяются адекватные методы, позволяющие решать поставленные задачи.

4. Проблемная комиссия составляет проект плана научных исследований на следующий год и направляет его не позднее 1 июля институтам-исполнителям.

5. Институты-исполнители не позднее 1 октября должны направить в проблемную комиссию конкретный план научных исследований по обязательной и рекомендуемой им тематике. Если институт-исполнитель считает, что не имеет возможности выполнить отдельные темы, то извещает об этом проблемную комиссию и обосновывает причины. Проблемная комиссия может признать причины необоснованными и в этом случае тематика обязательна к выполнению.

6. Краткие информации о выполнении тем представляются институтом-исполнителем в проблемную комиссию ежеквартально, а к 15 января представляется полный отчет за предыдущий год.

7. Контроль за выполнением плана научно-исследовательских работ осуществляется головным институтом с привлечением членов проблемной комиссии и опытных научных сотрудников других институтов.

г) Сроки изучения токсических и других вредных свойств

новых пестицидных препаратов и их гигиенической оценки

1. Создание новых пестицидных препаратов направлено на повышение валовых сборов урожая и продуктивности животноводства. Поэтому внедрение новых эффективных препаратов должно осуществляться в возможно короткие сроки. В связи с необходимостью предварительной, до внедрения препарата, разработки гигиенических нормативов и регламентов применения изучение новых пестицидных препаратов должно проводиться в научно обоснованные, строго регламентированные сроки.

2. Исследователи, изучающие патогенные свойства новых пестицидов и разрабатывающие гигиенические регламенты их применения, обязаны:

- составить научно обоснованное гигиеническое заключение о возможности и условиях использования изучаемого вещества в народном хозяйстве;

- апробировать способы и методы применения новых препаратов и разработать гигиенические регламенты и санитарные правила производства работ;

- разработать гигиенические нормативы для пищевых продуктов растительного и животного происхождения, воды, воздуха рабочей зоны и атмосферного воздуха, установить "сроки ожидания" для плодоносящих растений;

- разработать инструкции по гигиене труда и санитарному контролю за пищевыми продуктами, водоисточниками, атмосферным воздухом.

3. Решение вопроса о допустимости внедрения нового препарата в народное хозяйство должно гарантировать безопасность здоровья населения, поэтому в эксперименте выясняется, может ли он порождать различные патологические эффекты.

Результаты экспериментальных исследований, в сопоставлении с данными по изучению гигиены применения нового пестицида, составляют основу для разработки гигиенических нормативов и профилактических мероприятий, гарантирующих безопасность здоровья населения.

4. В соответствии с изложенными выше требованиями устанавливаются следующие сроки исследований:

- определение ЛД при введении вещества в желудок и нанесении на кожу

- 2 месяца;

- определение ЛК - 4 месяца;

- установление пороговой дозы при однократном введении в желудок - 3 месяца;

- определение коэффициента кумуляции при ежедневном введении препарата - 4 месяца;

- установление пороговой дозы при введении в желудок в хроническом эксперименте - 10 - 12 месяцев;

- то же, при ингаляционном пути поступления - 4 - 6 месяцев;

- выявление эмбриотоксического действия - 1 год;

- выявление гонадотоксического действия - 1 год;

- выявление мутагенного действия - 1 год;

- выявление канцерогенного действия - 2 - 2,5 года;

- выявление аллергенного действия - 1 год;

- гигиеническое нормирование во всех средах - 2 года.

Общий срок исследований - 2 - 2,5 года.

Примечание: Исследования для выяснения эмбриотоксического, гонадотоксического, мутагенного, канцерогенного и аллергенного действия осуществляются только при наличии теоретических предпосылок, с учетом химического строения вещества, физико-химических свойств, а также по аналогии с изученными веществами данного класса.

В некоторых случаях (при выявлении вредных эффектов) потребуется удлинение сроков исследований, для чего необходимо специальное разрешение Главного санитарного врача СССР.

5. При проведении перечисленных выше исследований в условиях острого и хронического эксперимента дается тщательное описание клинической картины интоксикации животных, в котором особое внимание обращается на ведущие симптомы, проводятся исследования крови, патоморфологические, гистохимические и другие исследования. При подозрении на избирательную органотоксичность проводятся специальные углубленные исследования для выяснения действия препарата на наиболее уязвимую систему организма или отдельный орган. Все исследования, перечисленные в п. 5, проводятся параллельно с исследованиями, указанными в п. 4, преимущественно на одних и тех же животных.

6. После получения результатов токсикологических исследований разрабатываются и устанавливаются гигиенические нормативы в пищевых продуктах, воде, воздухе рабочей зоны и атмосферном воздухе по методам, указанным ниже.

Изучение фактического загрязнения объектов внешней среды (продуктов растениеводства, воды, воздуха, почвы) при производственных испытаниях нового препарата проводится в два сезона (май - октябрь).

7. Все исследования, перечисленные в пунктах 4, 5 и 6, проводятся группой научных сотрудников и вспомогательного персонала, выделяемой руководством института, во главе с ответственными руководителями тем. Количество исполнителей должно быть достаточным для обязательного завершения всех работ в установленный срок.

д) Планирование институтам-исполнителям конкретных

заданий по изучению новых пестицидных препаратов

1. В зависимости от профиля института (кафедры) проблемная комиссия определяет конкретные задания по изучению новых пестицидных препаратов. Задание может предусматривать полный объем исследований или изучение отдельных вопросов.

2. Изучение одного или нескольких препаратов в объеме, предусмотренном настоящими указаниями, поручается институтам общегигиенического профиля (ВНИИГИНТОКСу, Московскому институту им. Эрисмана, Саратовскому институту сельской гигиены, Узбекскому санитарному институту и другим республиканским общегигиеническим институтам). Они разрабатывают гигиенические нормативы пестицидов для всех сред и регламенты их применения.

3. При формировании тематики четко определяются задания профильным институтам по изучению следующих вопросов:

- изучение токсического, эмбриотоксического и гонадотоксического действия препарата;

- изучение мутагенных свойств;

- изучение бластомогенных свойств;

- изучение аллергенных свойств;

- исследования по гигиене труда при применении препарата и гигиеническое нормирование его в воздухе рабочей зоны;

- изучение накопления препарата в пищевых продуктах и научное обоснование допустимых остаточных количеств; регламентирование условий применения;

- изучение закономерностей поступления и накопления препарата в открытых водоемах и гигиеническое нормирование в воде;

- изучение закономерностей распространения препарата в атмосферном воздухе и гигиеническое нормирование.

Каждое или несколько из перечисленных выше заданий поручается только одному учреждению.

4. Институты - исполнители тем, выполняющие задания по изучению токсических или других патогенных свойств препаратов, в отчетах, представляемых головному институту, сообщают подробные сведения о параметрах токсичности вещества и сведения о его дозах или концентрациях, вызывающих те или иные патологические эффекты. Головной институт направляет копии отчетов в институты, осуществляющие гигиеническое нормирование, которые используют эти данные в сочетании с результатами собственных гигиенических и дополнительных исследований для научного обоснования гигиенических нормативов в соответствующей среде.

5. При одновременном гигиеническом нормировании во всех средах, осуществляемом в общегигиенических институтах, одни и те же исследования, касающиеся токсичности и других патогенных свойств, не повторяются.

Специальные исследования в соответствии со значимостью того или иного компонента внешней среды проводятся профильными специалистами.

6. Все предложения по гигиеническому нормированию рассматриваются Комитетом по изучению и регламентации ядохимикатов.

Разработанные гигиенические нормативы для всех сред в суммарном исчислении сопоставляются с максимально допустимой дозой вещества для человека и при необходимости в них вносятся коррективы.

е) Гигиенические требования к пестицидным препаратам

1. К новым химическим веществам, предложенным в качестве пестицидов, предъявляются следующие требования:

а) производственная эффективность - они должны уничтожать вредных насекомых, возбудителей болезней растений, сорную растительность и не оказывать влияния на полезную фауну и флору;

б) экономическая эффективность - затраты на применение нового химического средства защиты растений должны быть меньшими, чем стоимость дополнительно получаемой сельскохозяйственной продукции;

в) удовлетворять гигиеническим требованиям - должны быть менее токсичными и менее опасными для здоровья населения по сравнению с применяемыми препаратами того же назначения.

Свое отношение к новому препарату гигиенист обязан формировать, учитывая все перечисленные выше требования. Соображения экономической эффективности не позволяют использовать химически чистые соединения, поэтому пестицидные препараты всегда содержат примеси, которые в отдельных случаях более токсичны, чем действующее начало. В связи с этим необходимо получить сведения о примесях и знать их свойства. Если предлагаемое вещество по производственной эффективности не имеет преимуществ перед уже применяемыми веществами того же назначения, а по токсическим свойствам хуже их, то гигиенист обязан дать отрицательное заключение.

2. Многолетний опыт работы Комитета по изучению и регламентации ядохимикатов и данные об отравлениях ими в СССР и за рубежом позволили сформулировать гигиенические требования к пестицидным препаратам:

- в народное хозяйство должны, как правило, внедряться малотоксичные для теплокровных животных и человека препараты. Исключения составляют зооциды и протравители семян, пока не будут найдены для указанных целей малотоксичные соединения;

- вещества стойкие и не разлагающиеся в естественных условиях на нетоксичные компоненты в течение двух лет нельзя допускать к внедрению;

- нельзя внедрять также препараты с резко выраженной кумуляцией;

- не должны внедряться вещества, которые могут привести к отрицательным отдаленным последствиям и обладающие резко выраженными аллергенными свойствами.

Для целей гигиенического отбора пестицидных препаратов была разработана гигиеническая классификация пестицидов, получившая одобрение комитета ВОЗ и III Всемирного конгресса по гигиене села.

Ниже приводится гигиеническая классификация пестицидов по основным критериям вредности.

Гигиеническая классификация пестицидов

I. По токсичности при введении в желудок:

1. Сильнодействующие ядовитые вещества - ЛД - до 50 мг/кг.

2. Высокотоксичные - ЛД - 50 - 200 мг/кг.

3. Средней токсичности - ЛД - 200 - 1000 мг/кг.

4. Малотоксичные - ЛД - более 1000 мг/кг.

II. По кожно-резорбтивной токсичности:

1. Резко выраженная - ЛД - меньше 300 мг/кг,

кожно-оральный коэффициент -

меньше 1

2. Выраженная - ЛД - 300 - 1000 мг/кг,

кожно-оральный коэффициент -

1 - 3

3. Слабо выраженная - ЛД - более 1000 мг/кг,

кожно-оральный коэффициент -

больше 3.

III. По степени летучести:

1. Очень опасное вещество - насыщающая концентрация

больше или равна токсической

2. Опасное - насыщающая концентрация

больше пороговой

3. Малоопасное - насыщающая концентрация не

оказывает порогового

действия.

IV. По кумуляции:

1. Сверхкумуляция - коэффициент кумуляции - меньше 1

2. Выраженная - коэффициент кумуляции - 1 - 3

3. Умеренная - коэффициент кумуляции - 3 - 5

4. Слабо выраженная - коэффициент кумуляции - более 5.

V. По стойкости:

1. Очень стойкие - время разложения на - свыше 2 лет

нетоксичные компоненты

2. Стойкие - время разложения на - 0,5 - 1 год

нетоксичные компоненты

3. Умеренно стойкие - время разложения на - 1 - 6 мес.

нетоксичные компоненты

4. Малостойкие - время разложения на - в течение 1 мес.

нетоксичные компоненты

Если при изучении патогенных свойств не установлена реальная опасность канцерогенности, мутагенности, аллергенности, эмбриотоксичности, ориентируются на приведенную классификацию; если же установлена реальная опасность по указанным показателям, то дается отрицательное заключение.

Окончательные заключения по препаратам составляют гигиенисты на основании данных о физико-химических, патогенных свойствах и результатов гигиенических исследований.

Если вещество по одному из показателей относится к первой группе классификации, то оно не подлежит внедрению в практику, и в таком случае, как правило, отпадает необходимость в дальнейших гигиенических исследованиях. Сведения направляют в Комитет по изучению и регламентации ядохимикатов для принятия окончательного решения.

При заключении о возможности внедрения препарата разрабатываются гигиенические нормативы для каждого из отдельных объектов внешней среды, с учетом суммы нормативов для всех объектов и гарантии безопасности для человека.

Гигиенические заключения по препаратам, регламенты их применения доставляются в соответствии с рекомендациями, изложенными ниже в настоящих Методических указаниях.

Гигиенические нормативы допустимого содержания пестицидов в объектах внешней среды и регламенты условий применения апробирует Комитет по изучению и регламентации ядохимикатов и представляет на утверждение в Главное санэпидуправление МЗ СССР.

II. ИЗУЧЕНИЕ ТОКСИЧЕСКИХ И ДРУГИХ ВРЕДНЫХ СВОЙСТВ

ПЕСТИЦИДОВ

Задачей исследований является определение степени опасности нового пестицида при однократном и многократном поступлении в организм.

Исследования проводятся на лабораторных животных - белых мышах, белых крысах, кроликах, кошках, а при специальных показаниях - на морских свинках, собаках, а также других животных.

Изучение нового вещества следует проводить не менее чем на трех видах лабораторных животных (один из них мясоедный). Перед началом острого эксперимента животные выдерживаются на карантине не менее 7 дней, а хронического - не менее 14 дней. После карантина производятся соответствующие исследования, результаты которых являются исходными.

В острый опыт берутся животные обоего пола, здоровые по внешнему виду, с нормальным весом (см. табл. 1) и температурой. Для хронического опыта отбираются животные без особых отклонений в составе крови и мочи, а также других исследуемых показателях. Животных содержат на кормовом режиме согласно существующим нормативам (Приложение 1).

Таблица 1

СРЕДНИЙ ВЕС ЖИВОТНЫХ (В ГРАММАХ)

┌───┬─────────────────┬─────────────────┬────────────────────────┐

│ N │Название животных│Для острых опытов│ Для хронических опытов │

│п/п│ │ │ │

├───┼─────────────────┼─────────────────┼────────────────────────┤

│1. │Белые мыши │18 - 25 │15 - 18 │

│2. │Крысы │150 - 200 │80 - 100 │

│3. │Кошки │2000 - 3000 │1500 - 2000 │

│4. │Кролики │2000 - 3000 │1500 - 2000 │

└───┴─────────────────┴─────────────────┴────────────────────────┘

1. ИССЛЕДОВАНИЕ ТОКСИЧНОСТИ ПЕСТИЦИДОВ В ОСТРОМ ЭКСПЕРИМЕНТЕ

а) Исследование токсичности при введении в желудок

При однократном введении препарата в желудок определяют параметры токсичности и изучают симптоматику острого отравления.

Изучаемый препарат может быть введен в желудок в растворе или с пищей. В виде растворов вводят пестициды, растворимые в воде или в масле. Нерастворимые вещества вводят в желудок в виде эмульсий или суспензий. В качестве эмульгаторов используют ОП-7, ОП-10, молоко, яичный желток.

Эмульгатор ОП-7 или ОП-10 смешивают с навеской исследуемого вещества в определенном соотношении (например, 1:1, 1:5, 1:10). К смеси по каплям приливают воду, тщательно растирая полученную массу. Количество прибавленной воды зависит от того, какую концентрацию необходимо получить.

Приготовление эмульсии из яичного желтка: растительное масло эмульгируют яичным желтком с последующим разбавлением до нужной концентрации водой или физиологическим раствором. На 5 г растительного масла или масляного раствора берут 7,5 г яичного желтка, тщательно освобожденного от белка. Желток предварительно растирают в фарфоровой ступке, куда по каплям при постоянном помешивании прибавляют масляный раствор исследуемого вещества (если вещество не растворимо в масле, то его предварительно тщательно растирают с желтком, к которому в дальнейшем по каплям прибавляют чистое растительное масло).

После получения сметанообразной массы (без капелек жира на поверхности), издающей характерный треск при помешивании, медленно, по каплям, доливают физиологический раствор.

Как показали контрольные опыты, внутривенное введение эмульсии (без яда) не вызывает изменений в состоянии животных и не оказывает заметного влияния на дыхание, кровяное давление и т.п.

Следует учитывать, что эмульгатор может ускорить или замедлить всасывание изучаемого вещества и усилить или ослабить его токсичность. Чтобы избежать ошибок при оценке токсических свойств препарата, животным контрольной группы необходимо вводить в соответствующих количествах эмульсию, содержащую только эмульгатор.

Исследуемые вещества вводят в желудок натощак мышам, крысам и морским свинкам при помощи шприца с металлическим зондом (игла с тупым концом); кроликам, кошкам и собакам - при помощи резинового зонда. Объем жидкости, вводимой в желудок, должен в зависимости от веса животных составлять: максимально для мышей - 0,5 - 1 мл, для крыс - 3 - 5 мл, для морских свинок и кроликов - соответственно 10 - 30 мл, кошек и щенков - 40 мл (если не представляется возможным в допустимом объеме ввести необходимую дозу, то рекомендуется ее вводить в два приема с интервалом в 1 час).

При скармливании пестицида с пищей необходимо следить за тем, чтобы вся порция пищи, содержащая препарат, была съедена. Поить и кормить животных после введения препарата в желудок следует не ранее чем через 3 - 4 часа.

Учитывают внешний вид и поведение животных, состояние шерстного покрова и видимых слизистых оболочек, отношение к пище, подвижность, ритм и частоту дыхания. Обращают внимание на время возникновения и характер интоксикации, оценивают ее тяжесть, обратимость, определяют срок гибели животных.

В процессе изучения острой токсичности исследования функциональных показателей начинаются в первые часы после введения препарата и в дальнейшем проводятся в динамике в течение 2 - 3 недель.

Для вычисления среднесмертельной дозы (ЛД ) нескольким группам

животных (не менее 5) вводят исследуемое вещество в различных количествах

из расчета на кг веса животного (крыс - не менее 6, мышей - не менее 10 на

каждую испытуемую дозу). Устанавливают дозы, вызывающие гибель всех

животных, части животных, и дозы, при введении которых смертельные исходы

не наблюдаются.

На основании полученных данных при помощи статистической обработки

вычисляют величины ЛД (см. Приложение 2).

Наряду со смертельной дозой, в опытах с однократным введением вещества

устанавливают пороговую дозу. Пороговой дозой называют минимальную дозу,

при введении которой в организме возникает небольшой, но статистически

достоверный сдвиг какого-либо чувствительного интегрального или

специфического показателя. При альтернативной оценке речь может идти о

наличии каких-либо сдвигов у 50% подопытных животных и тогда расчет этой

дозы проводится аналогично тому, как рассчитывается ЛД . При градированной

оценке определяется доза, вызывающая изменение каких-либо показателей на

50% или 25% (например, понижение активности холинэстеразы в среднем у всех

животных).

После того как определены величины ЛД и пороговой дозы должна быть

определена зона токсического действия, представляющая собой отношение ЛД

к пороговой дозе. Чем уже зона токсического действия, тем опаснее вещество.

Особенно опасны вещества, для которых отношения этих доз меньше 6 - очень

узкая зона, от 6 до 24 - узкая зона, более 24 - широкая зона токсического

действия.

При оценке опасности учитывается абсолютная токсичность вещества.

Параллельно с постановкой опытов по определению острой токсичности проводится эксперимент по выявлению аллергенных свойств путем воспроизведения анафилактического шока (см. гл. "Изучение аллергенных свойств химических веществ").

б) Изучение токсичности при нанесении на кожу <1>

--------------------------------

<1> Раздел написан в соответствии с методическими указаниями по исследованию кожно-резорбтивного действия химических веществ в эксперименте, ж. "Гигиена труда и профессиональные заболевания", 1964, N 9.

При нанесении пестицида на кожу преследуют цель выяснить, обладает ли вещество кожно-резорбтивным и местно-раздражающим действием.

Кроме того, оценивается местное действие при нанесении на слизистые оболочки глаз. Ориентировочная оценка кожно-резорбтивного действия производится на мышах или крысах (по 6 животных в группе). Наиболее простым приемом является погружение хвоста животного на 2/3 его длины в пробирку с исследуемой жидкостью. Пробирки помещают в водяную баню с температурой 28 - 30 °С. Из твердых и нерастворимых веществ предварительно готовят растворы или эмульсии.

Животных фиксируют в специальных станках. Во избежание поступления вещества через дыхательные пути опыты проводят под вытяжным шкафом, голова животного должна быть вне шкафа. Время экспозиции 4 часа. После окончания эксперимента кожу хвоста обмывают теплой водой с мылом.

О кожно-резорбтивном действии судят по смертельным исходам, времени появления и степени выраженности признаков интоксикации, изменению веса тела. Срок наблюдения за животными 3 недели.

Если на I этапе исследования кожно-резорбтивное действие не выявлено, дальнейшее изучение прекращается. При обнаружении токсического эффекта переходят ко II этапу - количественной оценке. Для количественной оценки кожно-резорбтивного действия наиболее удобны крысы и кролики.

Перед опытом животных фиксируют и на соответствующих участках выстригают шерсть (крысам - на животе, размером 2 х 2 см, кроликам - на спине, сбоку от позвоночника, 4 х 5 см). При исследовании высокотоксичных соединений площадь участка уменьшается, малотоксичных - увеличивается.

Для удаления шерсти можно использовать электрическую машинку для бритья и вогнутые ножницы. Исследуемое вещество наносится в строго дозированных количествах из расчета на 1 кг веса тела и 1 кв. см поверхности кожи.

Жидкие вещества наносятся на кожу в неразбавленном виде, твердые вещества - в концентрированных растворах, суспензиях, эмульсиях или мазях. При работе с летучими веществами на кожу животного при помощи клея (БФ-2, клеола и др.) приклеивают короткую (1 - 2 см) стеклянную трубочку диаметром 1,5 см для крыс и 2,5 для кроликов. Через верхнее отверстие трубки на кожу наносят исследуемое вещество и закрывают его пробкой. Опыты проводятся под вытяжным шкафом.

В фиксированном состоянии животные находятся не более 4 часов. Не следует смывать препарат с кожи, если это не вызвано специальными целями.

О токсическом действии вещества свидетельствует клиническая картина интоксикации. Пороговую дозу устанавливают по специфическим показателям. О пороговой дозе веществ, механизм действия которых не выяснен, судят по изменению интегральных показателей.

Для пестицидов, вызывающих гибель животных, вычисляется ЛД . Ставят

опыт аналогично тому, как при введении в желудок. Статистическая обработка

по Прозоровскому (Приложение 2).

Отношение ЛД при накожной аппликации к ЛД при введении в желудок

50 50

называют кожно-оральным коэффициентом:

ЛД на кожу

К = --------------.

к/о ЛД в желудок

Величина этого коэффициента характеризует степень всасывания вещества через кожу и служит критерием опасности кожно-резорбтивного действия.

Местное действие веществ исследуют на морских свинках и кроликах, учитывая концентрацию, в которой препарат наносят на кожу.

Важно испытывать влияние концентраций, которые могут создаваться на промышленных предприятиях и в сельском хозяйстве. Местное действие изучают при однократном и многократном нанесении препаратов на кожу.

О наличии у пестицидов раздражающих свойств судят по появлению на месте аппликации гиперемии, отека, утолщения кожной складки и расчесов. О болезненности участка можно судить по реакции животного на пальпацию очага поражения. Для объективной регистрации изменений на месте аппликации микрометром типа МК определяют толщину кожной складки. В начальном периоде развития дерматита рекомендуется измерение кожной температуры. Признаки поверхностного дерматита без образования корок и трещин свидетельствует о слабом местном действии. На выраженный дерматит указывает образование корок и пояса кожных изменений вокруг места нанесения препарата (отек, эритема, трещины, выпадание волос, пигментации и пр.). Сильное местное действие характеризуется образованием геморрагических корок, после отторжения которых остаются глубокие язвы и трещины, резкий отек и гиперемия.

При исследовании местного действия на слизистые оболочки изучаемое вещество вносят однократно в конъюнктивальный мешок глаза кролика. Жидкость в количестве 1 - 2 кап., твердые вещества - не более 50 мг (дисперсность частиц не должна превышать 10 микрон). При внесении оттягивают внутренний угол конъюнктивального мешка, а затем в течение 1 мин. прижимают слезно-носовой канал. Отмечают появление и выраженность гиперемии, отечность, инъекцию сосудов склеры и роговицы, ширину зрачка. Обращают внимание на состояние век. Оценку действия на слизистую оболочку производят по характеру конъюнктивита (поверхностный, глубокий), кератита. Ожоги слизистой могут быть I, II и III степени.

в) Изучение токсичности при ингаляционном воздействии

Изучение токсичности пестицидов при ингаляционном пути поступления необходимо для выявления возможности отравления через дыхательные пути. Определяются смертельные и пороговые концентрации.

Пороговые концентрации устанавливают не менее чем на 2 видах наиболее чувствительных к данному пестициду животных.

Через дыхательные пути пестициды могут попадать в организм в виде паров, в пылевидном или в капельно-жидком состоянии. В соответствии с этим в камерах изучают токсичность пестицидов в парообразной, пылевидной или капельно-жидкой форме.

Простейшая форма ингаляционного опыта - статическая затравка в эксикаторе или камере. На дно эксикатора помешают сосуд с исследуемым пестицидом, а на проволочную сетку - мышей. Экспозиция затравки от 1 до 4 часов в зависимости от предполагаемой токсичности препарата.

При проведении статической затравки следует следить за тем, чтобы количество углекислоты, накапливающейся в эксикаторе при дыхании животных, не превышало допустимой нормы (0,07 об.%).

Статическая затравка дает только ориентировочное представление о токсичности соединения. Углубленное изучение его токсических свойств проводится в специальных камерах для динамической затравки.

Принцип устройства камер <1> для динамической затравки состоит в том, что вещество непрерывно протягивается через камеру, где находятся экспериментальные животные. Экспозиция опыта - 4 - 6 часов. Для подачи в зону дыхания животных воздуха с препаратом, в соответствии с его агрегатным состоянием, в паровых камерах используют компрессор, в пылевых камерах - пылеподатчик, в аэрозольных - специальную форсунку для распыления жидкости.

--------------------------------

<1> Описание см. в руководстве Н.С. Правдина "Методика малой токсикологии", М., 1947; книге "Токсикологическая оценка летучих веществ, выделяющихся из синтетических материалов" под ред. И.М. Трахтенберга (1968), статьях Г.Х. Шахбазяна, Е.И. Спыну (ж. "Гигиена и санитария", 1953, N 9); Г.А. Войтенко (ж. "Гигиена труда и профессиональные заболевания", 1958, N 4).

Удаление воздуха из камеры производится путем индивидуальной тяги или вентиляционной системы. Скорость подачи воздуха в камеру должна быть такой, чтобы обеспечить находящимся в ней животным не менее 3 воздухообменов в час. Учитывая, что минимальный объем паровой и аэрозольной камер должен быть не менее 100 л, а пылевой - 200 л, скорость подачи воздуха должна составлять 5 - 10 л/мин.

При помощи психрометра контролируют относительную влажность и температуру воздуха в камере. В паровой камере необходимые концентрации пестицидов создаются изменением скорости прохождения воздуха над препаратом, изменением площади испарения и т.д. Следует учитывать, что при подогревании исследуемого вещества часть паров в камере может конденсироваться и воздействовать на организм в виде аэрозолей.

Создание необходимых концентраций в пылевых камерах достигается регулированием работы пылеподатчика, изменением скорости движения и дополнительной подачи воздуха. Величина пылевых частиц, поступающих в зону дыхания животных, зависит от свойства вещества, наполнителя и др. Изменяя режим работы камеры, получают различные концентрации пылевидной формы препарата.

В камерах для затравки животных аэрозолями из препаратов в капельно-жидком состоянии используют форсунки, работа которых основана на принципе завихрения.

Необходимое содержание препарата в воздухе создается путем изменения концентрации применяемых растворов, увеличением или уменьшением количества расходуемой жидкости. Устройство форсунки позволяет менять также степень дисперсности аэрозоля путем регулирования количества жидкости, проходящей через нее, и скорости движения воздуха.

Для исключения попадания пестицидов в организм путем резорбции экспериментальных животных помещают в ящики, расположенные сбоку от конуса камеры. Специальные патрубки позволяют производить отбор проб воздуха из камер и контролировать в них концентрации паров, пыли или аэрозолей.

Пробы воздуха отбирают при помощи электрического аспиратора. При установлении режима камеры отбор проб производят несколько раз в течение опыта. В дальнейшем можно отбирать в остром опыте по 2 параллельные пробы через 1,5 - 2 часа от начала опыта, в хроническом - 2 - 3 раза в неделю. В зависимости от свойств изучаемого препарата пробы отбирают в специальные поглотители, аллонжи и фильтры.

Концентрации препаратов в камере определяют при помощи соответствующих методов и выражают в мг/куб. м.

Опыты проводятся на нескольких группах животных (мышей - не менее 10,

крыс - 6, кошек - 3), исследуют действие пестицида в различных

концентрациях. Находят концентрации, вызывающие гибель всех животных

группы, гибель части животных, и концентрации, при воздействии которых

смертельные исходы не наблюдаются. На основании полученных данных по методу

В.Б. Прозоровского вычисляют ЛК .

Если при концентрациях, которые могут быть созданы в условиях

эксперимента, смертельные исходы не наступают, учитывают наблюдаемые

эффекты и по изменению одного из наиболее чувствительных показателей

вычисляют среднюю эффективную концентрацию (ЭК ).

Если установлено, что исследуемое вещество оказывает раздражающее действие на слизистую оболочку дыхательных путей, проводится изучение аллергенных свойств путем воспроизведения бронхиальной астмы (см. соответствующую главу).

В течение и по окончании острого эксперимента при различных путях поступления пестицида в организм проводятся в динамике гистологические и гистохимические исследования внутренних органов. Важно установить обратимость патологических процессов, что является одним из показателей токсичности. Методика проведения гистологических исследований изложена в Приложении 4.

2. ИССЛЕДОВАНИЕ КУМУЛЯТИВНЫХ СВОЙСТВ ПЕСТИЦИДОВ

Для токсикологической характеристики изучаемого вещества чрезвычайно важным является выяснение вопроса - обладает ли данное соединение кумулятивным свойством.

При многократном поступлении через малые интервалы времени вещество может либо само накапливаться в организме (материальная кумуляция, кумуляция вещества), либо вызывать суммирование эффекта, т.е. суммирование изменений, связанных с длительным действием яда (функциональная кумуляция). Выяснение степени кумулятивного действия вещества позволяет довольно быстро с большой вероятностью предсказать возможность развития хронического отравления.

Для выяснения кумулятивного действия пестицидов эксперимент следует ставить на животных, оказавшихся наиболее чувствительными к данному яду в острых опытах. Эксперимент проводится не менее чем на 2 видах лабораторных животных, так как возможны значительные видовые колебания.

Чтобы получить достаточно четкие результаты, которые можно подвергать статистической обработке, необходимо распределить животных по группам, однородным по показателям. Так как вес является наиболее интегральным показателем, характеризующим возраст, состояние животных, упитанность их, и наименее подвержен быстрым колебаниям, - то одним из показателей для распределения животных по группам, в первую очередь, является их вес.

Для выявления кумулятивного действия животным в течение 4 месяцев

ежедневно натощак вводят исследуемое вещество в количестве 1/10, 1/20,

1/60 ЛД , установленной в остром опыте.

В каждую серию следует брать животных обоего пола, мышей или крыс - не

менее 10 (в опыт с 1/20 ЛД - не менее 20), кроликов или кошек - не

менее 6. Обязательно наличие контрольной группы животных. Самки и самцы

содержатся раздельно.

Если в производственных условиях пестицид используется в сочетании с растворителями, эмульгаторами и другими компонентами, то в эксперименте необходимо выяснить влияние их на всасывание препарата.

В продолжение всего эксперимента следует вести тщательное наблюдение за клинической картиной интоксикации, так как появление тех или иных симптомов может помочь выявлению некоторых характерных сторон действия пестицида.

Большое внимание следует уделять внешнему виду животных (их опрятности, гладкости и блеску волосяного покрова, их состоянию и поведению). Отмечается возбуждение, угнетение, характер и степень активности и координации движений, реакция животного на ориентировочные, тактильные и болевые раздражения, наличие тремора, судорог, парезов, параличей, отделяемого из глаз, носа, мочевыводящих путей. Изменение цвета кожных покровов часто является характерным признаком действия яда (например, вещества, вызывающие аноксемию, приводят к синюшности кожных покровов). Следует также наблюдать за изменениями веса тела, аппетита, состояния сердечно-сосудистой системы, дыхания, желудочно-кишечного тракта.

Взвешивание животных, измерение температуры тела проводят один раз в 7 дней, а после появления видимых признаков интоксикации - чаще.

Помимо изучения клинической картины отравления, при оценке нового вещества проводятся исследования, направленные на выяснение некоторых сторон физиологических и биохимических механизмов действия его с целью выявления признаков ранней интоксикации. Если предыдущими исследованиями в острых опытах выявлены специфические признаки интоксикации (например, снижение активности холинэстеразы при отравлении фосфорорганическими соединениями, снижение уровня SH-групп при интоксикации соединениями ртути, образование метгемоглобина и изменение состава крови при действии производных анилина), то эти тесты обязательно используются для суждения о характере действия при повторном поступлении.

При отсутствии специфических показателей интоксикации применяют ряд интегральных и других показателей, отражающих характерное проявление действия вещества.

Так, например, проводят исследование периферического состава крови, нервной системы (условных рефлексов, порога нервно-мышечной возбудимости и др.), ставят пробы, характеризующие функциональное состояние печени, почек и других органов. Если есть данные о тропности действия исследуемого вещества, проводят специальные исследования. Изучают также потребление кислорода, работоспособность, обязательно определяют относительный вес внутренних органов (вес органа в мг к весу тела в г) и другие показатели (см. М.Л. Рылова "Методы исследования хронического действия вредных факторов среды в эксперименте", 1964).

Если установлено, что изучаемый пестицид обладает выраженными кумулятивными свойствами, выясняются процессы накопления, распределения, пути и скорость выведения из организма его и метаболитов.

Исследования проводятся на животных в эксперименте по кумуляции, а также в динамике при однократном введении в желудок.

Крысам (50 - 60 животных) одновременно вводится максимально переносимая доза вещества. Животных забивают в первые часы, через 24 и 48 часов, на 5, 10, 15 и 20-е сутки после введения препарата. Необходимо, чтобы сроки убоя совпадали с периодами возникновения интоксикации, максимальным проявлением ее и моментом исчезновения симптомов отравления. В каждый срок используют не менее 5 - 6 животных.

Пестицид определяют в крови, моче, желчи, кале, внутренних органах, головном мозге, мышцах, жировой клетчатке, железах внутренней секреции.

По окончании всех исследований учитывают суммарное количество яда,

вызвавшее гибель животных, и определяют коэффициент кумуляции, под которым

понимают отношение суммарной дозы, вызвавшей гибель 50% подопытных животных

при многократном введении (ЛД chronica), к дозе, вызвавшей гибель 50%

животных при однократном воздействии яда (ЛД acuta) (Приложение 3).

Таким образом, коэффициент кумуляции определяется по формуле:

ЛД chronica

К = -------------.

кум. ЛД acuta

Сопоставлять коэффициенты кумуляции различных веществ можно только при

введении их животным одного и того же вида, пола, веса. При этом

обязательно, чтобы вводилась одинаковая часть ЛД . Основой для вычисления

коэффициента кумуляции являются результаты, полученные при ежедневном

введении 1/20 ЛД , так как при введении этой дозы за 4 месяца животное

получит суммарно около 5 ЛД .

На основании полученных данных изучаемый пестицид относят к одной из групп принятой классификации.

В том случае, когда гибель животных не наблюдается и не происходят достоверные изменения в исследуемых показателях, делается вывод об отсутствии кумулятивных свойств.

Если к концу опыта с введением 1/20 ЛД погибают единичные животные, а

остальные переносят введение препарата в течение 4 месяцев без токсических

проявлений, делают вывод о слабо выраженной кумуляции.

Однако при установлении ПДК и ДОК следует принимать во внимание гибель единичных животных, которая указывает на возможную повышенную индивидуальную чувствительность к веществу. Это обстоятельство следует учитывать при выборе коэффициента запаса.

При общей оценке результатов исследования кумуляции следует принимать

во внимание данные, полученные в опытах с ежедневным введением животным

1/10 и 1/50 ЛД .

Гибель животных в группе с введением 1/10 ЛД повышает вероятность

предположения, что и в опыте с 1/20 ЛД она была неслучайной.

Если исследуемый пестицид обладает сверхкумуляцией (первая группа по классификации - коэффициент кумуляции меньше 1), должно быть сделано обоснованное заключение о невозможности внедрения его в сельскохозяйственную практику. Дальнейшее изучение прекращается.

Отнесение пестицида ко второй (выраженная кумуляция) и последующим группам, при отсутствии других лимитирующих критериев, мешающих его внедрению, требует тщательного изучения для выявления способности вызывать хроническое отравление.

Животных, получавших ежедневно 1/50 ЛД , оставляют для хронического

опыта, если в группе не было случаев гибели.

3. ИССЛЕДОВАНИЕ ТОКСИЧЕСКИХ СВОЙСТВ ПЕСТИЦИДОВ

В ХРОНИЧЕСКОМ ОПЫТЕ

Поскольку в реальной обстановке, как правило, создаются условия для многократного воздействия пестицидов, необходимо проведение исследований при длительном поступлении препарата в организм различными путями.

Целью хронических опытов является установление пороговых доз и концентраций как отправных данных для обоснования предельно допустимых доз и концентраций пестицидов в объектах внешней среды.

Опыты должны проводиться не менее чем на 2 видах наиболее чувствительных к данному пестициду лабораторных животных обоего пола. О том, какие животные являются наиболее чувствительными, судят на основании результатов острых опытов и опытов по изучению кумулятивных свойств.

В хронических опытах необходимо также использовать беременных, кормящих и растущих животных для выяснения вопроса о влиянии исследуемого вещества на рождаемость, выживаемость потомства, что является существенным показателем его опасности. Если в процессе этих исследований обнаруживается возможность эмбриотоксического, гонадотоксического или тератогенного действия, проводятся специальные исследования, описанные в главе "Выявление гонадотоксического, эмбриотоксического, тератогенного, мутагенного и бластомогенного действия химических веществ".

При выборе доз и концентраций для проведения хронических экспериментов учитывается пороговая доза и концентрация препарата, установленная в остром опыте, а также выраженность кумулятивных свойств. Исходная доза и концентрация веществ, обладающих выраженными кумулятивными свойствами (2-я группа по классификации), должна составлять 1/10 пороговой дозы, установленной в остром опыте. Для веществ со средней (3-я группа) или слабой кумуляцией (4-я группа) - 1/2 пороговой дозы. В последующих сериях опытов дозы и концентрации могут быть меньше исходных в 10 раз, а при необходимости - в 100 раз и более.

В хроническом эксперименте учитываются результаты исследований с 1/50

ЛД , начатых в опытах по выявлению кумулятивных свойств препарата. При

необходимости, введение вещества продолжается в течение принятого срока.

Если ко времени постановки хронических экспериментов уже получены данные гигиенических исследований, то при выборе доз и концентраций пестицида учитываются количества и концентрации его, встречающиеся в пищевых продуктах, воде, в зоне дыхания работающих.

Длительность хронического опыта должна быть такой, чтобы его результат мог гарантировать здоровье на протяжении всей жизни человека, а в тех случаях, когда пестицид может оказать влияние на потомство, - и для будущих поколений.

Сроки хронического эксперимента для установления ПДК в воздухе рабочей зоны и атмосферном воздухе составляют 4 - 6 месяцев (в зависимости от кумулятивных свойств препарата).

Срок хронического эксперимента для нормирования препарата в пищевых продуктах и воде - 10 - 12 месяцев.

Исследуемый препарат вводится в организм ежедневно. Условия постановки эксперимента (пути введения, метод забора проб воздуха и т.д.) такие же, как в остром опыте.

Каждая доза и концентрация испытывается не менее чем на 10 мышах, 10 крысах, 3 - 6 кошках или кроликах. Самки и самцы содержатся раздельно. В опытах с пероральным введением препарат смешивается с пищей либо вводится в соответствующих растворителях.

В хроническом опыте изучаются те показатели, которые оказались наиболее чувствительными в острых опытах и опытах по изучению кумулятивных свойств. Наряду со специфическими тестами (если они имеются), учитываются интегральные показатели.

Ввиду того, что животные, находясь в длительном хроническом эксперименте, могут подвергаться воздействию ряда побочных факторов, необходимо в тех же условиях содержать контрольную группу животных.

Если подопытным животным вводят препарат в растворах, то контрольным необходимо вводить растворители в соответствующих количествах.

Исследования избранных показателей у подопытных животных и контрольных в начале эксперимента проводятся раз в 14 дней, в дальнейшем - раз в месяц. Все изменения в состоянии животных и изучаемых показателей подробно протоколируются и статистически обрабатываются.

_ _

Определяются средние арифметические в опыте и в контроле Х и Х ,

1 2

стандартные ошибки средних арифметических S_ и S_ :

х1 х2

___________

/ _ 2

/SUM (Х - Х)

S_ = \/ ------------

х n (n - 1)

и доверительные границы средних арифметических Х +/- S_ t и

1 х1

Х +/- S_ t.

2 х2

Достоверность различий определяется по формуле <1>:

_ _

Х - Х

1 2

t = -----------

________

/2 2

\/S_ + S_

х1 х2

и значение t сравнивается с табличными при вероятности 0,95 с учетом

малой выборки (табл. 5, Приложение 2).

--------------------------------

<1> Если число животных меньше 30, пользуются формулой:

_______

/n х n

_ _ / 1 2

(Х - Х ) х \/ -------

1 2 n + n

1 2

t = -----------------------------------.

______________________________

/ _ 2 _ 2

/SUM (Х - Х ) + SUM (Х - Х )

/ 1 1 2 2

\/ -------------------------------

n + n - 2

1 2

Одним из чувствительных тестов для оценки опасности пестицидов является

выделение его с молоком.

Для опыта отбираются молодые самки весом 150 - 180 г по 6 крыс в

подопытную и контрольную группы. Подопытным животным ежедневно вводится

1/10 ЛД пестицида. Каждую самку с ее потомством содержат в отдельной

клетке. Необходимо создать условия, при которых подопытные и контрольные

самки кормили бы одинаковое количество крысят, то есть, если в какой-либо

клетке больше крысят, то лишних отбрасывают.

Начинают вводить препарат сразу после рождения потомства. Через неделю взвешивают подопытных и контрольных крысят (в тарированном сосуде) и измеряют длину туловища. Определяют средние величины. В дальнейшем взвешивание и измерение длины туловища производится раз в неделю.

О выделении пестицида с молоком косвенно судят по развитию потомства: приросту веса, длине туловища, времени покрытия шерстью, открытия глаз, начала самостоятельного передвижения по клетке и поедания пищи, а также по наличию характерных признаков отравления. Все показатели строго документируются в таблицах, позволяющих сравнивать данные о потомстве подопытных и контрольных крыс, и статистически обрабатываются.

Введение препарата продолжают до отлучения крысят.

Если есть метод определения пестицида в пищевых продуктах, то по окончании опыта определяют пестицид в содержимом желудка потомства. Аналогичные исследования проводят с содержимым желудка контрольных крысят. При наличии данных о накоплении пестицида в организме (например, в жировой ткани и печени при введении хлорорганических пестицидов) необходимо проводить определение его в органах потомства.

О выделении с молоком пестицидов, обладающих свойством угнетать активность холинэстеразы, можно судить по состоянию фермента в содержимом желудка, в крови и тканях потомства. По окончании эксперимента проводят морфологические исследования органов подопытных и контрольных крысят и вычисляют их весовой коэффициент.

Если в опыте с введением 1/10 ЛД пестицида не выявлено отрицательное

влияние его на потомство и он не обнаружен в организме крысят, то делают

вывод о том, что пестицид с молоком не выделяется. В противном случае

повторяют эксперимент, вводя кормящим самкам пороговую дозу пестицида,

установленную в хроническом опыте длительностью не менее 10 месяцев.

В течение хронического опыта (если погибают животные) и по окончании его проводят гистологические и гистохимические исследования, определение весовых коэффициентов внутренних органов, а также накопления веществ в тканях. Для выяснения обратимости возникших изменений исследования проводятся в динамике.

В результате хронического эксперимента должен быть дан ответ на следующие вопросы:

1. Может ли изучаемый пестицид вызывать хроническое отравление.

2. Величины доз и концентраций, могущих вызвать хроническое отравление и сроки его наступления.

3. Характер и локализация изменений, происходящих в организме в процессе хронического воздействия. Описывается клиническая картина хронического отравления.

4. Способность выделяться с молоком.

Сопоставление доз и концентраций, вызывающих хроническое отравление животных, с дозами и концентрациями, возможными в реальных условиях, позволяет прогнозировать опасность хронического отравления людей.

Результаты хронического опыта, в первую очередь, выявленные величины пороговых доз и концентраций, являются, как указывалось выше, основными ориентирами для установления предельно допустимых количеств пестицида в пищевых продуктах, воде и воздухе.

4. ВЫЯВЛЕНИЕ ГОНАДОТОКСИЧЕСКОГО, ЭМБРИОТОКСИЧЕСКОГО,

ТЕРАТОГЕННОГО, МУТАГЕННОГО И БЛАСТОМОГЕННОГО

ДЕЙСТВИЯ ВЕЩЕСТВ

Испытания пестицидов для выявления возможных неблагоприятных отдаленных последствий действия на организм следует сочетать с установлением их токсических параметров. Для этого целесообразно использовать животных, находящихся в опыте по изучению хронической токсичности при введении вещества через рот.

Параллельное проведение токсикологических исследований и выявление возможных отдаленных неблагоприятных эффектов воздействия изучаемого вещества позволит дать ему в наиболее короткие сроки всестороннюю оценку, необходимую для гигиенического нормирования.

Прежде всего следует выяснить, влияет ли исследуемое вещество на репродуктивную функцию животных. Этим определяется суммарный эмбриотоксический и гонадотоксический эффект. Обнаружение такого эффекта обязывает к проведению специальных исследований для дифференциального анализа его причин.

Такая постановка эксперимента экономит время, необходимое для окончательной характеристики изучаемого вещества.

а) Выявление действия веществ на репродуктивную

функцию животных

В каждую группу животных, взятых для основного опыта по изучению хронической токсичности веществ, следует добавить по 12 крыс (самок и самцов) и специально промаркировать. Каждое исследование проводят в динамике на 6 крысах, которым препарат вводился в наибольшей дозе (1/2 или 1/10 пороговой дозы, установленной в остром опыте).

Крыс-самок из подопытной и контрольной групп через 6 и 9 месяцев после начала затравки спаривают с нормальными самцами (1 самец на 2 самки). По наличию сперматозоидов в мазках влагалищного содержимого устанавливают первый день беременности. Отмечают возможные отклонения в оплодотворяемости самок и оплодотворяющей способности самцов. Последнее выявляется путем спаривания подопытных самцов с контрольными самками.

Следует установить наличие пестицида в плаценте и эмбрионе (при вскрытии самок на 17 - 19-й день беременности), что может служить указанием на проникновение вещества в организм потомства.

Если к концу эксперимента по изучению хронической токсичности вещества наибольшая из испытанных доз не приведет к каким-либо количественным и качественным отклонениям от нормы в развитии потомства, можно сделать заключение, что испытуемое вещество не оказывает влияния на репродуктивную функцию, и не подвергать его дополнительным специальным исследованиям.

При обнаружении же отклонений по сравнению с контрольной группой (хотя бы только по числу особей в помете) необходимо провести исследования на животных последующих серий опытов, получающих дозы вещества в 10 и 100 раз меньше исходной.

Если в этом эксперименте будет обнаружено отклонение от показателей контрольной группы, необходимо проводить специальные исследования для выявления эмбрио- и гонадотоксических свойств.

б) Выявление эмбриотоксического действия

С этой целью используют 20 половозрелых крыс-самок весом в 150 - 200 г, у которых предварительно исследуют эстральный цикл с помощью вагинальных мазков (см. соответствующую главу). При наличии эструса проводят спаривание с контрольными самцами. Животных разбивают на группы - контрольную и подопытную, и ведут ежедневную затравку в течение всей беременности.

Затравку производят наименьшей дозой, давшей эффект нарушения репродуктивной функции в условиях эксперимента по изучению хронической токсичности. В случае установления эмбриотоксичности этой дозы, ее снижают. Часть самок из каждой группы оставляют до нормальных родов, остальных забивают на 17 - 19-й день беременности, учитывают число плодовместилищ, количество желтых тел в яичниках, число живых и мертвых плодов.

После родов затравку самок не производят.

В группах, оставленных до естественных родов, учитывают продолжительность беременности, число, вес, длину туловища новорожденных крысят, их развитие (прирост длины и привес за определенный срок, время покрытия шерстью, открытия глаз, начала самостоятельного передвижения по клетке и поедания пищи).

Кроме того, учитывают выживаемость крысят, распределение их по полу. Наблюдение за вышеуказанными показателями начинают на 3-и сутки после рождения.

Полученные результаты оформляют по образцу, приведенному в табл. 2.

Таблица 2

ЭМБРИОТОКСИЧЕСКОЕ ДЕЙСТВИЕ

┌─────────────────────────────────────────────────┬─────┬────────┐

│ Показатели │Опыт/│Контроль│

│ │ / │ │

│ │/Доза│ │

├─────────────────────────────────────────────────┼─────┼────────┤

│Характер затравки │ │ │

│Вскрытие на 17 - 20-й день беременности │ │ │

│Количество вскрытых беременных самок │ │ │

│Среднее колич. желтых тел на одну самку │ │ │

│Нормально развивающихся зародышей: │ │ │

│ всего (а) │ │ │

│ % │ │ │

│Резорбированных плодов: │ │ │

│ всего (в) │ │ │

│ % │ │ │

│ │ │ │

│ Рождение в срок │ │ │

│ │ │ │

│Число родивших самок │ │ │

│Число новорожденных │ │ │

│Рожденных живыми: │ │ │

│ всего (б) │ │ │

│ % │ │ │

│Средний вес (в г) │ │ │

│Средняя длина туловища (в см) │ │ │

│Макроскопические особенности │ │ │

│Мертворожденных: │ │ │

│ всего (д) │ │ │

│ % │ │ │

│Средний вес (в г) │ │ │

│Средняя длина туловища (в см) │ │ │

│Макроскопические особенности │ │ │

│ │ │ │

│ Исход беременности │ │ │

│ │ │ │

│Благоприятный: │ │ │

│ всего особей (а + б) │ │ │

│ % │ │ │

│Неблагоприятный: │ │ │

│ всего особей (в + д) │ │ │

│ % │ │ │

└─────────────────────────────────────────────────┴─────┴────────┘

По степени выраженности эмбриотоксичности различают:

1) избирательную эмбриотоксичность - проявляется в дозах, не токсичных для

материнского организма;

2) общую эмбриотоксичность - проявляется наряду с токсическим

эффектом в материнском организме;

3) отсутствие эмбриотоксичности - не проявляется при наличии

токсического эффекта в материнском

организме.

в) Выявление тератогенного действия

Опыт проводят по схеме, описанной для выявления эмбриотоксического действия веществ. Беременным крысам вводят максимально переносимые дозы препарата через день в течение всей беременности. Отклонения от нормального развития новорожденных учитывают визуально, а результаты оформляют по схеме, приведенной в таблице 3.

Таблица 3

КЛАССИФИКАЦИЯ УРОДСТВ ЭМБРИОНОВ

┌───────────────┬────────────────────────────────────┬────────────────────┐

│ Пораженные │ Типы уродств │Количество эмбрионов│

│органы, системы│ │ с данным типом │

│ │ │ уродств │

│ │ ├─────┬──────────────┤

│ │ │Всего│В % от числа │

│ │ │ │соответству- │

│ │ │ │ющих органов │

│ │ │ │всех уродливых│

│ │ │ │плодов │

├───────────────┼────────────────────────────────────┼─────┼──────────────┤

│Нервная система│Отсутствие головного мозга │ │ │

│ │(анэнцефалия) │ │ │

│ │Недоразвитие головного мозга │ │ │

│ │(микроцефалия) │ │ │

│ │Большое количество цереброспинальной│ │ │

│ │жидкости в желудочках головного мозг│ │ │

│ │(гидроцефалия) │ │ │

│ │Мозговая грыжа (энцефалоцелия) │ │ │

│ │Расщепление нервных дужек позвонков │ │ │

│ │(спина бифида) │ │ │

│Органы чувств │Отсутствие глаз (анофтальмия) │ │ │

│ │Недоразвитие глаз (микрофтальмия) │ │ │

│ │Один глаз (циклопия) │ │ │

│Лицевая часть │Заячья губа │ │ │

│ │Волчья пасть │ │ │

│ │Недоразвитие нижней челюсти │ │ │

│ │(микрогнатия) │ │ │

│Внутренние │Увеличение кишечника (мегаколон) │ │ │

│органы │Увеличение печени (гепатомегалия) │ │ │

│ │Дивертикулы │ │ │

│ │Неправильное положение органов │ │ │

│ │Отсутствие сердца (акардия) │ │ │

│Голова, │Отсутствие черепной крышки (акрания)│ │ │

│туловище, │Недоразвитие черепной крышки │ │ │

│конечности │(гемикрания) │ │ │

│ │Полное отсутствие конечностей │ │ │

│ │(амелия) │ │ │

│ │Укорочение конечностей (перамилия) │ │ │

│ │Слияние и уменьшение числа пальцев │ │ │

│ │(синдактилия) │ │ │

│ │Увеличение числа пальцев │ │ │

│ │(полидактилия) │ │ │

│ │Редукция задней части туловища │ │ │

│Хвост │Отсутствие хвоста │ │ │

│ │Укорочение хвоста │ │ │

│ │Деформация хвоста │ │ │

└───────────────┴────────────────────────────────────┴─────┴──────────────┘

г) Выявление гонадотоксического действия

Выявление действия веществ на половую сферу самок

Исследование эстрального цикла. Известно, что половая система самок в результате нейрогуморальной регуляции синхронно реагирует на функционирование яичников. Процессы, связанные с ритмическим созреванием фолликулов, овуляцией и образованием желтых тел в яичнике, отражаются на состоянии яйцеводов, слизистой матки и влагалища. Поэтому по составу клеток в мазке, взятом из влагалища, можно судить о функциональном состоянии яичника.

Выбор данного метода обусловлен рядом причин:

1) Эстральный цикл является одним из удобных объективных показателей функционирования яичников, а, следовательно, плодовитости самок.

2) Нормальное течение эстрального цикла и его нарушение могут быть выражены количественно.

3) Наблюдение за эстральным циклом значительно менее трудоемко, чем непосредственное изучение плодовитости подопытных самок, и возможно в течение длительного времени после введения вещества.

Эстральный цикл исследуют с помощью вагинальных мазков. Для этого глазной пипеткой во влагалище вводят подогретый физиологический раствор (2 - 3 капли), несколько раз втягивают его в пипетку и выпускают обратно во влагалище. Затем на предметных стеклах готовят мазки, фиксируют их над пламенем и окрашивают в течение 1 минуты однопроцентным водным раствором метиленовой сини. Мазок просматривают под микроскопом при малом увеличении.

Фаза проэструса (предтечки) характеризуется преобладанием эпителиальных клеток и продолжается несколько часов.

Для эструса (течки) основным типом клеток являются ороговевшие полигональные клетки (чешуйки). Данная стадия продолжается 1 - 2 дня, в этом периоде наступает овуляция.

Метаэструс (послетечка) продолжается 1 - 2 дня и характеризуется присутствием, наряду с чешуйками, эпителиальных клеток и лейкоцитов.

Для диэструса (фаза покоя между течками) характерно наличие лейкоцитов и слизи; продолжительность этой фазы равна половине всего цикла.

Эстральный цикл, наряду с четко выраженными основными стадиями, имеет еще и промежуточные, определять которые нередко можно, лишь зная предшествующую и последующие стадии. Поэтому определение стадий необходимо проводить по системе регистрации с помощью плюсов. Один плюс означает присутствие малого количества клеток; два плюса - много клеток, три - очень много (см. табл. 4).

Таблица 4

ХАРАКТЕРИСТИКА СТАДИЙ ЭСТРАЛЬНОГО ЦИКЛА

┌────────────────┬───────────────────────┬───────┬─────────┬─────┐

│ Стадии цикла │ Эпителиальные клетки │Чешуйки│Лейкоциты│Слизь│

├────────────────┼───────────────────────┼───────┼─────────┼─────┤

│Проэструс │+++ │- │- │- │

│Эструс │- │+++ │- │- │

│Метаэструс │++ │++ │++ │- │

│Диэструс │+ │- │+++ │+ │

└────────────────┴───────────────────────┴───────┴─────────┴─────┘

Необходимо учитывать также и другие показатели, характеризующие течение полового цикла, как: частота появления отдельных стадий эстрального цикла (в процентах), средняя продолжительность стадий (в днях), число циклирующих самок (в процентах), среднее число нормальных циклов на самку (в процентах), средняя продолжительность цикла (в днях).

Описанный тест является минимально необходимым для установления наличия или отсутствия влияния вещества на половую сферу самок.

Такое влияние может быть прямым (локальным) или происходить в результате нарушения функции каких-либо органов или систем.

Для определения овогенеза яичники фиксируют смесью Ценкера, заливают в парафин и готовят срезы толщиной 7 микрон, которые окрашивают затем гематоксилином Бемера и Караччи с докраской эозином. На трех срезах каждого яичника (средних из каждой трети яичника) проводят подсчет под микроскопом (ув. х 300) всех фолликулов: примордиальных, зреющих, зрелых, а также желтых тел. Результаты оформляют по схеме, приведенной в таблице 5.

Таблица 5

СОСТОЯНИЕ ОВОГЕНЕЗА

┌────────┬─────────┬─────────────────────────────────────────────┐

│ Доза │Продолжи-│ Количество фолликулов │

│вещества│тельность├────────┬───────┬─────────────────────┬──────┤

│ │затравки │примор- │зреющих│ зрелых │желтых│

│ │ │диальных│ ├──────────┬──────────┤ тел │

│ │ │ │ │с яйце- │без яйце- │ │

│ │ │ │ │клеткой │клетки │ │

├────────┼─────────┼────────┼───────┼──────────┼──────────┼──────┤

│Контроль│ │ │ │ │ │ │

│Опыт │ │ │ │ │ │ │

└────────┴─────────┴────────┴───────┴──────────┴──────────┴──────┘

В срезах нормальных яичников наблюдаются фолликулы на разных стадиях развития. При различных патологических состояниях, в том числе при интоксикации, может нарушаться процесс созревания фолликулов и в результате этого появятся незрелые формы.

На основании полученных экспериментальных данных делают заключение о наличии или отсутствии эффекта воздействия изучаемого фактора на гонады самок и о степени его выраженности.

Выявление действия на половую сферу самцов

Для исследования функции семенников производят микроскопическое изучение субстрата из придатка яичка белых крыс.

Как известно, придаток яичка является секреторным органом, имеющим физиологическое значение в оплодотворяющей способности. Выработка его секрета поддерживается тестикулярным гормоном. Хвост придатка рассматривается как резервуар накопления сперматозоидов.

Сперматозоиды, прошедшие через придаток, обладают большей подвижностью и жизнеспособностью и, в отличие от сперматозоидов текстикул, они приобретают способность к оплодотворению. Исходя из этого, исследование подвижности сперматозоидов и их морфологии производят в субстрате из придатка.

Для определения подвижности сперматозоидов придатки крысы извлекают, измельчают ножницами в течение 1 минуты на часовом стекле с 2 мл физиологического раствора, подогретого до 25 °С. Одну каплю полученной суспензии наносят на предметное стекло, покрывают покровным и рассматривают под микроскопом на термостатном столике. Засекают время и следят за движением сперматозоидов до тех пор, пока не прекратится движение последнего из них.

С помощью препарата получают представление о качестве, количестве и подвижности сперматозоидов.

Для определения соотношения подвижных и неподвижных форм сперматозоидов суспензию придатков, приготовленную вышеуказанным способом, набирают в смеситель для лейкоцитов до нижней метки и доводят физиологическим раствором до верхней метки. Суспензию встряхивают, выпускают две капли, заполняют счетную камеру Горяева и подсчитывают подвижные сперматозоиды в пяти больших квадратах. С помощью 1-процентного раствора соляной кислоты прекращают движение всех сперматозоидов, считают их общее количество и вычисляют процент подвижных форм сперматозоидов.

Сперматозоиды, совершающие колебательные движения на одном месте и круговые движения без поступательного, рассматриваются как неподвижные.

При подсчете сперматозоидов следует принимать во внимание только прогрессивно движущиеся и учитывать качество движения, которое оценивается следующим образом: быстрое поступательное движение - четыре балла, хорошо выраженное поступательное движение - три, вялое медленное поступательное движение - два, колебательное круговое движение на одном месте - один, отсутствие подвижности - ноль.

Патологические формы сперматозоидов определяют на окрашенных препаратах. Мазок фиксируют две минуты метиловым алкоголем, окрашивают в течение 10 минут разбавленным раствором азурэозина по Романовскому-Гимза, промывают водой и рассматривают под микроскопом (90 х 10).

Для учета и оценки патологических форм сперматозоидов необходимо подсчитать 200 клеток. К патологическим формам относят изменения структуры головки и жгутиков.

Резистентность сперматозоидов определяют по их устойчивости к воздействию 1-процентного раствора хлористого натрия. Ее выражают количеством мл данного раствора, которое нужно прибавить к 1 мл суспензии сперматозоидов до прекращения их поступательного движения. Метод основан на действии хлористого натрия на защитный липопротеидный покров сперматозоидов.

В колбочку помещают 0,02 мл суспензии сперматозоидов и из бюретки на 10 мл добавляют 1-процентный раствор хлористого натрия, перемешивают и быстро оценивают поступательное движение сперматозоидов под микроскопом на термостатном столике (см. определение подвижности).

Резистентность выражают следующей формулой:

R = -,

где:

V - объем добавленного раствора хлористого натрия в мл;

v - объем суспензии сперматозоидов, взятой для титрования.

Определение сперматогенеза. Важное значение для суждения о влиянии химических веществ на половую сферу самцов имеет изучение сперматогенеза. Полная серия морфологических изменений, наблюдающихся между появлением двух одинаковых сперматогенных клеток в одном участке стенки извитого канальца семенника, получила название цикла сперматогенного эпителия. В процессе сперматогенеза различают 4 периода или фазы:

1. Период размножения. На срезах канальцев обнаруживаются периферически расположенные клетки-сперматогонии типа А и типа В.

2. Период роста. Характерны сперматоциты 2-го порядка, образующиеся из сперматогоний.

3. Период созревания. Типичны сперматоциты 2-го порядка, которые немедленно делятся, вновь образуя сперматиды.

4. Период формирования зрелых сперматозоидов с гаплоидным (половинным) набором хромосом.

Семенники фиксируют смесью Ценкера, заливают в парафин, готовят гистологические срезы толщиной 7 - 9 микрон, фиксируют и окрашивают гемалауном по Майеру либо по Фельгену, с подкраской оранжевым G, а также гематоксилином Эрлиха с докраской эозином. Препараты рассматривают под микроскопом при увеличении в 300 раз. На серединном срезе семенника выбирают 100 поперечных срезов семенных канальцев, в которых производят подсчет различных типов зародышевых клеток. Оценку проводят по трехбалльной системе Фогга и Коуинга: учитывают число канальцев, содержащих все три слоя эпителия (3 балла), только два (2 балла), только один слой (1 балл). Полученные результаты можно выразить также в процентах по отношению к 100 подсчитанным канальцам.

В норме в поперечных срезах семенников должны быть все типы зародышевых клеток. При патологических же состояниях могут преобладать незрелые формы гамет: сперматогонии и сперматоциты.

Наряду с этим можно подсчитать канальцы со слущенным эпителием, что также выразить в процентах.

Оба метода оказываются чувствительными в опытах с повторным и многократным введением вещества. При однократном же воздействии чувствительность их ниже.

Примерная форма учета дана в таблице 6.

Таблица 6

СОСТОЯНИЕ СПЕРМАТОГЕНЕЗА

Доза вещества	Продолжи- тельность затравки	Количество на 100 канальцев
Доза вещества	Продолжи- тельность затравки	спермато- гоний	сперматоцитов 1 и 2-го порядков	спермати- дов	сперматозо- идов

д) Выявление мутагенного действия

Испытание химических веществ на возможную мутагенность должно занимать одно из важных мест в токсиколого-гигиенических исследованиях.

Согласно литературным данным 75% мутаций у человека вызывается химическими веществами, в том числе и пестицидами. Отсюда вытекает необходимость установления генетического контроля над наиболее широко применяемыми пестицидами. Наряду с изучением токсичности пестицидов, следует проверить их цитогенетическую активность методом хромосомного анализа на стадии метафазы на различных генетических объектах (например, клетках костного мозга животных, как минимум, на культуре лейкоцитов периферической крови человека).

Выявление мутагенных свойств веществ на культуре

лейкоцитов периферической крови человека

Существует ряд методов культивирования лейкоцитов периферической крови человека как в больших (10 - 20 мл), так и в малых (0,5 - 1 мл) количествах. Принципиально все они сводятся к следующим основным этапам:

Получение гепаринизированной крови. Стерильным гепаринизированным шприцом из локтевой вены человека, не работающего с пестицидами, набирают 18 - 20 мл крови и переносят ее в две стерильные, охлажденные центрифужные пробирки, в каждой из которых содержится по 0,5 мл приготовленного заранее гепарина в разведении 1:10. Тщательно перемешивают кровь с гепарином.

Получение плазмы с лейкоцитами. Кровь отстаивают в холодильнике при температуре +4 °С в течение 40 мин., потом центрифугируют в течение 7 мин. при скорости 400 об./мин.

При этом происходит осаждение эритроцитов и отделение плазмы со взвешенными в ней лейкоцитами.

Если невозможна постановка опыта сразу после взятия крови, пробирки с кровью можно оставлять в холодильнике (при температуре +4 °С) на 1 - 2 суток.

Посев лейкоцитов проводится в стерильных условиях в боксе. Для этого

полученную плазму с лейкоцитами тщательно отсасывают из центрифужной

пробирки (можно захватить небольшое количество эритроцитов), разбавляют

стандартной питательной средой N 199 для культуры ткани в соотношении 1:2

6 6

или 1:3 с тем, чтобы в 1 мл суспензии содержалось 1 х 10 х 1,5 - 10

лейкоцитов. Для поддержания чистоты культуры добавляют пенициллин в

количестве 50 ед./мл суспензии. Для стимуляции деления клеток к суспензии

добавляют фитогемагглютинин (ФГА). К плазме, полученной из 10 мл крови,

добавляют 0,02 мл ФГА "Difco P" или 0,2 мл ФГА "Difco M", или 0,15 - 0,2 мл

ФГА "Wellcome".

Полученную клеточную взвесь тщательно перемешивают пипеткой и разливают по стерильным пенициллиновым флаконам из расчета 2 мл на флакон. Насыщают суспензию окисью углерода выдыхаемого воздуха через стерильную пастеровскую пипетку с тампоном.

Затем культуру инкубируют в термостате при 37 °С. Через 48 часов после начала культивирования в культуру вводят исследуемое вещество и продолжают инкубацию до 72 часов. Таким образом, испытуемое вещество соприкасается с культивируемыми лейкоцитами в течение 24 часов. При хорошем росте клеток происходит сдвиг pH в кислую сторону (пожелтение красной окраски среды N 199).

Дальнейшие этапы проводят без соблюдения стерильности.

Для получения так называемых метафазных пластинок на 69 - 70-ом часу от начала инкубации к культуре добавляют свежеприготовленный раствор алкалоида колхицина из расчета 0,4 мкг/мл культуральной среды (исходный раствор колхицина 10 мкг/мл).

Осторожно встряхивая флакон, смешивают среду с колхицином. Продолжают инкубацию в течение 2 - 3 часов. Чтобы облегчить дальнейшую идентификацию хромосом, производят гипотоническую обработку, для чего после окончания инкубации культуры содержимое сливают в центрифужные пробирки, центрифугируют 5 мин. при 1000 об./мин. и к полученному осадку, то есть к клеткам, добавляют 6 - 7 мл свежеприготовленного, подогретого до 37 °С - 40 °С 0,95% раствора трехзамещенного цитрата натрия, осторожно ресуспензируют клетки в растворе, помещают пробирки в термостат (37 °С) на 20 мин.

После гипотонической обработки взвесь клеток центрифугируют (5 мин. при 1000 об./мин.). К полученному осадку добавляют 1 мл только что приготовленного охлажденного фиксатора, состоящего из одной части ледяной уксусной кислоты и 3 частей метилового спирта. Встряхиванием ресуспензируют осадок в фиксаторе. Добавляют еще 5 мл фиксатора и помещают пробирки в холодильник (4 °С) на 15 мин. Затем проводят 2 - 3-кратную смену фиксатора в течение 1 часа.

Клетки в фиксаторе можно оставить в холодильнике на 1 - 2 суток.

Для приготовления препаратов взвесь клеток в последней порции фиксатора тщательно ресуспензируют и по капле наносят на чистые замороженные предметные стекла. Фиксатор выжигают, капли уксусной кислоты сдувают грушей. Препараты можно окрашивать 2-процентным ацето-орсенином, по Унна-блю или Романовскому-Гимза.

После окраски и гистологической проводки (через ацетон, ксилол) препараты заключаются в канадский бальзам и в таком виде могут храниться длительное время.

Микровариант метода культивирования лейкоцитов

периферической крови человека

Микротехника данного метода отличается тем, что лейкоциты культивируются не в одной плазме, как это предусматривает вышеописанный метод, а в цельной крови со всеми клетками. Поэтому отпадает надобность в отделении лейкоцитов от эритроцитов и для культивирования достаточно небольшого количества крови (0,4 - 0,8 мл), которое можно получить из пальца. Микротехника очень удобна для изучения кариотипа человека вообще, а также может быть применена для учета хромосомных аберраций in vivo по кариотипу соматических клеток при обследовании лиц, контактирующих с пестицидами. Культуру лейкоцитов цельной крови можно использовать и для изучения действия химических веществ на хромосомный аппарат человека в условиях in vitro. Из 4 мл крови, например, взятой из вены, получается 15 образцов, которые можно использовать для многих вариантов опыта. В основу микротехники положена методика, описанная Л.М. Высоцкой (Генетика, 1966, N 11, 145 - 147).

1. Кровь человека, не работающего с пестицидами (0,4 - 0,8 мл), берется из пальца с помощью стерильного эритроцитарного меланжера или микропипетки, смоченных предварительно концентрированным гепарином, или просто собирают каплями в стерильную центрифужную пробирку с 0,1 мл гепарина (1:10). Кровь с гепарином можно оставлять на холоде (+4°) в течение 24 часов и в таком состоянии транспортировать.

2. Посев крови в стерильных условиях производят в настольном боксе. К забранной крови добавляют 0,01 - 0,02 мл фитогемагглютинина Дифко марки "Р" и слегка встряхивают в течение 5 мин. Затем прибавляют 4,0 - 5,5 мл стандартной питательной среды N 199 и пенициллин по 50 ед. на каждые 2 мл. Взвесь клеток хорошо суспензируют и разливают в стерильные пенициллиновые флаконы по 2 мл. Через 48 часов после начала культивирования вносят испытуемое вещество. Культивируют 72 часа при 37 °С <1>.

--------------------------------

<1> При обследовании лиц, работающих с пестицидами, 0,2 - 0,4 мл крови, взятой микропипеткой из пальца, помещают непосредственно во флакон, содержащий уже 4 мл среды N 199, 0,01 мл фитогемагглютинина "Р", который добавляют шприцом, и 0,1 мл гепарина (1:10). После суспензирования флаконы помещают в термостат.

3. За 2 - 3 часа до конца культивирования добавляют колхицин для остановки митоза на стадии метафазы. В каждый флакон вносят по 0,08 мл рабочего раствора колхицина (10 мкг в 1 мл) и продолжают культивировать.

4. После окончания воздействия колхицином культуральную среду со взвесью клеток и всем осадком эритроцитов переносят в мерную центрифужную пробирку, центрифугируют 5 мин. при 1000 об./мин., затем надосадочную жидкость сливают. Для отмывки лейкоцитов от культуральной среды в каждую пробирку приливают по 5,0 мл раствора Хенкса. Взвесь клеток хорошо суспензируют, центрифугируют, сливают, оставляя по 0,5 мл раствора Хенкса.

5. Проводят гипотоническую обработку. Для этого взвесь клеток суспензируют в оставшейся жидкости встряхиванием, по стенкам пробирки осторожно двумя порциями приливают 4 - 5-кратный объем дистиллированной воды, подогретой до 37 °С, и ставят эту взвесь клеток в термостат на 15 - 30 мин.

6. По окончании гипотонической обработки приступают к фиксации. Пробирки со взвесью клеток центрифугируют 7 - 8 минут при 1000 об./мин., осторожно сливают надосадочную жидкость, наслаивают 2 - 3 мл свежеприготовленного фиксатора (метанол + ледяная уксусная кислота, 3:1), приливая его по стенкам пробирки и ставят в холодильник на 10 - 15 мин. для фиксации. После того как слой лейкоцитов хорошо зафиксируется, а эритроцитарный слой еще не зафиксирован и не потемнел, взвесь быстро суспензируют пипеткой, приливают еще 1 порцию фиксатора до 5 - 6 мл и снова суспензируют. Смену фиксатора производят 2 - 3 раза в зависимости от количества гемоглобина, затем готовят препараты по вышеописанной методике.

Добавление испытуемых на мутагенность веществ

в культуру лейкоцитов

Исследуемые вещества вводят в культуру в разные сроки от начала культивирования и на различное время для определения наиболее чувствительной к действию препарата фазы клеточного цикла. При выборе доз сначала определяют цитотоксическое действие вещества, то есть находят ту дозу его, при которой наблюдается гибель всех клеток в культуре. Затем, снижая дозу, определяют цитостатический эффект, для чего выводят митотический индекс (количество метафаз на 1000 подсчитанных клеток). Цитогенетический эффект (действие на хромосомы) исследуют в максимальной дозе, не оказывающей ни цитотоксического, ни цитостатического действия. Если эта доза не повреждает хромосомы, то вещество не обладает цитогенетической активностью. При обнаружении же хромосомных аберраций дозу вещества снижают до недействующей, что может иметь значение для сравнения изучаемых веществ по цитогенетическому эффекту.

Для одной дозы необходимо проанализировать 100 метафазных пластинок. Опыт следует проводить в трех повторностях. В случае нерастворимости испытуемого вещества в воде необходимо подобрать подходящий растворитель и, помимо чистого контроля (без воздействия), следует ставить второй контроль с добавлением соответствующего количества растворителя.

Изучение хромосом в клетках костного мозга животных. Помимо хромосомного анализа лейкоцитов периферической крови человека, культивируемых вне организма, для изучения цитогенетического эффекта веществ рекомендуется использовать метод исследования хромосом клеток костного мозга затравленных животных.

Вещество, подлежащее исследованию, в различных дозировках вводят в организм животного внутрижелудочно. За три часа до забоя им внутрибрюшинно вводят 0,05-процентный водный раствор колхицина (5 мкг на 1 г веса животного). Животных забивают путем декапитации через 20 - 24 часа после введения препарата. Извлекают бедренные косточки, из которых костный мозг вымывают с помощью шприца 4 мл глюкозосолевого раствора, нагретого до 37 °С (460 мг хлористого натра + 1 мл 40% раствора глюкозы + 65 мл дистиллированной воды). Из вымытого таким образом костного мозга готовят равномерную суспензию, к которой добавляют 1-процентный раствор трехзамещенного цитрата натрия (соотношение глюкозосолевого раствора и цитрата натрия 2:3). Раствор цитрата натрия следует приливать медленно, небольшими порциями, в течение 5 мин. Этим достигается мягкость и постепенность гипотонической обработки, которую проводят в термостате при 37 °С в течение 25 мин. Описанный метод гипотонической обработки используют для костного мозга мышей. Для других животных концентрацию гипотонического раствора и продолжительность обработки подбирают опытным путем.

Все последующие операции (фиксация, приготовление препаратов, окрашивание), производятся так же, как и при приготовлении препаратов из культуры лейкоцитов периферической крови. Как минимум, для одной дозы необходимо проанализировать 300 метафаз (по 50 на одно животное).

Хромосомный анализ. Обучение технике анализа должно проводиться в специальных лабораториях (ВНИИГИНТОКСе и др. специальных учреждениях).

Изучение хромосом проводят на метафазных пластинках препаратов. Применяют микроскопы МБИ-3, МБИ-6. Предварительное изучение препаратов осуществляется при малом увеличении (10 х 20). При этом подсчитывают митотический индекс, производят подбор метафазных пластинок, пригодных для зарисовки и микрофотографирования. Расположение метафазных пластинок в препарате учитывается по показаниям нониуса.

Для анализа выбирают метафазы, отвечающие, как минимум, следующим требованиям: отсутствие наложений хромосом, отсутствие артефактов, оптимальная степень спирализации хромосом.

Анализ метафазных пластинок проводят при большом увеличении (10 х 90). Каждая пластинка, учитываемая в дальнейшем при анализе кариотипа, зарисовывается или фотографируется. При анализе учитывается любое отклонение от нормы числа или морфологии хромосом. С этой целью на зарисованных пластинках определяют:

1) модальное число хромосом (в норме в соматических клетках человека равно 46, мышей - 40);

2) отклонение от модального числа хромосом в сторону уменьшения или увеличения (гипо- или гипердиплодия);

3) структурное нарушение хромосом или аберрации (одиночные и парные фрагменты, дицентрики, кольцевые хромосомы, симметричные и ассиметричные обмены и др.).

При анализе хромосом человека идентифицируют все хромосомы согласно Денверской номенклатуре (Е.Ф. Давиденкова "Хромосомные болезни человека", изд. "Медицина", 1965, с. 11).

Проводят микрофотографирование нескольких нормальных метафазных пластинок и всех метафаз с отклонением от нормы. Результаты оформляют в виде таблицы (см. табл. 7).

Таблица 7

УЧЕТ ХРОМОСОМНЫХ НАРУШЕНИЙ

┌──────────┬──────────┬──────────┬───────────────┬───────────────┬───────────────┐

│ Характер │Экспозиция│Количество│Число метафаз с│ Отклонения от │ Общее число │

│ затравки │(в часах) │проанали- │ хромосомными │ модального │ нарушений │

│(вещество,│ │зированных│ аберрациями │числа хромосом │ │

│ доза) │ │метафаз ├─────┬─────────┼─────┬─────────┼─────┬─────────┤

│ │ │ │всего│ в │всего│ в │всего│ в │

│ │ │ │ │процентах│ │процентах│ │процентах│

├──────────┼──────────┼──────────┼─────┼─────────┼─────┼─────────┼─────┼─────────┤

│Опыт │ │ │ │ │ │ │ │ │

│Контроль │ │ │ │ │ │ │ │ │

└──────────┴──────────┴──────────┴─────┴─────────┴─────┴─────────┴─────┴─────────┘

Наряду с этим определяют уровень спонтанных хромосомных нарушений (контроль без воздействия веществом). По данным литературы, частота спонтанных хромосомных аберраций в клетках костного мозга равна:

для мыши - 2,7%;

для крысы - 1,18%;

для морской свинки - 1,81%;

для кролика - 1,96%;

для обезьяны - 0,69%

(О.Т. Мовчан и др., Цитология, 1967, IX, N 7, 864 - 870).

Учитывая, что цитогенетический эффект вещества может явиться результатом как прямого взаимодействия его с хромосомами, так и результатом влияния его метаболитов, основным показателем при определении цитогенетической опасности следует считать данные, полученные в опытах in vivo, то есть на клетках костного мозга.

Вещество является цитогенетически активным, если при его воздействии число хромосомных нарушений превышает уровень спонтанных аберраций для данного вида животных.

е) Исследование бластомогенных свойств пестицидов

При изучении бластомогенной опасности пестицида необходимо использовать "Методическое письмо по исследованию бластомогенных (канцерогенных) свойств различных веществ в опытах на животных" (1969).

Практически для эксперимента годятся все виды теплокровных животных, но

самым распространенным объектом исследований являются мыши и крысы. Эти

животные имеют сравнительно небольшой срок жизни (до 3 лет) и наиболее

чувствительны к различным канцерогенным агентам. В опытах лучше

использовать линейных мышей и крыс, у которых известна частота и

локализация спонтанных опухолей. Среди линейных мышей имеются высокораковые

(чувствительные), как, например, линия А, у которых часто встречаются

спонтанные опухоли легких и печени, и низкораковые (малочувствительные) С

черные, СС и др. Используют также крыс разводки Вистар. Если опыты

проводятся на линейных животных, в частности мышах, желательно испытывать

пестицид на высоко- и, обязательно, низкораковых линиях.

Количество животных в группах должно быть достаточно большим для

получения достоверных результатов. Это обстоятельство особенно нужно

учитывать при исследовании препаратов, обладающих кумулятивным свойством. В

опыт надо брать не менее 150 животных. Обязателен соответствующий чистый

контроль, количество животных для которого рассчитывается по формуле:

К = х \/n, где х - количество животных, а n - количество групп.

Необходимо иметь группу животных (150), которым параллельно вводится

заведомо известный канцероген (эталон). Например, уретан - при испытании

группы производных карбаминовой кислоты, 3,4-бензпирен - при исследовании

полициклических ароматических углеводородов и т.д.

Подопытные и контрольные животные должны содержаться в одинаковых условиях. Опыты необходимо ставить на молодых животных, поскольку они более чувствительны к канцерогенам. Желательно, чтобы самок и самцов было поровну. Они должны содержаться раздельно.

Прежде чем приступить к исследованию пестицида на его возможную бластомогенность, экспериментатор должен располагать сведениями о его физико-химических свойствах и иметь данные первичной токсикологической оценки. Необходимо ставить эксперимент, максимально приближая его к естественным условиям возможного контакта людей с пестицидом.

Если в процессе работы создаются условия контакта кожных покровов с пестицидом, при постановке эксперимента на животных следует наносить препарат на кожу в концентрациях, рекомендуемых для практики. Они не должны вызывать раздражающего действия. Препарат наносится на выбритый участок спины (размером 1 х 1 см) не реже 1 - 3 раз в неделю в течение года. Растворитель должен обладать минимальным токсическим и раздражающим действием. Животное держат в фиксированном положении до высыхания раствора. Контрольным животным необходимо наносить только растворитель соответствующей концентрации, в том же объеме и в те же сроки. Наблюдения над животными ведутся в течение 2 лет.

Если препарат может попадать в организм в виде остатков с пищевыми продуктами, то его вводят животным через рот с помощью зонда или добавляют к пище. Первый способ для более точной дозировки исследуемого вещества предпочтителен. Пестицид вводится в максимально переносимой дозе 2 - 3 раза в неделю с тем, чтобы было осуществлено 50 таких введений. После этого мыши низкораковой линии должны наблюдаться на протяжении всей их жизни - 2 - 2,5 года. Параллельно ставятся опыты на таких же животных с ежедневным скармливанием им в течение 2 - 2,5 лет дозы в 2 - 10 раз меньше пороговой, установленной в остром опыте (в зависимости от кумулятивных свойств). Если в этом случае - в процессе опыта - будет обнаружена бластомогенная активность пестицида, необходимо сразу же испытать количества препарата, которые могут реально попасть в организм человека. Если известно, что исследуемое вещество относится к группе заведомых канцерогенов, можно сократить срок исследований до одного года.

В случае возможности попадания пестицидов в организм через дыхательные пути эксперимент проводят с ингаляционным или интратрахеальным введением. Затравка животных проводится максимально переносимыми концентрациями препарата, установленными в остром опыте, 2 - 3 раза в неделю, всего 50 раз. После этого мыши низкораковой линии или крысы должны находиться под наблюдением до их естественной гибели.

Параллельно следует провести опыты с одним из добавочных методов введения (подкожным, парэнтеральным, введением в мочевой пузырь).

Если препарат способен проникать через плаценту, можно применить ускоренный метод определения его бластомогенной опасности. Для этого беременным мышам линии А, начиная с 13-го дня от момента зачатия, внутрибрюшинно или через рот вводят ежедневно или через день исследуемое вещество в максимально переносимой дозе. У родившегося потомства спустя 2 - 5 месяцев исследуют органы с целью обнаружения опухолей.

После окончания экспериментов всех оставшихся в живых животных убивают и тщательно макроскопически исследуют: должно быть определено число, локализация, размеры и вес опухолей. Все обнаруженные опухоли подвергают патоморфологическому исследованию для установления их подлинности и злокачественности. После этого вычисляется процент опухолей. Необходимо также тщательно исследовать всех животных, павших на всем протяжения эксперимента. При обнаружении опухолей нужно фиксировать сроки их появления.

При этом процент опухолей необходимо выводить, учитывая всех животных -

забитых в конце эксперимента и павших (с опухолями и без них). При наличии

множественных опухолей, как, например, аденом легких, необходимо вывести

индекс (аденома - мышь), то есть подсчитать общее количество аденом или

других опухолей у всех животных каждой группы и разделить их на количество

мышей. Полученные результаты обрабатываются статистически для установления

достоверности и определения теста "Т" и "хи ".

На основании результатов исследований изучаемый препарат относят к соответствующей группе по классификации Л.М. Шабада.

1. Вещества, канцерогенные Известно возникновение рака у людей,

для человека сильные канцерогены в опытах на животных

2. Сальные канцерогены для Вызывают в короткие сроки в большом

животных проценте опухоли у животных,

бластомогенность для человека еще не

доказана, но вероятна

3. Слабые канцерогены Вызывают опухоли менее чем у 20%

животных в поздние сроки

4. Подозрительность на Испытания на животных дают сомнительные

канцерогенность результаты.

5. ИЗУЧЕНИЕ АЛЛЕРГЕННЫХ СВОЙСТВ ХИМИЧЕСКИХ ВЕЩЕСТВ

Общие сведения к постановке эксперимента

В основу определения аллергенных свойств химических веществ может быть положено воспроизведение различных экспериментальных моделей аллергии (анафилактического шока, бронхиальной астмы, кожных аллергических реакций), а также реакций изолированных органов сенсибилизированных животных (легких, кишечника, матки и др.).

Индукция аллергического состояния как путем активного воспроизведения гиперчувствительности, так и ее пассивного переноса, включает три этапа: активную или пассивную сенсибилизацию животного (предварительная подготовка), стадию инкубации (преанфилактический период) и стадию разрешения (пробу на наличие и степень анафилактического состояния).

Аллергологические эксперименты проводятся с положительным результатом на различных видах животных (морских свинках, кроликах, крысах, белых мышах и т.д.). О пригодности того или иного вида животных для подобного рода опытов судят по: а) легкости, с которой удается их сенсибилизировать; б) интенсивности проявления клинических симптомов при воздействии разрешающей дозы аллергена; в) влиянию на ход сенсибилизации индивидуальных факторов. По мнению аллергологов, более всего отвечают перечисленным требованиям морские свинки, особенно в том случае, если надо проводить активную сенсибилизацию малыми дозами аллергена. Поэтому для воспроизведения модели анафилактического шока и экспериментальной бронхиальной астмы более всего пригодны морские свинки, для индукции местных аллергических реакций, в частности кожных, - морские свинки, кролики, крысы.

В опыт следует брать морских свинок весом 250 - 350 г, по возможности альбиносов. Средний вес кроликов должен составлять 2 - 3 кг. Как в опыте, так и в контроле должно быть использовано не менее 10 животных.

Чрезвычайно важен правильный выбор режима сенсибилизации животного, то есть определение дозы аллергена, пути его введения, частоты и числа введений аллергена в организм, длительности интервалов между ними, продолжительности инкубационного (скрытого) периода в процессе выработки аллергического состояния, величины разрешающей дозы аллергена, путей его введения и, наконец, длительности сенсибилизации организма в целом. По этому поводу А.Д. Адо указывает, что сенсибилизирующий эффект различных антигенов зависит от количества введенного вещества, его качественных особенностей и физического состояния. Большую роль в экспериментальной провокации аллергического процесса, особенно химическими аллергенами, могут сыграть специфическая и неспецифическая сенсибилизация; применение в ходе индукции аллергии стимуляторов выработки антител (адъюванта Фрейнда <1> и др.). Экспериментальные данные свидетельствуют о том, что адъювант предохраняет антиген от разрушения, замедляет его всасывание из места инъекции и вызывает пролиферацию клеток, вырабатывающих антитела (Н.В. Медуницын).

--------------------------------

<1> Полный стимулятор Фрейнда состоит из 1 части безводного ланолина, 2 частей вазелинового масла, 2 мг/мл убитых туберкулезных бактерий и мертиолата из расчета 1:10000. При сенсибилизации морских свинок в подушечки лапок вводят 0,2 мл стимулятора (по 0,05 мл в подушечку каждой лапы).

Процесс аллергизации химическими веществами при их парентеральном и ингаляторном введении активнее всего происходит при строгом соблюдении следующих условий:

1. Многократном прерывистом поступлении аллергена (не менее 3 - 5-разовом).

2. Введении аллергена с интервалами длительностью 3 - 5 - 7 дней.

3. Соблюдении инкубационного периода продолжительностью не менее 14 дней.

4. Количественном превышении разрешающей дозы аллергена над его суммарной дозой, использованной в ходе сенсибилизации животного.

5. Доведении общей длительности воспроизведения аллергического состояния в среднем до 30 - 40 дней.

Многократное, но ежедневное введение химического вещества этими же путями без соблюдения прерывистости приводит к преимущественному проявлению токсического эффекта.

Аллергологический эксперимент проводится вслед за установлением параметров токсичности препарата при однократном воздействии.

Воспроизведение анафилактического шока. Из возможных экспериментальных моделей аллергических состояний анафилактический шок является одним из наиболее простых в постановке. Его воспроизведение лучше осуществлять на морских свинках. Животных сенсибилизируют пятью инъекциями с 3-, 5- и 7-дневными промежутками между ними. Интервалы следует подбирать так, чтобы общее количество дней, потраченное на сенсибилизацию, вместе с инкубационным сроком (14 - 21 день) составляло 30 - 40 дней.

При расчете разовой дозы вводимого вещества и процента рабочего раствора аллергена следует исходить из пороговой дозы, установленной в остром токсикологическом эксперименте. Если к моменту исследований имеются данные о фактическом загрязнении внешней среды (пищевых продуктов, атмосферного воздуха, водоемов), то расчет разовой дозы ведется с учетом возможного суточного поступления препаратов в организм человека по следующей схеме: допустим, что в атмосферном воздухе в районе обследования обнаружена концентрация Х-вещества, равная 3,3 мг/куб. м; в сутки человек в среднем вдыхает 15 куб. м воздуха; следовательно, за это время поступит 3,3 мг/куб. м х 15 куб. м = 49,5 мг вещества.

Для пересчета на морскую свинку пользуемся следующими данными.

Средний вес человека составляет 70 кг, а продолжительность жизни - 70 лет. Соотношение этих двух показателей соответственно будет равно 70/70 = 1. Средний вес морской свинки, взятой в опыт, составляет 0,3 кг, а средняя продолжительность жизни - 3 года. Соотношение двух показателей составит 0,1. Следовательно, разница между указанным соотношением у человека и у морской свинки равна 10. Учитывая этот коэффициент, следует считать, что суточное поступление вещества в организм морской свинки должно быть в 10 раз меньше, чем в организм человека (49,5 : 10 = 4,9 мг или 5 мг). Объем инъецируемого раствора для морской свинки при подкожном введении равен 0,3 мл. Следовательно, разовая суточная доза химического вещества должна содержаться в рабочем растворе в такой пропорции:

0,3 мл - 5 мг

100 мл - Х

5 х 100 5000

Х = ------- = ---- = 1666 = 1,7 г вещества на 100 мл рабочего раствора.

0,3 3

Рабочий раствор аллергена готовят непосредственно перед началом опыта.

После окончания цикла сенсибилизирующих инъекций и скрытого периода (14 - 21 день) животным вводят внутрисердечно, внутрибрюшинно или подкожно разрешающую дозу аллергена (реинъекция). Начинают реинъекцию с контрольных (несенсибилизированных) животных, предварительно выявив их реакцию на разрешающую дозу аллергена и выбирают путь его введения с тем, чтобы исключить токсический эффект и возможность возникновения болевого шока. Величина разрешающей дозы должна быть равной или несколько превышать суммарную дозу, взятую для сенсибилизации. Концентрация раствора остается такой же, как при сенсибилизации.

При внутрисердечном пути введения симптомы анафилактического шока проявляются очень быстро (максимум через 10 мин.).

Внутрибрюшинная или подкожная разрешающая инъекция вызывает ослабленную и затяжную анафилактическую реакцию.

Сравнивают состояние контрольных (несенсибилизированных) и подопытных (сенсибилизированных) животных. Последние, как уже отмечалось, могут отреагировать на разрешающую инъекцию либо острым, либо затяжным анафилактическим шоком. В первом случае, по классическим описаниям исследователей (Н.Н. Сиротинин, Р. Дерр, В. Бойд, Л.А. Зильбер, Э. Райка и др.), клиническая картина шока развивается стремительно. Продромальные явления в виде своеобразных вынужденных движений, взъерошивания шерсти, грызущих движений челюстями, чесания мордочки, обусловленного зудом, наблюдаются в первые же минуты. Далее наступает одышка. Свинка приходит в состояние коллапса, падает на бок, судорожно перебирая лапками. Нередко имеет место непроизвольное мочеотделение и дефекация. В течение 3 - 10 минут животное экзетирует от асфиксии (бронхоспазм).

Что касается затяжной формы шока, то она может возникнуть либо самостоятельно, либо являться продолжением острого шока. Обычно затяжной шок длится от 15 минут до 5 и более часов и либо наступает смерть, либо восстанавливается нормальное состояние животного. При такой форме анафилактического шока все симптомы развиваются медленнее, слабее: прежде всего у животных появляется резко выраженная депрессия, сопливый вид, полузакрытые или вовсе закрытые глаза, "мутный" взгляд, взъерошенная шерсть. При попытке передвигаться свинка шатается, в сидячем положении сохраняет позу "комочком". Одышка менее выражена. Часто, особенно в начале шока, появляется интенсивная дрожь, снижается температура тела. При далеко зашедшей депрессии животное падает и лежит на боку. По мере затихания этих явлений и возвращения к нормальному состоянию животное как бы просыпается после глубокого сна, быстро поднимается на лапы, начинает бегать и обнюхивать камеру. На вскрытии в легких выявляются точечные кровоизлияния, эмфизематозность, иногда отек. Во внутренних органах и в нижней части диафрагмы наблюдаются небольшие кровоизлияния. Контрольных животных также подвергают патологоанатомическому исследованию.

Оценку интенсивности анафилактического шока целесообразно осуществлять дифференцированно:

(+) - единичные признаки шока (почесывание мордочки, взъерошивание шерсти, грызущие движения челюстей);

(++) - легкая форма анафилактического шока (все признаки без коматозного состояния);

(+++) - шок средней тяжести (с кратковременной комой);

(++++) - тяжелая форма шока с несколькими приступами коматозного состояния;

(+++++) - шок со смертельным исходом.

Воспроизведение экспериментальной бронхиальной астмы

В тех случаях, когда речь идет о возможной "дыхательной" аллергии, эта модель аллергического состояния, естественно, рассматривается как наиболее адекватная.

Для ее воспроизведения необходимы высокая степень сенсибилизации животного и тонкое распыление вещества во вдыхаемом воздухе (не более 5 микрон), обеспечивающее максимальное проникновение аллергена через альвеолярную стенку, служащую своего рода биологическим барьером для всасывания аллергена в кровь. Поэтому для осуществления эксперимента надо иметь соответствующий распылитель и замкнутую камеру, в качестве которой можно использовать любой стеклянный сосуд (бутыль без дна, вегетационный сосуд, аквариум), снабженный плотно прилегающей крышкой с двумя небольшими отверстиями. В одно вставляется трубка распылителя, другое служит для удаления избытка подаваемого воздуха.

Морских свинок сенсибилизируют 3-, 5- или 7-кратной ингаляцией или подкожными инъекциями химического вещества (можно со стимулятором). Расчет разовой и суммарной дозы аллергена при подкожном введении производят по вышеописанному принципу. Интервалы между инъекциями - 3 - 5 дней. По истечении инкубационного периода (14 - 21 день), сенсибилизированных животных вместе с группой контрольных (несенсибилизированных) помещают в камеру и подвергают ингаляторному воздействию разрешающей дозы аэрозоля химического аллергена (без стимулятора). Для создания высокодисперсного аэрозоля можно использовать ингалятор "Вадемекум" системы Кобера, выпускаемый промышленностью ГДР. Он позволяет создавать аэрозоль с величиной частиц до 0,5 микрона. Описание устройства и эксплуатации ингалятора изложено в аннотации к прибору.

Распыление разрешающей дозы аллергена с помощью ингалятора должно длиться, примерно, 60 минут. Величину ингаляторной дозы аллергена следует рассчитывать с учетом:

1) пороговой дозы, установленной в ингаляционном остром токсикологическом эксперименте для нового препарата, либо фактического содержания вещества в атмосферном воздухе;

2) возможного суточного поступления вещества в организм животного через дыхательные пути (определяется на основе расчета поступления человеку);

3) веса животного, его возраста, продолжительности жизни, емкости легких и количества дыхательных движений в 1 минуту;

4) объема затравочной камеры и емкости корпуса ингалятора.

Исходя из сказанного, даем примерный расчет ингаляторной дозы аллергена.

Как известно, дыхательный объем легких морской свинки в среднем равен 0,33 мл/мин. на 1 г веса. При весе животного 300 г он составит 300 х 0,33 = 99 мл/мин. Так как в дыхательных путях задерживается до 33% вдыхаемого воздуха, то в течение 60-минутной экспозиции животных в камере в легких свинки задерживается 33 х 60 = 1980 мл, то есть около 2 л воздуха.

Допустим, что концентрация рабочего раствора химического аллергена равна 1,7%, а его разовая среднесуточная доза для морской свинки при подкожном введении составляет 0,3 мл (на основании пересчета среднесуточного поступления аллергена из воздуха человеку). При этом 0,3 мл указанного раствора аллергена будут содержать 0,005 г химического вещества. Следовательно, при ингаляторной подаче аллергена эти 0,005 г вещества должны поступать морской свинке с вдыхаемым воздухом (2 л в течение 60 мин.). При емкости камеры 20 л расчет количества аллергена следующий:

2 л - 0,005 г

20 л - Х

0,005 х 20 0,1

Х = ---------- = --- = 0,05 г.

2 2

Чтобы определить нужное количество аллергена в виде 1,7% раствора,

делаем перерасчет:

1,7 г - 100 мл раствора

0,05 г вещества - Х

0,05 х 100 5

Х = ---------- = --- = 3 мл раствора.

1,7 1,7

Таким образом, за 60 мин. в качестве разовой ингаляторной дозы необходимо распылить 3 мл раствора аллергена.

Расчет разрешающей ингаляторной дозы аллергена производится аналогично приведенному примеру. При этом лишь следует увеличить разовую среднесуточную дозу аллергена (в нашем случае 0,005 г) в 5 - 10 раз.

Первые симптомы экспериментальной бронхиальной астмы у животных: беспокойство, экспираторная одышка и периодический кашель. Животные принимают характерную для состояния удушья "собачью" позу с растопыренными передними лапами. Шерсть взъерошивается, животное застывает на месте, как бы прислушиваясь к чему-то и боясь сделать лишнее движение. Иногда в области живота наблюдаются внутренние судорожные толчки, напоминающие рвотные движения. В тяжелых случаях описанное состояние заканчивается падением животного на бок, судорогами конечностей и смертью. Если животное не погибает, то, как только проходят перечисленные клинические явления, свинка принимает нормальный вид до следующего приступа. Их может быть два-три в течение часа, в зависимости от степени сенсибилизации животного и силы аллергена. На вскрытии у погибших животных обнаруживают эмфизему легких с участками ателектаза, в просвете бронхов - слизь. При гистологическом исследовании отмечается массивная инфильтрация эозинофилами перибронхиальной ткани, межальвеолярных перегородок и под слизистой бронхов.

Метод эпикутанных аппликаций

Так как при работе с пестицидами не исключается непосредственный контакт кожи с препаратом, а, следовательно, и возможность развития аллергических дерматитов и экзем, в качестве наиболее адекватного метода экспериментального выявления аллергенных свойств рекомендуются накожные аппликации. В этом случае, как и при воспроизведении других аллергических реакций, должны быть предусмотрены следующие обязательные этапы эксперимента:

- предварительная подготовка животного путем более или менее длительного, повторного контакта его кожи с препаратом;

- применение химического вещества в определенной концентрации;

- соблюдение скрытого периода между сенсибилизирующими и разрешающей аппликацией пестицида.

Согласно рекомендациям Н.И. Шумской, О.Г. Алексеевой и Н.Н. Кулагиной и других исследователей опыты следует проводить на 2 - 3 видах лабораторных животных молодого возраста (морских свинках, кроликах, крысах). М.Л. Гершанович считает, что наиболее чувствительными к индукции аллергических контактных дерматитов являются морские свинки-альбиносы.

Перед началом эксперимента обязательно ставят предварительный опыт для оценки первично-раздражающего действия пестицида путем однократных накожных аппликаций в нативном виде и в различных разведениях (1:10, 1:50, 1:100 и так далее). Опыт заканчивается определением концентрации, которая при разовом воздействии не вызывает реакции нормальной кожи животного.

Режим сенсибилизации предусматривает многократные (5 - 30) аппликации изучаемого вещества на один и тот же участок кожи в концентрации, которая была установлена в предварительном опыте. Показанием к прекращению дальнейших аппликаций служит развитие выраженного контактного дерматоза.

Перед аппликацией на спине животного предварительно выстригают кожу на площади 1,5 х 2 см или 2 х 3 см. У кроликов аппликации рекомендуют делать в направлении от шеи к хвосту, а у морских свинок - от задней трети спины к голове. В зависимости от растворимости пестицида, его можно применять в виде раствора (водного, спиртового, на ацетоне и т.д.), эмульсии либо мази (на вазелиновой основе). Аппликацию осуществляют нанесением 0,1 мл или капли раствора на поверхность кожи, выдерживают 4 часа, а затем удаляют.

По истечении инкубационного периода (14 - 21 день после последней аппликации) на свежевыстриженный участок кожи, той же или противоположной части спины наносят разрешающую дозу изучаемого препарата. При этом используют раствор, эмульсию или мазь в концентрации, примененной в ходе сенсибилизации животного в нескольких разведениях (титры сенсибилизации). Спустя 12 - 24 часа на месте разрешающей аппликации возникает аллергическая реакция разной интенсивности, сопровождающаяся эритемой, инфильтрацией, а порой изъязвлением и некрозом ткани.

Аллергическую реакцию оценивают в баллах с учетом сенсибилизирующей дозы и различных разведений вещества.

Как и в других случаях, сила аллергена устанавливается на основе следующих критериев: величины сенсибилизирующей дозы, скорости и частоты развития аллергической реакции, величины титра сенсибилизации. В соответствии с этим, к сильным аллергенам, по данным, полученным при воспроизведении вышеописанной модели аллергии, относят тот препарат, который при небольшом числе (до 10) кожных аппликаций в разведении не менее чем 1:100 вызвал аллергическую реакцию у большинства подопытных животных (Н.И. Шумская, О.Г. Алексеева, Н.Н. Кулагина).

По силе аллергенного действия различают:

1. Сильный аллерген, который дает не менее 80% случаев аллергических реакций с быстрым развитием и выраженным проявлением всех клинико-морфологических признаков аллергии.

2. Средней силы аллерген, если положительная аллергическая реакция отмечается у 50 - 80% животных и вызывает большинство клинико-морфологических признаков.

3. Слабый аллерген, если положительная аллергическая реакция наблюдается менее чем у 50% животных. Клинико-морфологические признаки аллергии выражены слабо и неполностью.

Если вещество относится к сильным аллергенам, должен быть сделан вывод о нецелесообразности его внедрения в сельскохозяйственную практику.

В тех случаях, когда исследуемое вещество является слабым или средней силы аллергеном, это необходимо учитывать при выборе коэффициента запаса для установления предельно допустимой концентрации данного вещества в различных средах.

6. ЗАКЛЮЧЕНИЕ ПО ИЗУЧЕНИЮ ТОКСИЧЕСКИХ СВОЙСТВ ПЕСТИЦИДА

В заключении должны быть сведения: о параметрах токсичности; зоне токсического действия; пороговых концентрациях и дозах при однократном и длительном (ингаляционном и пероральном) поступлении в организм с указанием сроков; о свойстве оказывать местное действие на кожу и слизистую оболочку и проникать через кожные покровы (дозы при однократном и повторном нанесении); о клинической симптоматике отравления с указанием основных точек приложения и наиболее чувствительных к данному яду органов и систем; рекомендации по вопросам диагностики отравления.

В заключении излагаются результаты исследований по выяснению всевозможных неблагоприятных отдаленных последствий влияния на организм (гонадотоксическое, эмбриотоксическое, мутагенное, бластомогенное), приводятся данные о кумулятивных свойствах препарата и коэффициенте кумуляции при поступлении через желудочно-кишечный тракт, свойстве выделяться с молоком.

На основании всех материалов исследуемый препарат относят к соответствующим группам по классификации пестицидов и приходят к выводу о степени выраженности и способности вызывать острое и хроническое отравление, прогнозируют возможность неблагоприятных отдаленных последствий. На основании данных о патогенных свойствах пестицида решается вопрос о целесообразности дальнейших исследований в аспекте гигиенических требований.

III. ИССЛЕДОВАНИЯ ПО ГИГИЕНЕ ПРИМЕНЕНИЯ ПЕСТИЦИДОВ

1. ИЗУЧЕНИЕ ЦИРКУЛЯЦИИ ПЕСТИЦИДОВ ВО ВНЕШНЕЙ СРЕДЕ

И КОМПЛЕКСНЫЙ ПОДХОД К ГИГИЕНИЧЕСКОМУ НОРМИРОВАНИЮ

Решение вопроса о возможности внедрения нового пестицида в народное хозяйство должно базироваться, с одной стороны, на данных о токсичности и других эффектах действия его на теплокровных и, с другой стороны, - на материалах, характеризующих поведение пестицида во внешней среде. Такой подход позволяет определить количество препарата, которое может поступить в организм из разных объектов внешней среды и оценить реальную опасность в связи с его применением.

Имеется ряд специфических особенностей при изучении вопросов гигиены применения пестицидов. Установленный факт циркуляции пестицидов в природных условиях поднимает ряд специальных вопросов, решение которых требует компетенции гигиенистов труда, питания, коммунальной гигиены. Только при условии тесной взаимосвязи, то есть решения вопроса с позиции общей гигиены, могут быть изучены особенности поведения пестицидов в природных условиях - характер и длительность накопления в разных средах, динамика концентраций остаточных количеств и метаболитов в растениях, воде, воздухе, почве, способность к передвижению из одной среды в другую, количественные отношения при перемещении в разных средах и др.

С этой целью необходимо исследовать в динамике поведение каждого пестицида в природе с момента его поступления во внешнюю среду. Необходимо выяснить концентрации препаратов в воздухе рабочей зоны, характер и степень загрязнения ими кожных покровов, защитной одежды, возможность поступления их через кожу.

Крайне важно определить поведение препарата в воздухе не только рабочей зоны в период применения, но и в последующие часы и дни. Это позволяет установить допустимые сроки выхода на работу после применения препаратов. Известно, что снос пестицидов от мест обработки может быть весьма значительным (до 20 км). Для профилактики загрязнения внешней среды важно установить причины, обусловившие рассеяние пестицидов от мест обработки. С этой целью надо определить зависимость между степенью рассеивания и условиями их применения. Установлено, что на снос пестицидов оказывает влияние дисперсность частиц аэрозоля, высота, на которой проводится распыление препарата, метеорологические условия и др. Важно выяснить, как долго длится загрязнение воздушной среды после обработки, какова роль вторичного загрязнения воздуха, связанного с оседанием препаратов на поверхности растений, почвы и повторным поступлением в воздух.

Одним из центральных разделов исследований по гигиене применения пестицидов является изучение характера и уровня фактического загрязнения пищевых продуктов. На величину остаточных количеств пестицидов в пищевых продуктах оказывают существенное влияние: норма расхода препарата, форма, концентрация рабочих составов, кратность, сроки и способ обработки. При изучении фактического загрязнения пищевых продуктов необходимо учитывать все эти факторы.

Большое практическое значение имеет установление сроков ожидания (период времени от последней обработки до сбора урожая).

Правильное определение этого регламента и его соблюдение составляют основу профилактики загрязнения пестицидами пищевых продуктов.

С позиций гигиены серьезную опасность представляет накопление пестицидов в водоемах и почве.

Установлено, что в водоем пестициды могут поступать с грунтовыми, талыми, дождевыми водами, в результате сноса с обработанных участков и попадания из атмосферы и, наконец, их непосредственно вносят в водоемы со специальными целями.

Оценка уровня загрязнения воды должна проводиться не только на основании определения степени опасности при употреблении воды, но и с учетом возможности накопления и концентрирования пестицидов в последующих звеньях - рыбе и водоплавающей птице. Так, количество ДДТ, обнаруживаемое в рыбе, может в десятки и сотни раз превышать содержание его в воде.

Аналогичная зависимость наблюдается в почве. Установлено, что при загрязнении почвы некоторыми пестицидами возможно значительное увеличение концентрации их в корне и клубнеплодах по сравнению с содержанием в почве.

Итак, почва и вода могут явиться одним из основных звеньев в цепи циркуляции пестицидов на пути почва - растения - человек, почва - вода - рыба - человек.

Таким образом, свойство пестицидов циркулировать в природных условиях создает возможность одновременного поступления в организм человека одного и того же вещества из различных объектов внешней среды. Это должно быть учтено при разработке гигиенических нормативов и регламентов применения пестицидов.

Принцип комплексного нормирования пестицидов состоит в том, что

суммарное количество препарата, которое может поступить в организм человека

из разных сред, не должно превышать максимально допустимую дозу для

человека (Д ), выражающуюся в мг/день.

Таким образом, допустимая суточная доза пестицида для человека составляет сумму допустимых количеств его в пищевом рационе, воде и атмосферном воздухе. Она выражается формулой:

Д = SUM Д ,

м i=1 i

где:

Д - максимально допустимая доза для человека;

Д - допустимая доза пестицида в пищевом рационе;

Д - допустимая концентрация в воде;

Д - допустимая концентрация в атмосферном воздухе.

Исследования по комплексному нормированию пестицида в разных объектах внешней среды включают следующие этапы:

1) токсикологические исследования, конечной целью которых является определение пороговой дозы;

2) установление Д для человека;

3) гигиенические исследования по разработке нормативов пестицидов в каждой среде.

Наряду с разработкой нормативов в объектах внешней среды, проводятся исследования с целью регламентации условий применения пестицидов.

2. ПОДХОДЫ К УСТАНОВЛЕНИЮ МАКСИМАЛЬНО ДОПУСТИМОЙ ДОЗЫ

ПЕСТИЦИДА (Д ) ДЛЯ ЧЕЛОВЕКА

Прежде всего определяется максимально безвредная доза (Д ) для

животных, которая представляет собой подпороговую дозу, установленную в

хроническом эксперименте на наиболее чувствительных животных. При наличии

данных об отдаленных неблагоприятных эффектах, вызываемых исследуемым

веществом, пороговая доза устанавливается с учетом этих данных по

лимитирующему показателю.

Максимально безвредная доза для животных выражается в мг/кг веса.

При определении Д для человека учитывают:

1) величину Д для животных;

2) степень выраженности кумулятивных свойств;

3) стойкость пестицида к факторам внешней среды;

4) свойство выделяться с молоком и оказывать отрицательное влияние на потомство;

5) место изучаемого пестицида в гигиенической классификации (по материалам исследований патогенных свойств);

6) материалы о сравнительной чувствительности к веществу человека и животных. Эти данные получают при сопоставлении результатов исследований об изменении физиологических и биохимических показателей у работающих при контакте с пестицидами с результатами экспериментальных исследований.

С этой целью используются также данные литературы об изучаемом препарате и пестицидах, близких к нему по химической структуре.

На основании этих материалов определяется коэффициент запаса при

переходе от Д для животных к Д для человека.

м м

Под коэффициентом запаса понимают величину, показывающую, во сколько

раз должна быть уменьшена безвредная доза для животных (Д для животных)

при установлении максимально допустимой дозы для человека (Д для

человека).

Накопленный опыт позволяет рекомендовать следующий порядок величин

коэффициента запаса:

а) для препаратов, обладающих большой стойкостью к факторам внешней

среды и выраженными кумулятивными свойствами (относящихся ко II группе

гигиенической классификации пестицидов), Д которых для животных составляет

десятые доли мг/кг, рекомендуется коэффициент запаса, равный 100;

б) для стойких препаратов, обладающих выраженными кумулятивными

свойствами, Д которых для животных - 1 - 5 мг/кг, рекомендуется

коэффициент запаса, равный 100 - 50;

в) для препаратов, обладающих умеренной стойкостью и умеренной или

слабой кумуляцией (III и IV группы гигиенической классификации) со

значением Д для животных более 5 мг/кг, рекомендуется коэффициент запаса

50 - 30.

С учетом выбранного запаса устанавливается Д для человека.

Пример расчета для установления максимально

допустимой дозы пестицида для человека

Предположим, что подпороговая доза пестицида для наиболее чувствительных животных, определенная в хроническом эксперименте длительностью 10 - 12 месяцев, равна 0,2 мг/кг.

Нормируемое вещество обладает большой стойкостью к факторам внешней среды и выраженной кумуляцией.

Коэффициент запаса для такого естества равен 100.

Таким образом, на 1 кг веса человека допускается 0,2 мг / 100 = 0,002 мг.

Учитывая, что продукты питания, содержащие остатки пестицидов, употребляют не только взрослые, но и дети, средний вес человека принимают за 50 кг. Тогда максимально допустимая суточная доза данного вещества для человека будет:

0,002 мг/кг х 50 кг = 0,1 мг.

Для определения удельного значения разных объектов внешней среды в

общей Д для человека следует использовать данные о фактическом содержании

в них остатков пестицидов.

Обобщение имеющихся материалов о загрязнении внешней среды различными пестицидами показало, что основное количество стойких препаратов находят в пищевых продуктах. Так, например, установлено, что 0,95 от общей допустимой суточной дозы для человека ДДТ может поступать в организм с пищевыми продуктами, 0,047 - с водой и 0,003 - с атмосферным воздухом. Исходя из этого, рассчитывают допустимые количества ДДТ для каждой среды.

Для пищевых продуктов это будет Д = Д х 0,95;

1 м

для воды Д = Д х 0,047;

2 м

для атмосферного воздуха Д = Д х 0,003.

3 м

3. ГИГИЕНИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ УСЛОВИЙ ПРИМЕНЕНИЯ ПЕСТИЦИДОВ

И ИХ НОРМИРОВАНИЕ В ВОЗДУХЕ РАБОЧЕЙ ЗОНЫ

Этапы работы.

1. Изучение фактического загрязнения зоны дыхания работающих в зависимости от различных условий применения пестицидов.

2. Изучение физиологических и биохимических показателей состояния здоровья людей, работающих с пестицидами.

3. Подход к нормированию содержания пестицидов в воздухе рабочей зоны.

4. Регламентация условий применения пестицидов.

Изучение условий труда при применении пестицидов начинают с санитарного описания. Отмечают место проведения обработки (район, область, республика), дату исследования, наименование организации (колхоз, совхоз). Указывают название пестицида, норму расхода и форму препарата, концентрацию рабочего раствора, отмечают, впервые или повторно в этом сезоне проводится обработка.

Описывают трудовой процесс: характер и последовательность рабочих операций, рабочую позу, режим труда и отдыха (по материалам хронометража рабочего дня). Следует указать, снабжаются ли работающие спецодеждой, респираторами, где хранят индивидуальные средства защиты, как они дегазируются.

а) Изучение фактического загрязнения воздуха зоны

дыхания работающих

Дают характеристику методу (авиационный, наземный) и способу (опыливание, опрыскивание и др.) применения препарата. Выясняют содержание пестицида в воздухе рабочей зоны. Устанавливают зависимость концентрации препарата в воздухе от различных методов и способов его применения.

Отбор проб

Работу начинают с контрольных анализов. С этой целью до начала обработки объектов берут образцы воздуха. Затем с момента обработки до ее окончания в зоне дыхания рабочих отбирают заданное количество воздуха в соответствующие поглотители. Последнее определяется чувствительностью химического метода анализа. Следует проводить параллельный отбор проб, общее количество которых на каждом рабочем месте должно быть не менее 10.

Большое значение, особенно для малостойких пестицидов, имеет время, прошедшее с момента отбора пробы до проведения химического анализа, так как за этот период возможно разложение препарата. Следует стремиться к тому, чтобы это время было минимальным. При возможности, анализ надо проводить вблизи места обработки, что позволяет внести коррективы в план отбора проб (точки отбора, количество пропускаемого воздуха и др.).

В течение всего периода обработки замеряют температуру, влажность и скорость движения воздуха.

Для определения степени загрязнения кожных покровов работающих делают смыв с поверхности кожи или одежды (для этого к одежде прикрепляют полоски материи). Пробы отбирают с кожи лица, шеи, рук, с полосок материи, прикрепленных на уровне туловища и ног. Смывы с поверхности определенной площади производят специальными растворами.

Состав раствора, площадь участка зависят от метода определения и его чувствительности.

Для работающих пестициды могут представлять опасность не только при первичном поступлении в воздушную среду, но и в дальнейшем в результате вторичного поступления в воздух с поверхностей растений, почвы, с частицами пыли при взрыхлении почвы, а также через кожные покровы при соприкосновении рук с листьями, плодами и другими объектами, обработанными препаратом.

В связи с изложенным, пробы воздуха и смывы с поверхности растений и других объектов следует отбирать через определенные интервалы времени после обработки и до полного исчезновения препарата. Отбирают также пробы воздуха после рыхления почвы.

б) Изучение физиологических и биохимических показателей

состояния здоровья людей, работающих с пестицидами

Главная задача этих исследований - выявить изменения в состоянии рабочих и сопоставить выраженность их с концентрацией препарата в рабочей зоне. Поэтому при проведении соответствующих исследований необходимо, в первую очередь, получить исчерпывающую информацию об условиях, при которых произошло воздействие пестицида на организм человека. Важно выяснить возможность местного раздражающего и резорбтивного действия при поступлении через кожные покровы людей. Для выяснения этого вопроса следует ориентироваться на данные о степени загрязнения кожных покровов и учитывать изменения в организме работающих. Для исключения попадания пестицида через дыхательные пути наблюдения проводят на группе людей, пользующихся респираторами.

При оценке результатов наблюдений учитывают экспериментальные данные о токсичности препарата при поступлении через кожные покровы и дыхательные пути.

Перед началом исследований выделяют группу людей, которые будут работать с одним препаратом, проводят предварительный медосмотр. Надо собрать анамнез, обращая внимание на то, был ли в прошлом контакт с химическими веществами, сроки его и с какими именно пестицидами, а также учесть перенесенные и текущие заболевания (болезни центральной и вегетативной нервной системы, сердечно-сосудистой системы, паренхиматозных органов, у женщин - заболевания половой сферы, случаи выкидышей и мертворожденных детей).

Производят внешний осмотр, а также исследуют до начала работы и в процессе ее функциональное состояние организма по ряду физиологических и биохимических показателей. В качестве таких показателей следует использовать тесты, отражающие интегральную реакцию организма на возможные воздействия химических веществ и специфические изменения, вызываемые препаратами данной группы.

С этой целью можно рекомендовать определение температуры тела, частоты пульса, высоты кровяного давления (ортоклиностатическая проба, нагрузка приседанием), пороговой чувствительности обонятельного анализатора, времени адаптации и времени восстановления пороговой чувствительности.

Рекомендуется производить общий анализ морфологического состава периферической крови и исследования мочи.

Для выяснения возможного мутагенного действия пестицида в процессе наблюдения за работающими следует производить метафазный анализ культур лейкоцитов периферической крови (см. раздел II, глава 4). Эти исследования проводятся в случае выявления мутагенных свойств вещества в эксперименте.

Особое значение имеет использование ранних специфических показателей воздействия данного вещества на организм.

Показатели следует подбирать с учетом механизма действия препаратов таким образом, чтобы была возможность, хотя бы косвенно, судить о состоянии наиболее уязвимого органа или системы.

Так, у работающих с фосфорорганическими соединениями, большинство из которых является ингибиторами холинэстеразы, необходимо определять в крови активность этого фермента, у работающих с хлорорганическими пестицидами - состояние печени.

Для определения состояния печени проводится ряд функциональных проб и биохимических исследований: проба Квика-Пытеля, проба с бромсульфалеином, определение сахарных кривых при нагрузке галактозой.

Изучают некоторые показатели свертывающей системы крови (время свертывания, время кровотечения, протромбиновый индекс), белковый обмен (общий белок рефрактометрическим методом), лабильность белковых фракций (с помощью йодной пробы), производят качественное и количественное определение билирубина в сыворотке крови (микрометодом), определение уробилина в моче и др.; качественное и количественное определение белка в моче дает ориентировочное представление о состоянии почек, что важно при обследовании работающих с ртутно-органическими препаратами.

Также проводят исследование содержания ртути в их моче.

Большинство карбаматов является антиоксидантами, поэтому, обследуя работающих с ними, необходимо обращать внимание на активность окислительно-восстановительных ферментов. У лиц, контактирующих с ароматическими, нитро- и аминосоединениями, обязательным является изучение ряда показателей, характеризующих состояние крови (определение гемоглобина, метгемоглобина и эритроцитов, количественный учет ретикулоцитов, телец Гейнца и т.д.).

Для указанных исследований не требуется большого количества крови (ее берут из пальца).

Периодический осмотр, опрос работающих, вышеуказанные исследования необходимо осуществлять в течение всего периода работы с пестицидами.

Путем опроса выявляют возможные симптомы интоксикации (головную боль, головокружение, потерю аппетита, повышенную утомляемость, кровотечение из носа, царапанье в горле, кашель, тошноту, рвоту, боли в животе, понос, нарушение сна, повышенную возбудимость).

Необходимо обращать внимание на состояние кожных покровов и слизистых оболочек, это позволит заметить раздражающее действие препарата.

Периодичность исследований нельзя строго регламентировать, она зависит от характера работ, длительности контакта с ядом и устанавливается в каждом конкретном случае (не менее 3 - 4 раз). Следует учесть, что симптомы интоксикации могут также проявляться через некоторое время после окончания работы.

Поэтому исследования необходимо повторять через различные промежутки времени после прекращения контакта с пестицидами. Следует, если это возможно, проследить возвращение нарушенных показателей к исходному состоянию.

Лица, в организме которых выявлены патологические изменения, подлежат госпитализации и дальнейшему более глубокому обследованию.

Изучение биохимических и физиологических сдвигов у работающих с пестицидами и сопоставление полученных результатов с концентрациями этих веществ в воздухе, с содержанием их в смывах с кожи позволяет сделать вывод о количествах пестицидов, оказывающих влияние на организм человека.

в) Подход к нормированию содержания пестицида

в воздухе рабочей зоны

Нормирование пестицидов в воздухе рабочей зоны, имея ряд общих черт с нормированием других химических веществ, отличается специфическими особенностями. Поэтому рекомендуется руководствоваться требованиями, предъявляемыми при нормировании вредных веществ в воздухе производственных помещений, но одновременно учитывать особенности применения пестицидов.

Следует учитывать, что ПДК пестицидов в условиях сельского хозяйства, в отличие от ПДК вредных веществ в промышленности, имеет другое значение. Специфика сельского хозяйства требует создания высоких (эффективных) концентраций для обработки различных объектов с целью проявления пестицидного действия, поэтому не всегда представляется возможным снизить концентрации препарата в зоне дыхания до допустимого уровня.

Поэтому величина ПДК пестицидов может служить только ориентиром для сравнительной оценки различных способов и методов их применения, оценки машин и аппаратов, с помощью которых они используются.

Если при применении рекомендуемого способа или аппарата в зоне дыхания работающих создаются концентрации, превышающие ПДК, такой способ обработки или такая аппаратура должны получить отрицательную оценку.

Величина ПДК должна быть также ориентиром при регламентации допустимых сроков выхода людей на участки, обработанные пестицидами.

В тех случаях, когда технологический процесс требует проведения работ на обработанных участках раньше, чем снизится концентрация до ПДК, возникает необходимость в применении средств индивидуальной защиты.

В связи с вышеуказанным, нет различий в проведении исследований для установления ПДК пестицидов в промышленных помещениях и для сельского хозяйства.

В соответствии с "Временными методическими указаниями к постановке экспериментальных исследований для обоснования ПДК вредных веществ в воздухе производственных помещений" <1> при разработке ПДК пестицидов необходимы следующие данные:

1. Токсичность и характер действия вещества при однократном воздействии на организм.

2. Пороговые концентрации и дозы вещества при однократном воздействии.

3. Токсичность вещества при повторном воздействии на организм.

4. Пороговые концентрации (дозы) в хроническом опыте.

5. Обоснование рекомендуемой ПДК.

--------------------------------

<1> См. журнал "Гигиена труда и профессиональные заболевания", 1964, N 2.

При переходе от пороговой концентрации в хроническом эксперименте к ПДК необходимо правильно выбрать коэффициент запаса, при этом надлежит исходить из следующих положений.

Коэффициент запаса должен увеличиваться:

а) с увеличением абсолютной токсичности;

б) с увеличением летучести;

в) с уменьшением зоны острого действия (отношение ЛД к порогу

однократного действия);

г) с увеличением отношения порога острого действия к пороговой концентрации в хроническом опыте;

д) с увеличением кумулятивных свойств;

е) при выраженном кожно-резорбтивном действии;

ж) при наличии аллергенных, бластомогенных, эмбриотоксических, гонадотоксических свойств;

з) при поступлении пестицида в организм человека с пищей, водой и атмосферным воздухом.

Решение в каждом конкретном случае зависит от особенностей пестицида, от адекватности и чувствительности показателей, избранных для определения пороговой концентрации, и от других условий.

На основании результатов экспериментальных исследований дают первую рекомендацию о предполагаемой величине ПДК.

Материалы экспериментальных исследований, данные об условиях труда работающих и о физиологических и биохимических сдвигах у лиц, применяющих пестициды, позволяют рекомендовать ПДК препарата для воздуха производственных помещений и сельского хозяйства.

Подходы к установлению норматива в воздухе производственных помещений изложены выше.

При разработке ПДК пестицида в условиях сельского хозяйства должна быть принята во внимание специфика сельскохозяйственных работ, заключающаяся в их кратковременности и периодичности. Коэффициент запаса определяют с учетом патогенных свойств пестицида, длительности, кратности его применения.

Для высокотоксических веществ, обладающих узкой зоной токсического действия, выраженным кожно-резорбтивным действием (вторая группа гигиенической классификации), коэффициент запаса принимается на уровне рекомендуемой ПДК для производственных помещений. Так, например, при нормировании тиофоса, метафоса, метилмеркаптофоса, несмотря на кратковременность их применения, при сельскохозяйственных работах рекомендована та же ПДК, что и для воздуха производственных помещений.

Для мало- и среднетоксичных пестицидов с широкой зоной токсического действия и слабым кожно-резорбтивным эффектом, которые, однако, обладают выраженными кумулятивными свойствами, при кратковременном применении в сельском хозяйстве величины ПДК должны быть на один порядок больше, чем для воздуха производственных помещений. Это связано с тем, что для ядов хроноконцентрационного типа действия важнейшее значение имеет длительность контакта с ними. При применении таких веществ кратковременно опасность хронического отравления уменьшается.

Так, например, для ДДТ и ГХЦГ при кратковременных работах в сельском хозяйстве рекомендованы величины ПДК в 10 раз большие, чем для воздуха производственных помещений.

г) Регламентация условий применения пестицидов

С этой целью решают следующие вопросы:

1. Определение влияния условий применения пестицидов на уровень и длительность загрязнения рабочей зоны.

2. Установление сроков безопасного выхода людей на работу после применения пестицидов.

Сроки выхода на работу определяют путем сопоставления обнаруженных концентраций препарата в воздухе рабочей зоны с рекомендуемой ПДК в условиях сельского хозяйства.

Установление сроков выхода на работу следует дифференцировать в зависимости от характера проводимых операций:

а) если работа человека в обработанной зоне не связана с рыхлением почвы, чеканкой листьев, то при установлении сроков выхода его на работу надо ориентироваться на содержание в воздухе паров препарата;

б) при необходимости проведения операций по чеканке листьев хлопчатника и других работ, связанных с соприкосновением рук с объектами, содержащими те или иные количества пестицида, основным критерием для установления сроков выхода на работу является степень загрязнения растений и кожных покровов работающих;

в) при установлении срока выхода на работы, связанные с рыхлением почвы, основным показателем является возможность поступления препарата в рабочую зону с пылевидными частицами.

Фактическое загрязнение рабочей зоны сопоставляют с предполагаемой ПДК в условиях сельского хозяйства.

Определяют условия применения пестицидов (включая те методы и способы обработки), при которых обеспечивается наименьшее загрязнение рабочей зоны. Такие условия оцениваются положительно.

Если регламентацией условий применения нельзя снизить загрязнение пестицидом зоны дыхания работающих до рекомендуемой ПДК, в заключении указывается, что работа с данным препаратом разрешается только при применении соответствующих средств индивидуальной защиты.

Вопрос о разрешении или запрещении применения пестицида при рекомендуемых условиях его использования окончательно решается на основании оценки фактического загрязнения других сред (пищевых продуктов, воды, атмосферного воздуха).

д) Рекомендации к составлению заключения по гигиенической

оценке нового пестицида с точки зрения гигиены труда

В заключении должны быть отражены следующие вопросы:

а) возможность внедрения;

б) обоснование ПДК препарата в воздухе производственных помещений и в условиях сельского хозяйства;

в) рекомендации наиболее рациональных условий применения (способ, метод применения, дозы препарата, машины, аппараты и т.д.);

г) сроки выхода на работу после применения препарата;

д) рекомендации спецодежды и средств индивидуальной защиты.

4. ГИГИЕНИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТОВ, НОРМИРОВАНИЕ

В НИХ ОСТАТОЧНЫХ КОЛИЧЕСТВ ПЕСТИЦИДОВ И РЕГЛАМЕНТАЦИЯ

УСЛОВИЙ ПРИМЕНЕНИЯ

Гигиеническому нормированию в пищевых продуктах подлежат пестициды, а также их токсические производные, образующиеся в результате распада и метаболизма, исходного вещества в тканях растений, животных либо в других объектах внешней среды.

Для обоснования нормативов допустимых остаточных количеств нового пестицида в продуктах питания и гигиенической регламентации условий его применения необходимы данные о токсичности пестицида и его метаболитов, если таковые выявлены. Проводится комплекс гигиенических исследований:

1. Изучают органолептические свойства продуктов растительного и животного происхождения, подвергающихся воздействию пестицида при соблюдении условий его использования, рекомендуемых для сельского хозяйства.

2. Определяют содержание остаточных количеств пестицида в тканях растений и животных при рекомендуемых сельским хозяйством условиях применения (норма расхода, форма, концентрация препарата, кратность и время обработки).

3. При наличии метаболитов определяют химическую природу их и концентрацию в различных культурах и тканях животных.

4. Изучают влияние пестицида на химический состав и биологическую ценность продуктов питания.

5. В эксперименте проводят биологические испытания пищевых продуктов, полученных от растений и животных, подвергшихся воздействию нового пестицида.

6. Изучают стойкость остаточных количеств пестицида и токсических продуктов его превращения при хранении и различных технологических и кулинарных переработках.

Гигиенической оценке в течение 2 - 3 сезонов подлежат пищевые продукты, полученные от обработанных в различных условиях объектов (из различных климатогеографических зон).

а) Отбор проб пищевых продуктов

Для гигиенических исследований отбирается средняя проба пищевых продуктов, порядок составления которой зависит от характера объекта, величины образца и других условий.

Отбор проб является весьма важной и ответственной задачей. На основании лабораторного анализа средней пробы дается заключение о всей партии продукта в целом.

Под партией пищевого продукта в данном случае понимают все количество его, полученное одновременно при аналогичных условиях использования пестицида.

Из партии пищевого продукта отбираются отдельные выемки, после тщательного перемешивания которых составляется так называемый "средний образец", а из него - "средняя проба".

Ориентировочно средняя проба пищевых продуктов, направляемых в лабораторию для органолептических и химических исследований, должна быть не меньше:

а) зернобобовых - 3 кг,

б) овощей и плодов - 5 кг,

в) ягод и винограда - 5 кг,

г) вина, соков фруктовых и овощных - 1 кг,

д) травы, листьев - 3 кг,

е) сена - 1 кг,

грибов сушеных - 0,3 кг,

ж) молока - 1 кг,

масла - 0,2 кг,

молочных продуктов - 0,5 кг,

з) мяса и мясных продуктов, костей - 1 кг,

и) внутренних органов животных (печени, почек и др.) - 0,5 кг,

к) рыбы (несколько экземпляров) - 1,0 кг,

л) яиц - 20 шт.,

Для биологического испытания:

а) зерновых - 40 кг,

б) картофеля, фруктов - 40 кг,

в) моркови, столовой свеклы - 30 кг,

г) ягод, мандаринов, апельсинов - 30 - 40 кг,

д) лимонов - 10 кг.

В каждом конкретном случае количество продуктов, необходимое для гигиенического изучения, в процессе работы целесообразно совместно уточнять комплексирующим медицинским и сельскохозяйственным учреждениям.

Отбор средних образцов и проб пищевых продуктов

Отбор проб зерна злаковых, бобовых культур и семян масличных культур. После того как зерно обмолочено, а семена бобовых вылущены, из разных участков партии отбирают средний образец весом 20 - 30 кг. Его рассыпают равномерным слоем и по диагоналям на равных расстояниях в 12 - 15 местах, совком берут пробы и ссыпают в один пакет или мешок. После тщательного перемешивания исходного образца, его снова рассыпают по ровной поверхности, подравнивают в квадрат и по диагоналям делят на 4 части. Зерно или бобовые из противоположных треугольников собирают и вновь рассыпают, выравнивают в квадрат и делят так же, продолжая эту операцию до составления средней пробы весом в 3 кг.

Отбор проб овощей. Пробы отбирают по диагонали обработанного участка. Томаты, перец, баклажаны и др. следует брать с промежутками в 6 - 10 растений. Выемка проб должна производиться с различных ярусов не менее чем с 10 растений, но предпочтительнее с еще большего числа (20 - 25).

Урожай каждого из 10 растений картофеля (батата, земляной груши), отобранных по диагонали, делят пополам так, чтобы в каждую половину вошли в одинаковых количествах крупные, средние и мелкие клубни. Вес пробы смешивают в средний образец, из которого отбирают среднюю пробу. Отбор корнеплодов и лука производится через каждые 6 - 10 растений по диагонали участка. Из смеси составляют средний образец, а из него среднюю пробу.

Средняя проба бахчевых культур должна состоять не менее чем из 3 - 5 плодов, взятых из разных мест по диагонали участка.

Отбор средних образцов лиственных овощей производят по диагонали через каждые 10 растений таким образом, чтобы вошли верхние, средние и нижние листья с 3 - 5 растений каждой точки. После тщательного перемешивания отбирают среднюю пробу.

Отбор проб плодов и ягод. Выемку средних образцов производят не менее чем с 10 деревьев и кустов, расположенных по диагоналям участков. В больших садах выбирают наиболее типичные участки, в которых отбор образцов производят по диагоналям, из смеси отбирают среднюю пробу.

С отдельных деревьев и кустов плоды, ягоды, гроздья винограда берут с различных ярусов и разных сторон по отношению к частям света.

Отбор проб кормовых культур. Исходный образец отбирают по диагоналям площади на равных расстояниях (в зависимости от величины ее) по 1/4 куста от 10 - 15 растений.

При рядовом и гнездовом посевах на значительных площадях полевую пробу берут по диагоналям. Таким образом, средний образец составляется из 20 - 30 растений.

Стебли и листья измельчают, перемешивают и отбирают среднюю пробу весом в 3 кг. Корма, используемые в сухом виде, предварительно высушиваются, затем отбирают 1 кг.

Отбор проб продуктов жидкой и полужидкой консистенции

Молоко, сметана, овощные и фруктовые соки, вино, растительные масла, рыбий жир, варенье и другие продукты перемешиваются. Пробы отбираются от однородной партии. Однородной считается партия, состоящая из одного вида и сорта продукта, в таре одного типа и размера, одной даты выработки, изготовленная одним заводом. Средний образец составляется из 5% общего количества единиц тары (бочек, бутылей, бутылок, флаконов).

Выемка пробы производится тотчас после тщательного перемешивания продукта специальными приборами. Для этой цели используют луженую трубку, пробник, длина которого несколько больше высоты фляги или иного резервуара, мутовки, предназначенные для молока.

Из выделенных для исследования единиц тары содержимое отбирают по 100 - 200 мл, смешивают и берут среднюю пробу.

При малой емкости (до 200 мл) содержимое отобранных тар соединяют и тщательно перемешивают, после чего выделяют среднюю пробу.

Отбор проб других продуктов. 1. Выемку сыпучих продуктов, хранящихся в мешках (зерно, крупа, мука, семена и др.), производят мешочным щупом из верхних, нижних и средних участков, не менее чем из 5% всех мешков. Получают средний образец, из которого отбирают среднюю пробу. Если сыпучие продукты хранятся насыпью, то пробу берут не менее чем из 5 мест на разных участках и различной глубине. В этих случаях для выемки проб применяют вагонный щуп. От исходного образца отбирают среднюю пробу по методике, описанной для зерновых.

2. Выемку проб твердых жиров производят при помощи масляного щупа. При вскрытии тары (ящика, бочки) щуп погружают в жир на расстоянии 2 - 3 см от края тары и извлекают его наружу. Часть столбика масла, вынутого из щупа, отбирают для составления исходного образца.

Масляным щупом можно пользоваться и для отбора пробы сыров. Таким образом, берут пробы из 5 ящиков масла или сыра (общим весом не менее 1 кг), смешивают и отбирают среднюю пробу.

3. Для оценки мяса или изделий из него отбираются пробы, составляющие 10% мест всей партии. Если партия большая, то не менее 5% мест. От каждой туши отбирают образцы из мышц в области лопатки, из толстых частей мышц бедра и у зареза 4 - 5 шейных позвонков по 200 г каждый. От тех же туш берут для исследования жир, внутренние органы и костный мозг. Образцы каждой туши исследуются отдельно. Заключение о партии дается на основании исследований тканей всех отобранных животных.

4. При отборе мелкой рыбы из различных мест каждой партии отбираются 3 - 5 экземпляров. Образцы проб крупной рыбы отбираются так же, как и мясо.

5. Отбор проб мяса птицы. Отбирается средний образец, составляющий 5% общего количества тушек. От каждой тушки берутся мышцы грудинки и лапки весом не менее 50 г. Проба каждой тушки исследуется отдельно.

6. Отбор проб яиц. Для среднего образца отбирают 5% партии. Из него составляют среднюю пробу из 20 яиц.

Каждый образец продукта, направляемый для исследования, должен быть упакован в отдельную химически чистую тару, и сопровождаться паспортом, содержащим следующие сведения:

а) место отбора пробы;

б) наименование продукта, помологический сорт культуры или вид животного, от которого он получен;

в) метод и способ обработки пестицидами сельскохозяйственных культур (авиационный, наземный, опыливание, опрыскивание) и животных (опрыскивание, втирание в кожные покровы, дача внутрь и др.);

г) форма, концентрация и норма расхода используемого пестицида (дуст, смачивающийся порошок, эмульсия, паста);

д) даты обработок пестицидами культур в течение всего периода вегетации или же применения на животных;

е) дата отбора пробы;

ж) данные о количестве атмосферных осадков и средней температуре воздуха по кварталам <1>;

з) сведения о лице, ответственном за отбор проб.

--------------------------------

<1> Сведения в параграфах "в", "г", "д", "е", "ж" получают в учреждениях, испытывающих эффективность нового пестицида.

В сопроводительном паспорте к продуктам переработки (сухофрукты, сахар, масло и др.) должны быть включены сведения о способе их получения.

б) Органолептические исследования пищевых продуктов

В связи с тем, что результаты органолептических исследований зависят от индивидуальных особенностей органов чувств каждого экспериментатора, следует предусмотреть ряд условий, способствующих повышению достоверности получаемых данных.

В проведении органолептических исследований должны участвовать не менее 10 - 12 человек. Оценка органолептических свойств осуществляется путем закрытой дегустации, то есть дегустатор в отдельной комнате исследует зашифрованные образцы продуктов, а результаты наблюдений записывает в дегустационную карту (образец прилагается). Номера образцов расшифровываются только после окончания исследований.

Необходимо создать наиболее благоприятную обстановку для проведения органолептических исследований. В помещении следует поддерживать оптимальную температуру, обеспечить достаточное освещение, отсутствие посторонних запахов и других раздражителей.

ДЕГУСТАЦИОННАЯ КАРТА

Фамилия, имя, отчество дегустатора ________________________________________

___________________________________________________________________________

Дата проведения исследования ______________________________________________

Номера отличающихся образцов ______________________________________________

Интенсивность постороннего привкуса и запаха в баллах

┌─────────────────┬────────────────────────────────────────────────────────┐

│ N образца │ Балл │

│ ├──────────┬───────────┬───────────┬──────────┬──────────┤

│ │ 1 │ 2 │ 3 │ 4 │ 5 │

└─────────────────┴──────────┴───────────┴───────────┴──────────┴──────────┘

Запах

Привкус

Примечание: охарактеризовать выявленные изменения органолептических свойств

пищевых продуктов.

Подпись:

При проведении органолептических исследований в последнюю очередь анализируются образцы с более резким посторонним запахом и привкусом.

В практике органолептических исследований зарекомендовал себя вполне надежный метод треугольника, который заключается в том, что из трех предлагаемых образцов (двух контрольных и одного опытного) дегустатор должен выделить опытный.

Все три образца должны быть поданы в одинаковой посуде и при соблюдении прочих равных условий. Одновременно могут подвергаться органолептическим оценкам две пробы пищевых продуктов.

Следует иметь в виду, что при длительном соприкосновении какого-либо вкусового вещества с поверхностью языка происходит понижение вкусовой чувствительности - возникает так называемая "вкусовая адаптация". Во избежание подобного явления после опробования каждого образца дегустатор должен делать перерыв, во время которого ополаскивает рот тепловатой кипяченой водой, после этого исследования можно повторять, либо провести органолептическую оценку двух новых проб.

Пищевые продукты подвергаются исследованию в таком виде, в каком они обычно употребляются в питании. Прежде всего, отмечается внешний вид продукта как снаружи, так и в разрезе.

Затем, таким же образом определяется запах и привкус пищевого продукта. При этом для обозначения интенсивности запаха и привкуса используется общепринятая система (см. табл. 8).

Таблица 8

ПЯТИБАЛЛЬНАЯ СИСТЕМА ОБОЗНАЧЕНИЯ ИНТЕНСИВНОСТИ

ПОСТОРОННЕГО ЗАПАХА И ПРИВКУСА

┌────┬─────────────┬─────────────────────────────────────────────┐

│Балл│Интенсивность│ Значение │

├────┼─────────────┼─────────────────────────────────────────────┤

│1. │Очень слабый │Обычно неощутимый, но обнаруживаемый опытным │

│ │ │дегустатором │

│2. │Слабый │Обнаруживаемый дегустатором только после │

│ │ │того, если на него обратить внимание │

│3. │Средний │Слегка ощутимый и могущий вызвать │

│ │ │неодобрительные отзывы потребителей │

│4. │Сильный │Обращающий на себя внимание и могущий заста- │

│ │ │вить отказаться от потребления пищевого про- │

│ │ │дукта │

│5. │Очень сильный│Настолько ощутимый, что продукт становится │

│ │ │совершенно непригоден для питания │

└────┴─────────────┴─────────────────────────────────────────────┘

По окончании исследований подытоживают полученный результат, определяют число правильных указаний на опытный образец.

Данные определения интенсивности постороннего запаха и привкуса,

оцененного по пятибалльной системе, подвергают вариационно-статистическому

анализу. Рассчитывают среднее арифметическое значение интенсивности

постороннего привкуса и запаха в баллах (Х), среднее квадратическое

отклонение (сигма), ошибку средней арифметической (S_), как это указано

более подробно в разделе III, гл. 5. Как показатель точности, используется

процент ошибки, определяемый по формуле:

S_ х 100

--------.

В том случае если процент ошибки не превышает 10, точность произведенных исследований считается вполне удовлетворительной. Можно повысить показатель точности, т.е. уменьшить процент ошибки, увеличив количество исследований.

По органолептическим свойствам продукт оценивается положительно в том случае, если средняя интенсивность постороннего запаха и привкуса не превышает 1 балла.

В тех случаях, когда пестицид вызывает выраженное изменение органолептических свойств пищевых продуктов (интенсивность постороннего привкуса или запаха свыше 2 баллов, и достоверность этого подтверждена статистически), не устраняющееся при кулинарной обработке, дальнейшие исследования пестицида прекращаются и дается заключение о невозможности использования его для обработки продовольственных культур.

в) Определение остаточных количеств пестицидов

в пищевых продуктах

Под остаточным количеством понимают пестицидные химикаты или продукты их превращения, которые могут содержаться в пищевых продуктах.

В связи с тем, что в разных растительных и животных организмах скорость, степень и характер превращения пестицида может быть различна, определение остаточных количества должно производиться во всех видах продуктов, в которых он может содержаться, при всех рекомендуемых условиях применения (нормы расхода, форма, концентрация, кратность, метод и способ применения). При этом следует выяснить все возможные пути поступления пестицида в продукты: непосредственная обработка растений, животных, птиц; протравливание семян; контакт с другими средами (водой, почвой), обработанными пестицидами.

Одним из критериев оценки опасности пищевых продуктов, содержащих остатки пестицида, является скорость разрушения его на (или в) обрабатываемых объектах. Поэтому определение величины остаточных количеств пестицида в продуктах следует проводить в динамике: через сутки после обработки, а затем повторно каждые 3 - 5 - 10 дней (в зависимости от стойкости пестицида). Последняя проба для исследования отбирается в период товарной зрелости.

При определении остаточных количеств пестицидов необходимо учитывать метеорологические условия во время применения, время года и другие природные факторы (вид почвы, влажность, температура и др.), которые могут оказать влияние на содержание химиката в продукте. Необходимо изучать остаточные количества пестицидов в продуктах, полученных от растений, выращенных в различных климатогеографических зонах.

Каждый образец продуктов исследуют не меньше 3 раз с параллельными определениями.

Следует проводить исследование пестицида в падалице плодов товарной зрелости.

Наряду с исследованиями пищевых продуктов, необходимо проводить определение остаточных количеств пестицидов в отходах (стеблях, листьях, жоме и др.), используемых для откорма животных.

Если в отходах обнаруживается пестицид, должно быть проведено определение остаточных количеств его в продуктах от животных, скармливаемых ими. В положительном случае решается вопрос о возможности использования отходов, содержащих то или иное количество пестицида в качестве кормов.

Продукты питания, используемые в пищу в процессе хранения (определенные сорта фруктов, овощей, зерно и др.), нужно исследовать также через различные промежутки времени после снятия урожая. Если изучаемый пестицид применяется для обработки культур, продукты из которых используются в пищу после кулинарной или технологической обработки, необходимо производить исследование остатков пестицида в сырье и готовой продукции. Полученные при этом данные позволят, в порядке исключения, решать вопрос о переработке и путях реализации пищевых продуктов, содержащих пестицид в количествах, превышающих ДОК.

Для определения остаточных количеств пестицида надо использовать специфический высокочувствительный метод, позволяющий определить его количества, находящиеся в пределах допустимых нормативов.

Химический метод должен быть предварительно проверен на контрольных образцах продуктов, в которые внесены определенные количества пестицида.

Особое внимание должно уделяться подготовке пищевого продукта к анализу.

Зерновые, бобовые культуры, огурцы, помидоры исследуются в измельченном виде; корне- и клубнеплоды, бахчевые культуры - в измельченном виде после очистки от кожуры, в яблоках, грушах, айве и пр. - пестицид определяется отдельно в кожуре и мякоти, ягоды исследуются в измельченном виде без косточек.

Принимая во внимание, что при обработке капусты некоторые нерастворимые пестициды могут неравномерно распределяться, наиболее всего концентрируясь у кочерыжки, среднюю пробу следует готовить из 1/4 или 1/5 кочана с таким расчетом, чтобы в нее попали прилегающие к основанию листья.

Точность определения может в значительной степени зависеть от тщательности измельчения продукта.

г) Изучение влияния пестицидов на химический состав

и пищевую ценность продуктов

При проникновении в ткани растений пестициды и продукты их превращений могут оказывать влияние на различные звенья обменных процессор, вызывать угнетение либо стимуляцию синтеза отдельных питательных веществ, перераспределение их между съедобными и несъедобными частями растений, разрушать жизненно важные факторы питания.

Последнее может иметь место и при обработке хранящихся продовольственных запасов. Вследствие этого возможно ухудшение органолептических свойств продуктов, снижение их пищевой ценности и технологических качеств.

Степень выраженности указанных изменений определяется свойствами пестицида, видовыми и возрастными особенностями растений, нормой расхода препарата и другими условиями.

При изучении химического состава пищевых продуктов основное внимание нужно уделять определению тех составных частей, которыми обусловливается их пищевая и биологическая ценность (белки с учетом аминокислотного состава, углеводы, витамины и др.). Так, например, при оценке черной смородины, цитрусовых следует определять содержание витамина C; злаковых - витаминов группы B, аминокислотный состав; картофеля - крахмала и т.д.

Исследованию подвергаются продукты, достигшие товарной зрелости, как в процессе вегетации, так и в период хранения.

Изучается зависимость степени выраженности изменений химического состава пищевых продуктов от видовых особенностей растений, а также от специфики применения препарата (нормы расхода, кратности и времени обработки и др.).

Полученные результаты исследований должны приниматься во внимание при регламентации условий использования изучаемого пестицида.

д) Биологические испытания пищевых продуктов

Биологические испытания пищевых продуктов, содержащих остаточные количества, проводятся в тех случаях, когда есть основание предполагать, что в процессе превращения пестицида в растительном, либо в животном организме, а также при технологической обработке могут образовываться новые токсические вещества, которые не определяются существующими химическими методами.

Опыты проводятся на наиболее чувствительных животных в таком же плане, как и при изучении хронической токсичности препарата при пероральном введении.

В аналогичных условиях исследуются контрольные продукты, полученные от урожая культур, не обработанных пестицидами.

Скармливание подопытным животным пищевых продуктов, как испытуемых, так и контрольных, производится в таком виде, в каком они употребляются в питании человека.

Исключение составляют зерновые культуры, которые скармливают грызунам (мышам, крысам) в сыром виде. Подопытные животные получают испытуемые пищевые продукты в количествах, соответствующих их суточному рациону, в том случае, если исследуемый продукт входит в состав их рациона. В тех случаях, когда пищевой продукт не входит в рацион животных, его скармливают в количествах, соответствующих возможному максимальному употреблению человеком в пересчете на 1 кг веса (см. таблицу 9).

Таблица 9

КОЛИЧЕСТВО ИСПЫТУЕМЫХ ПРОДУКТОВ, ЕЖЕДНЕВНО СКАРМЛИВАЕМЫХ

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫМ ЖИВОТНЫМ

┌─────────────┬───────────────────────────────────────────────────────────┐

│ Название │ Вид животного │

│ продукта ├────────────┬────────────┬───────┬────────────┬────────────┤

│ │ белая мышь │ крыса │ кошка │ щенок │ собака │

├─────────────┼────────────┼────────────┼───────┼────────────┼────────────┤

│Зерновые │2 - 3 г на │5 г на 100 г│15 г/кг│15 - 20 г/кг│15 - 20 г/кг│

│ │мышь │веса │ │ │ │

│Картофель │- │- │15 г/кг│15 - 20 г/кг│15 - 20 г/кг│

│Морковь, │1 г на мышь │3 г на крысу│10 г/кг│15 - 20 г/кг│10 - 15 г/кг│

│столовая │ │ │ │ │ │

│свекла и др. │ │ │ │ │ │

│овощи │ │ │ │ │ │

│Капуста │- │1 мл сока на│5 г/кг │10 г/кг │15 г/кг │

│ │ │100 г веса │ │ │ │

│Фрукты │- │1 мл сока на│15 г/кг│15 г/кг │15 г/кг │

│ │ │100 г веса │ │ │ │

│Ягоды │- │1 мл сока на│- │15 г/кг │15 г/кг │

│ │ │100 г веса │ │ │ │

│Масло │0,2 - 0,5 мл│0,5 мл на │1,5 │1,5 мл/кг │2 мл/кг │

│растительное │на мышь │100 г веса │мл/кг │ │ │

└─────────────┴────────────┴────────────┴───────┴────────────┴────────────┘

Крупные животные (собаки, кошки, кролики) получают фрукты, ягоды, косточковые в сыром виде, предварительно смешанные с пищей. Мелким животным (мышам, крысам) фрукты, ягоды, цитрусовые, виноград вводят в виде сока или гомогената.

В тех случаях, когда пестицид не растворяется в воде и не переходит в сок, животные получают экстракты, которые готовят следующим образом: навеску измельченного продукта экстрагируют летучим растворителем (эфиром, спиртом и др.) в течение суток, экстракт выливают на ту порцию белого хлеба, которая, согласно рациону, положена животным; после полного испарения растворителя хлеб скармливают грызунам.

Исследуемые зерновые культуры, корне- и клубнеплоды скармливают крупным животным в вареном виде, при этом из рациона исключаются входящие в него по норме овощи и зерно. Мелким животным эти продукты скармливают в сыром виде.

Аналогично поступают с контрольными образцами продуктов.

Критерием для оценки влияния на организм животных пищевых продуктов, полученных от продовольственных культур, обработанных пестицидами, являются наиболее чувствительные тесты, выявленные в опытах по изучению хронической токсичности препарата. Органы животных, погибших в течение опытного периода или убитых по истечении его, подвергают макро- и микроскопическому исследованию.

Результаты биологических исследований опытных образцов продуктов сравнивают с контрольными продуктами.

В том случае, если выявлено патологическое влияние пищевых продуктов, полученных от обработанных культур и животных, необходимо сопоставить степень выраженности и характер изменений, возникших в состоянии животных, с величиной остаточных количеств пестицида.

На основании данных о дозах, вызывающих хроническую интоксикацию, решают вопрос, могут ли обнаруженные в пищевом продукте остатки пестицида выливать выявленные патологические сдвиги или их следует отнести за счет воздействия токсических продуктов превращения. Полученные результаты принимают во внимание при решении вопроса о возможности использования пестицидов для обработки продовольственных культур, животных и птицы, а также при нормировании и регламентации условий применения.

е) Изучение стойкости пестицидов в лабораторных условиях

Изучение стойкости пестицида при комнатной температуре

Готовятся растворы препаратов такой же концентрации с использованием тех же растворителей, как и при изучении острой токсичности. Проверяется величина установленной среднесмертельной дозы препарата на 10 мелких лабораторных животных и химическим методом определяется содержание пестицида в растворе.

Указанный раствор в сосуде, накрытом фильтровальной бумагой, содержится в естественных условиях в помещении, воздух которого свободен от изучаемого пестицида. Через 1, 3, 6, 10, 20 и 30 дней в нем определяется содержание пестицида. На основании полученных данных методом интерполяции устанавливается период полураспада препарата (время разрушения на 50%) Раствор, в котором осталось 50% препарата, вновь вводят животным. Биологические исследования позволяют установить, изменяется ли токсичность препарата и не образуются ли в процессе распада пестицида более токсичные производные. Результаты исследований обрабатываются статистически по формуле:

Р - Р

1 2

t = -----------------------------------------,

_______________ _______________

/Р х (100 - Р ) /Р х (100 - Р )

/ 1 1 / 2 2

\/ --------------- + \/ ---------------

n + 3 n

1 2

где:

Р , Р - процент животных в соответствующих группах, на которых есть

1 2

эффект;

n , n - число животных.

1 2

Изучение стойкости пестицидов при высокой температуре

Свежеприготовленный раствор вышеуказанной концентрации пестицида подвергается кипячению в течение 30 - 60 мин. и 4 - 5 часов (кипятят в сосуде с обратным холодильником). После кипячения производится химическое и биологическое исследование раствора, так же как и в предыдущем опыте. Результаты подвергаются статистической обработке.

Изучение стойкости пестицида в пищевых продуктах

В связи с тем, что разрушение пестицидов в тканях растений и животных может протекать с другой скоростью и иным путем, параллельно с изучением стойкости пестицидов в растворе исследуется стойкость его в продуктах питания при хранении в обычных условиях и после термической обработки. Определение пестицидов в продукте производится химическим методом до закладки на хранение и в динамике в процессе хранения, в условиях, приближенных к практическим. При термической и технологической обработке продуктов должен соблюдаться соответствующий режим (температура, экспозиция, бланшировка).

Полученные данные используются для решения вопроса о путях реализации продуктов, содержащих пестициды в количествах, выше допустимых, а также при нормировании остаточных количеств его.

ж) Принципы подхода к установлению допустимых остаточных

количеств пестицидов (ДОК) в продуктах питания

При установлении допустимых остаточных количеств пестицидов в пищевых продуктах следует исходить из следующих принципов:

1. Содержание пестицида в суточном рационе не должно превышать его допустимую безвредную дозу для человека.

При установлении ДОК должны учитываться данные о возможности поступления пестицида в организм человека из других сред (воды, воздуха). Кроме того, принимаются во внимание результаты исследований по выявлению токсичности продуктов превращения пестицида.

2. ДОК пестицида должны устанавливаться отдельно для каждого пищевого продукта, в котором возможно его наличие, с учетом удельного веса продукта в пищевом рационе и с таким расчетом, чтобы суммарное содержание пестицида во всех продуктах не превышало допустимую дозу в суточном рационе. ДОК выражается в мг/кг веса продукта.

3. ДОК пестицида в пищевом продукте не должны оказывать отрицательное влияние на органолептические свойства и снижать его пищевую ценность.

4. При установлении ДОК лимитирующими показателями должны быть токсикологические свойства пестицида и изменение вкусовых качеств продукта.

Для установления ДОК пестицида гигиенист должен располагать следующими данными:

а) токсичность пестицида при однократном и длительном пероральном поступлении в организм (пороговая доза в остром и в хроническом эксперименте длительностью не менее 10 месяцев) с учетом возможных опасных продуктов превращения;

б) максимально допустимая суточная доза для человека - Д для человека;

в) принадлежность пестицида к определенной группе гигиенической классификации;

г) влияние пестицида на качество пищевых продуктов: данные органолептических, химических и биологических исследований;

д) среднее суточное потребление пищевых продуктов (удельный вес продукта, в котором нормируется пестицид, в суточном пищевом рационе - так называемый пищевой фактор).

Высокотоксичные пестициды, обладающие выраженными кумулятивными свойствами, с коэффициентом кумуляции в пределах 1 - 2, стойкие к воздействию факторов внешней среды и высокой температуры не должны содержаться в пищевых продуктах.

Пестициды, коэффициент кумуляции которых в пределах 2 - 3, относящиеся по стойкости ко II группе гигиенической классификации, не должны содержаться в основных продуктах питания: хлебе, картофеле, мясе, рисе (для среднеазиатских республик).

В связи с тем, что молоко является основным продуктом детского и диетического питания, наличие в нем любых пестицидов не допускается. Не допускается содержание пестицидов в моркови и ягодах (клубнике, малине, черной смородине), которые широко используются в питании грудных детей (в виде соков).

При установлении ДОК принимаются в расчет только те продукты, которые получают от растений и животных, подлежащих обработке исследуемым пестицидом согласно сельскохозяйственным рекомендациям.

Таким образом, допустимая доза пестицида в суточном рационе распределяется не на весь комплекс продуктов, входящих в пищевой рацион, а лишь на ту часть, в которой могут быть остаточные количества. В перечень заносят продукты, в которых могут быть остатки пестицида и определяется их общий вес. Так, например, в пищевой рацион будут входить следующие продукты, в которых может содержаться пестицид: картофель, капуста, яблоки, горох, свекла, лук, гречневая крупа. Общий вес этих продуктов составит 1,5 кг. Значит, допустимая доза в суточном рационе человека будет содержаться в 1,5 кг. А в 1 кг каждого продукта в 1,5 раза меньше.

Исследователь использует ДОК для установления толерантности. Под толерантностью понимают наибольшую концентрацию пестицида, возникающую в продукте при приемлемых, с точки зрения гигиены питания, условиях использования препаратов для обработки сельскохозяйственных культур. Толерантность не должна превышать ДОК и, как правило, должна быть ниже.

Санитарные врачи используют ДОК, в качестве критерия при решении вопроса о возможности использования в питании человека данного продукта и о путях его реализации.

з) Регламентация условий применения пестицидов

на сельскохозяйственных растениях

и установление толерантности

Одним из основных мероприятий по защите пищевых продуктов от загрязнения пестицидами является установление необходимых сроков между последней обработкой продовольственных, технических и кормовых культур и уборкой урожая, так называемых "сроков ожидания".

Для этого изучается в динамике содержание статочных количеств препарата в культуре в зависимости от условий обработки растений (формы и концентрации пестицида, нормы расхода, способа и метода применения), а также метеорологических факторов.

Полученные данные, в сопоставлении с допустимыми остаточными количествами (ДОК), позволяют рекомендовать "сроки ожидания" для каждой культуры в отдельности.

При установлении "сроков ожидания" следует исходить из данных, полученных при условиях, наиболее способствующих сохранению пестицида на обрабатываемой культуре.

Сроки ожидания должны быть таковыми, чтобы остаточные количества пестицида в продуктах, полученных от обрабатываемых культур, не превышали ДОК.

Наибольшая из обнаруженных к моменту сбора урожая концентрация остатков пестицидов, которая ниже ДОК и не оказывает отрицательного влияния на качество пищевых продуктов (органолептические свойства, биологическая ценность), принимается как толерантная.

Толерантность устанавливается для каждого продукта и выражается в мг на 1 кг веса продукта.

Условия применения пестицида, при которых остатки его в продуктах обеспечивают толерантность, вносятся в список химических средств защиты растений, разрешенный к использованию в сельском хозяйстве.

В том случае, когда фактическое содержание пестицида в отдельных продуктах превышает ДОК, по согласованию с сельскохозяйственными специалистами, соответствующим образом регламентируются условия применения пестицида на определенных культурах (удлиняются сроки ожидания, изменяется форма, концентрация препарата и кратность обработки).

Если регламентацией условий применения нельзя снизить остаточное количество пестицидов в продукте до ДОК, то делается вывод о невозможности использования пестицида для обработки данной продовольственной культуры.

Исключение составляют продовольственные культуры, пищевые продукты от которых употребляются лишь после термической обработки, а концентрация остатков пестицидов при этом снижается до допустимых пределов либо они полностью разрушаются.

Толерантность используется гигиенистами в качестве критерия оценки правильности применения пестицида при обработке сельскохозяйственных растений, животных и птиц.

и) Рекомендации к составлению заключения по гигиенической

оценке нового пестицида с точки зрения гигиены питания

В заключении должны быть отражены следующие вопросы:

а) возможность внедрения;

б) обоснование ДОК в пищевых продуктах;

в) толерантность для различных продуктов;

г) регламентация условий применения при обработке сельскохозяйственных растений, животных и птицы;

д) сроки ожидания;

е) рекомендации по использованию пищевых продуктов, содержащих остатки пестицидов в количествах, превышающих ДОК.

5. ГИГИЕНИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ ПЕСТИЦИДОВ В СВЯЗИ С САНИТАРНОЙ

ОХРАНОЙ ВОДОЕМОВ И НОРМИРОВАНИЕ ИХ В ВОДЕ

В открытые водоемы пестициды могут поступать следующими основными путями:

1. С дождевыми и талыми водами (поверхностный сток), смывающими препараты с растений и почвы.

2. При авиа- и наземном опыливании и опрыскивании сельскохозяйственных угодий и лесов.

3. При непосредственном внесении в открытые водоемы пестицидов для разных целей.

4. Со сточными водами, образующимися в результате применения пестицидов в сельском хозяйстве, а также на предприятиях, производящих их.

Попавшие в водоемы пестициды могут включаться в сложные циклы, в результате чего гидробионты водоема (рыба, водные растения и др.), а также ил могут накапливать значительное количество пестицидов, в сотни и тысячи раз превышающее его концентрацию в воде. Кроме того, при гибели флоры и фауны будет происходить десорбция пестицида и его метаболитов в воду (вторичное загрязнение водоемов).

Для установления опасности пестицида, с точки зрения возможного нарушения санитарного режима поверхностного водоисточника и воздействия на здоровье населения при загрязнении им водоема, проводятся комплексные гигиенические и токсикологические исследования в соответствии с программой, предложенной С.Н. Черкинским (см. сборник "Санитарная охрана водоемов от загрязнения промышленными сточными водами", 1965, 1964, 1962, 1949 гг.; "Промышленное загрязнение водоемов", 1967 г.).

Токсикологическую характеристику пестицида получают в результате исследований, описанных в главе II.

Гигиенические исследования включают следующие разделы:

а) Установление стабильности пестицидов и их влияния на органолептические свойства воды.

б) Определение действия пестицидов на общий санитарный режим водоемов.

в) Изучение фактического содержания остаточных количеств пестицидов в воде, рыбе, иле, водной растительности и циркуляции пестицидов в водоемах.

г) Определение эффективности очистки от пестицидов воды для питьевых целей.

Исследованию подвергаются химически чистый и технический препарат и его товарные формы, которые рекомендуют для обработки водоемов.

а) Установление влияния пестицидов на органолептические

свойства воды

Определение влияния на запах и привкус воды.

В склянках Винклера на водопроводной дехлорированной воде готовится серия растворов (каждый в объеме 100 мл) разных концентраций пестицидов с таким расчетом, чтобы каждая последующая концентрация была в два раза меньше предыдущей. Максимальная испытуемая концентрация пестицида должна придавать воде запах интенсивностью 5 баллов. Склянки с растворами плотно закрываются пробками. Разведение делается до тех пор, пока не исчезнет запах. Порог и интенсивность запаха определяют методом закрытой бригадной одорации.

Одорация проводится в светлом, хорошо проветренном помещении, в котором отсутствуют какие-либо посторонние запахи. Число одораторов должно быть не менее шести. В качестве одораторов можно привлекать людей, которые не курят и у которых отсутствуют заболевания верхних дыхательных путей (например, ринит и пр.) Исследования проводятся до или через несколько часов после приема пищи, желательно в одно и то же время суток. Определение начинают с контроля и продолжают в направлении увеличения концентрации. Перед определением запаха, склянка с содержимым хорошо встряхивается, приближается к носу и быстро открывается, после чего одоратор делает несколько глубоких вдохов и отмечает наличие или отсутствие запаха, его характер и интенсивность. Классификация запахов естественного происхождения приводится в табл. 10. Шкала интенсивности запаха приведена в разделе "Гигиеническая оценка пищевых продуктов".

Таблица 10

КЛАССИФИКАЦИЯ ЗАПАХОВ ВОДЫ

ПО СХОДСТВУ С ЗАПАХАМИ ЕСТЕСТВЕННОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ

┌──────┬───────────────┬─────────────────────────────────────────┐

│Символ│Характер запаха│ Естественный запах │

├──────┼───────────────┼─────────────────────────────────────────┤

│А │Ароматический │Огуречный, цветочный │

│Б │Болотный │Илистый, тинистый │

│Г │Гнилостный │Фекальный, сточный │

│Д │Древесный │Запах мокрой щепы, древесной коры │

│З │Землистый │Прелый, свежевспаханной земли, глинистый │

│П │Плесневой │Затхлый, застойный │

│Р │Рыбный │Рыбьего жира, рыбы │

│С │Сероводородный │Тухлых яиц │

│Т │Травянистый │Скошенной травы, сена │

│Н │Неопределенный │Неподходящий под предыдущие определения │

└──────┴───────────────┴─────────────────────────────────────────┘

Одоратор в процессе исследований заполняет свою карту одорации. После каждого определения делается перерыв на 3 минуты, а затем аналогичным образом определяется запах следующей концентрации.

Периодически интенсивность запаха в пробе сравнивается с контролем.

Повторно исследуются аналогично приготовленные вторая и третья серия разведений пестицида, то есть три раза испытывается заданная серия разведения. По окончании исследований каждой серии результаты записываются в журнале по форме, представленной в табл. 11, а затем обобщаются по схеме, изложенной в таблице 12, и статистически обрабатываются (см. табл. 13 и 14).

Таблица 11

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЗАПАХА ВОДЫ

Концентрация пестицида (мг/л)	N склянок	Одораторы
		А	Б	В	Г	Д	Ж
		Интенсивность запаха (в баллах) - числитель, характер запаха - знаменатель

Таблица 12

РАСПРЕДЕЛЕНИЕ ПОКАЗАТЕЛЕЙ ИНТЕНСИВНОСТИ ЗАПАХА

В ЗАВИСИМОСТИ ОТ КОНЦЕНТРАЦИИ ПЕСТИЦИДА В ВОДЕ

┌────────────────┬───────────────────────────────────────────────┐

│ Концентрация │ Интенсивность запаха в баллах │

│пестицида (мг/л)├───────┬───────┬───────┬───────┬───────┬───────┤

│ │ 0 │ 1 │ 2 │ 3 │ 4 │ 5 │

├────────────────┴───────┴───────┴───────┴───────┴───────┴───────┤

│ Число наблюдений │

│ │

│0 │18 │- │- │- │- │- │

│0,002 │18 │- │- │- │- │- │

│0,004 │16 │2 │- │- │- │- │

│0,008 │1 │17 │- │- │- │- │

│0,016 │- │2 │16 │- │- │- │

└────────────────┴───────┴───────┴───────┴───────┴───────┴───────┘

Таблица 13

РЕЗУЛЬТАТЫ СТАТИСТИЧЕСКОЙ ОБРАБОТКИ ДАННЫХ

ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОНЦЕНТРАЦИИ, СООБЩАЮЩЕЙ ЗАПАХ (ПРИВКУС)

В 1 - 2 БАЛЛА

┌────────────────┬─────────────┬──────┬─────┬────────────┬───────────────────┐

│ │ │ │ │ │ ___________│

│ │ │ │ │ │ / _ 2│

│ │ │ │_ │ _ 2│ /SUM (Х - Х) │

│Х, концентрация │n, количество│SUM Х │Х - Х│SUM (Х - Х) │+/- \/ ------------│

│пестицида (мг/л)│ определений │ n│ │ │ n │

├────────────────┼─────────────┼──────┼─────┼────────────┼───────────────────┤

└────────────────┴─────────────┴──────┴─────┴────────────┴───────────────────┘

SUM Х

_ n

где Х = ------; SUM - сумма значений.

Таблица 14

СТАТИСТИЧЕСКИЕ ПАРАМЕТРЫ КОНЦЕНТРАЦИИ ПЕСТИЦИДА,

СООБЩАЮЩЕГО ВОДЕ ЗАПАХ (ПРИВКУС) В 1 И 2 БАЛЛА

┌─────────────┬────────────────────────┬─────────────────────────┐

│Интенсивность│Статистические параметры│ Нижняя доверительная │

│ запаха ├─────┬─────┬─────┬──────┤ граница (мг/л) │

│ │ │ _ │ │ │ _ │

│ │ n │ Х │ Р │ S │ Х - 2S_ │

│ │ │ │ │ х │ х │

├─────────────┼─────┼─────┼─────┼──────┼─────────────────────────┤

│1 балл │ │ │ │ │ │

│2 балла │ │ │ │ │ │

└─────────────┴─────┴─────┴─────┴──────┴─────────────────────────┘

S_ х 100

где Р = --------, Р х 10.

Концентрация пестицида, сообщающая воде запах интенсивностью в 1 балл,

является пороговой. Величина этой концентрации принимается по нижней

_ _

доверительной границе (Х - 2S_), где Х - средняя арифметическая, S_ -

х х

средняя ошибка среднего арифметического.

Определение привкуса воды проводится аналогично в трех сериях разведений пестицида. Между определениями ополаскивают ротовую полость контрольной водой. Статистическая обработка проводится вышеуказанным методом.

Запах воды определяется при температуре 20 - 60 °С, привкуса - при 20 °С. Для приготовления растворов могут быть использованы также колодезная, родниковая или другая вода, не имеющая посторонних запахов и привкусов.

Если установлено, что форма препарата оказывает влияние на органолептические свойства воды, то нормирование проводится по той форме, при которой отмечается наиболее низкий порог.

Определение стабильности запаха и привкуса воды. Для этой цели готовят растворы с концентрацией пестицида, сообщающей воде запах (или привкус) в 1, 3, 5 баллов. Растворы наливают в колбы емкостью 1 - 2 л и плотно закрывают.

Определение запаха проводят через 1, 3, 5, 7, 10 дней после внесения пестицида. Если пестициды сообщают воде стабильный запах (или привкус), то наблюдение проводят также на 15, 20, 25, 30-й день. Через эти же интервалы или реже определяют наличие вещества в воде химическим или биологическим методом и сравнивают полученные результаты с исходными (до помещения раствора в склянку).

Влияние хлорирования на органолептические свойства воды, содержащей пестициды. Для выяснения возможного ухудшения органолептических свойств воды под влиянием хлорирования, проводятся специальные исследования. Вода, содержащая пестицид в концентрации, сообщающей ей запах интенсивностью в один балл, обрабатывается такими дозами хлора, которые обеспечивают наличие остаточного свободного хлора в воде в количестве 0,3 - 0,5 мг/л. Определение запаха (или привкуса) проводится через 30 минут, 1, 12, 24 часа после внесения хлора при температуре воды 18 - 20 °С и 60 °С.

Исследования проводятся бригадой тех же одораторов. В результате

устанавливаются концентрации пестицида, при которых хлорирование усиливает

запах (или привкус) с 1 до 2 баллов. В случае усиления интенсивности запаха

(или привкуса) при хлорировании воды, определяется та

концентрация пестицида в воде, при которой после хлорирования появляется

запах (или привкус) интенсивностью в 1 балл. Эта концентрация будет

пороговой (принимается как нижняя доверительная граница (Х - 2S_).

Влияние пестицида на цветность и прозрачность воды. Определяется такая

максимальная концентрация пестицида, которая не дает окраски в слое высотой

10 - 12 см и при которой не нарушается прозрачность слоя воды не менее 20

см. Эту концентрацию (Х - 2S_) можно считать пороговой.

б) Изучение влияния пестицидов

на общий санитарный режим водоемов

Самоочищение воды от органических веществ протекает в две последовательные и неразрывные фазы. I - превращение органических веществ в неорганические (фаза минерализации, определяемая по БПК, которая осуществляется в результате жизнедеятельности гетеротрофных бактерий) и II - окисление аммонийных и азотно-кислых солей, при котором выделяется энергия, необходимая для усвоения бактериями углерода угольной кислоты (фаза нитрификации, осуществляемая благодаря автотрофным бактериям).

Изучение динамики биохимического потребления кислорода (БПК).

Определение БПК проводится по общепринятой методике (см. "Пособие по

методам санитарно-гигиенического исследования воды". Информационный

бюллетень N 25 - 26, Москва, 1959 г.) в склянках Винклера через 1, 3, 5, 7,

10, 20 суток после добавления к воде пестицида в концентрации, пороговой по

одному из показателей органолептических свойств воды, а также меньшей на

одни и два порядка. Одновременно определяется БПК контроля, для которого

используется та же вода, не содержащая испытуемого вещества. Для

постановки этой серии исследований используется вода, имеющая окисляемость

не менее 8 - 10 мг/л O и содержащая не менее 8 - 10 мг/л растворенного

кислорода. При этом БПК за первые сутки должно быть в контроле не менее 0,5

- 1,0 мг/л O . В случае стимулирования БПК в результате внесения пестицида,

определяется константа скорости потребления кислорода.

С этой целью применяется формула:

1 1

К = - lg -------,

t Д - Д

2 1

где:

К - константа скорости потребления кислорода;

Д - БПК за t дней O , мг/л,;

1 2

Д - БПК за 2t дней O , мг/л.

2 2

В результате устанавливается та минимальная концентрация пестицида в воде, которая не влияет на биохимическое потребление кислорода.

Одновременно из склянок Винклера, в которых будет проводиться определение остаточного количества растворенного кислорода для расчета БПК, проводится посев воды в мясопептонный агар для определения общего бактериального обсеменения. Посевы выращиваются при 20 - 22 °С в течение 48 часов.

Эти исследования позволяют установить характер влияния вещества на бактерии и установить концентрации, не влияющие на них.

Изучение влияния пестицида на процессы аммонификации и нитрификации. Для этой цели проводятся исследования в модельных водоемах емкостью 10 - 20 л, куда наливается вода с окисляемостью 8 - 10 мг/л. В воде создаются разные концентрации пестицида - пороговая по влиянию на органолептические свойства и на один и два порядка ниже. Параллельно в тех же условиях содержится контрольная вода, не содержащая испытуемого вещества.

Через 1, 3, 5, 7, 10, 20, 30 дней определяется содержание азота, аммиака, нитритов и нитратов и сравнивается с контролем. Определение проводят по методам, описанным в вышеуказанном пособии. Таким образом, определяется максимальная концентрация пестицида, которая не влияет на процессы нитрификации. Эта концентрация будет недействующей по этому признаку.

Одновременно в этих же модельных водоемах в указанные сроки определяется растворенный кислород, окисляемость и pH, что позволяет установить концентрации пестицида, не влияющие на эти показатели в соответствии с требованиями "Правил охраны поверхностных вод от загрязнения сточными водами" N 372-61.

в) Изучение фактического содержания остаточных количеств

пестицидов в воде, рыбе, водоплавающей птице, иле,

водной растительности

Для проведения этих исследований одновременно отбираются пробы воды, рыб, водоплавающей птицы, растительности и ила из одного и того же водоема.

Параллельные исследования этих объектов на содержание пестицида позволяют установить циркуляцию его в водоеме. С близлежащих территории отбираются также пробы почвы и подпочвенных вод.

Отбор проб. Пробы воды отбираются из открытых малых (пруды, ручьи) и средних водоемов на расстоянии 2 - 5 м от берега. Кроме пунктов водоиспользования рекомендуется отбирать пробы в местах впадения притоков, ручьев и потоков дождевых и талых вод в открытые водоемы, а также в местах выклинивания грунтовых вод. Количество проб воды и ила зависит от ширины и глубины водоема. При ширине водоема 15 - 20 м и глубине до 1 м отбирается проба воды на середине водоема на глубине 0,5 м. При большей глубине и ширине водоема пробы отбираются батометром с обоих берегов на глубине 0,5 м от поверхности и 0,5 м от дна.

При контроле за загрязнением пестицидом крупных водоемов пробы могут отбираться в нескольких точках по створу и на двух указанных глубинах. При глубине водоема 10 - 15 м можно отбирать несколько проб по вертикали.

Для забора проб подпочвенных вод наиболее удобно использовать колодцы (шахтные, буровые), которые служат источниками водоснабжения. Необходимо забирать воду из колодцев населенных пунктов, расположенных в пойме рек, озер, на полевых станах и т.д.

Проба ила отбирается в 2 - 5 м от берега.

Одновременно проводится отбор проб всех видов рыбы и водоплавающей птицы данного водоема, а также водных растений. Пробы всех объектов исследований отбираются до начала обработки и после нее. Сроки отбора проб после окончания применения пестицидов устанавливаются с учетом стабильности пестицида в воде и почве. Параллельно с химическим исследованием определяются органолептические свойства воды, мяса рыбы и водоплавающей птицы.

Водопроводы. Вода отбирается в местах водозабора или из приемного колодца станции первого подъема, при выходе из резервуара чистой воды, в точках потребления (водоразборные колонки и краны).

Пробы воды отбираются в стеклянную посуду объемом 2 л или в банки объемом 0,5 л, рыбы и растений - в целлофановые мешочки при соблюдении общепринятых правил отбора проб. Каждая проба нумеруется и снабжается направлением на анализ, где указывается дата и время отбора, населенный пункт, место отбора пробы (водоем, колодец и т.д.), точка взятия пробы (у берега, глубину и т.п.), температура воды в момент отбора пробы, на какой пестицид необходимо провести анализ, куда направляется проба, кто отбирал пробу. Во всех случаях отбираются параллельные 2 пробы. Из каждой пробы производится 3 анализа.

Отбор пробы почвы. Образцы почв отбираются почвенным буром или лопатой из горизонтов 0 - 5 см и 20 - 30 см. С каждого почвенного горизонта отбирается 5 средних проб.

На площади 1 - 5 га по диагоналям намечается 5 участков, каждый площадью 1 кв. м, в которых из 5 точек перекрестно-диагональным способом отбирается по 0,5 кг почвы. Почву, отобранную с каждого участка, раскладывают на брезенте, тщательно перемешивают и готовят среднюю пробу весом 0,5 - 1 кг. Средние образцы почвы сушат в помещении при комнатной температуре или в естественных условиях при отсутствии ветра и яркого солнечного освещения. Их доводят до воздушно-сухого состояния и хранят в целлофановых мешках или стеклянных банках, картонных или деревянных коробках. В образцы проб обязательно вкладывается этикетка с указанием времени обработки растений, наименования и количества израсходованного препарата на 1 га. Каждая проба анализируется 3 раза.

Для изучения закономерности циркуляции пестицида в трех модельных водоемах - аквариумах емкостью 15 - 20 л - создаются разные концентрации пестицида. Одна концентрация создается на уровне пороговой по влиянию на органолептические свойства воды или общий санитарный режим, вторая - на порядок величины меньше этой пороговой концентрации и третья - на порядок величин больше таковой.

Контроль - вода, содержащаяся в аналогичных условиях, но без пестицида. Во все водоемы вносятся водные растения, рыбы, используемые человеком в питании, и донный песок.

В пробах воды, ила, водных растений и рыбы через 1, 5, 10, 20, 30 суток определяется количество пестицида. Кроме того, мышечная ткань рыб одорируется (сырая и вареная) и дегустируется (вареная). Органолептическим исследованиям подвергается также бульон от пробной варки рыб. Исследования проводятся так же, как при определении органолептических свойств пищевых продуктов (см. гл. "Гигиеническая оценка пищевых продуктов"). Устанавливается концентрация пестицида, которая не вызывает изменений органолептических свойств рыбы и при которой в мышечной ткани рыбы остаточные количества пестицида не превышают допустимые для пищевых продуктов. Параллельно определяется количество пестицида в иле и водных растениях. Результаты химических исследований протоколируются в журнале по форме, приведенной в табл. 15.

Таблица 15

РЕЗУЛЬТАТЫ ХИМИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ ВОДЫ И ДРУГИХ ОБЪЕКТОВ

N п/п	N пробы	Дата отбора	Кем на- правлена проба	Название водоема	Объект иссле- дования	Глубина отбора пробы	Название пестицида	Количество (мг/л, мг/кг)	Метод анализа	Органо- лептические свойства	Приме- чание
1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12

Определение эффективности очистки питьевой воды

от пестицида

Устанавливается так называемая барьерная роль общепринятых методов очистки воды (коагулирование, фильтрование, хлорирование) с соблюдением дозировки реагентов, аналогичных применяемым на водопроводах. Испытывается эффективность этих методов на уровне пороговой концентрации пестицида по влиянию на органолептические свойства воды. Определяется концентрация пестицидов химическим методом до и после обработки. Результаты выражаются в процентах и учитываются при рекомендации ПДК в воде.

Материалы исследований по изучению влияния пестицида на органолептические свойства воды, на общий санитарный режим водоема, данные о фактическом содержании остаточных количеств и циркуляции пестицида в водоеме заносятся в сводную таблицу по образцу, представленному в табл. 16.

Таблица 16

СВОДНАЯ ТАБЛИЦА РЕЗУЛЬТАТОВ ГИГИЕНИЧЕСКОГО ИЗУЧЕНИЯ

ПЕСТИЦИДА В СВЯЗИ С САНИТАРНОЙ ОХРАНОЙ ВОДОЕМОВ

┌────────────────────────────────────────────────────────────────┐

│Показатели │

├────────────────────────────────────────────────────────────────┤

│Содержание пестицида в воде водоемов │

│Запах воды при 20 °С │

│Запах воды при 60 °С │

│Привкус воды │

│Определение при хлорировании: запаха │

│ привкуса │

│Окраска при высоте столба: 10 см │

│ 20 см │

│Прозрачность при высоте столба 20 см │

│БПК │

│Процессы аммонификации │

│Процессы нитрификации │

│Водная микрофлора │

│Фактическое содержание пестицида в воде │

│Накопление в рыбе │

│Органолептические свойства мяса рыбы │

│Накопление в мясе водоплавающей птицы │

│Органолептические свойства мяса водоплавающей птицы │

│Накопление в водной растительности │

│Накопление в иле │

│Накопление в почве и почвенных водах │

│Лимитирующий показатель │

└────────────────────────────────────────────────────────────────┘

Для полноты общего представления о препарате целесообразно также отразить сведения о пороговой дозе, установленной в хроническом токсикологическом эксперименте.

г) Принцип установления ПДК в воде

При установлении ПДК пестицида в воде водоема необходимо исходить из следующего:

1. Лимитирующим показателем вредности может быть влияние на органолептические свойства воды, санитарный режим водоема, уровень фактического загрязнения воды, накопление пестицидов в рыбе и других объектах, результаты токсикологических исследований. В качестве ПДК предлагается пороговая концентрация по наиболее чувствительному тесту.

2. Предельно допустимая концентрация пестицида в воде устанавливается с

учетом возможного поступления вещества в организм человека и другими путями

(пищевыми продуктами, воздухом) и поэтому должна быть ниже максимально

допустимой суточной дозы (Д ) для человека.

Для обеспечения санитарной охраны водоемов, одновременно с установлением ПДК разрабатываются гигиенические регламентации применения пестицида. Этими регламентациями предусматривается:

1. Санитарно-защитная зона - расстояние от места проведения работ с пестицидами до уровня воды в открытом водоеме.

2. Условия применения пестицидов при обработке водоемов.

д) Рекомендации к составлению заключения

по гигиенической оценке нового пестицида в связи

с санитарной охраной водоемов

В заключении должны быть отражены следующие вопросы:

1. Возможность внедрения пестицида в практику обработки водоемов.

2. Обоснование ПДК в воде.

3. Регламентация условий применения для различных целей.

4. Санитарно-защитная зона.

5. Оценка эффективности очистки воды от пестицида существующими методами.

6. ГИГИЕНИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА ПЕСТИЦИДОВ С ЦЕЛЬЮ РЕГЛАМЕНТАЦИИ

И НОРМИРОВАНИЯ ИХ В АТМОСФЕРНОМ ВОЗДУХЕ

Источниками поступления пестицидов в воздух населенных пунктов могут быть:

1. Непосредственное применение в селитебной зоне.

2. Снос пестицидов при обработке близлежащих сельскохозяйственных и лесных массивов.

3. Промышленные отходы предприятий, выпускающих пестициды.

4. Почва, загрязненная пестицидами (вторичное загрязнение).

5. Склады для хранения пестицидов.

Основными задачами при изучении загрязнения атмосферного воздуха являются следующие:

а) Установление гигиенических нормативов содержания пестицида в атмосферном воздухе.

б) Определение зоны санитарного разрыва.

в) Регламентация методов и способов применения пестицида для предотвращения загрязнения атмосферного воздуха.

Для решения этих вопросов необходимо иметь данные о фактическом загрязнении атмосферного воздуха, токсических свойствах препарата, пороге рефлекторного действия малых концентраций пестицида на организм человека.

а) Изучение фактического загрязнения атмосферного

воздуха пестицидами

В задачу этих исследований входит определение зоны распространения пестицида от источника поступления в воздух и сроков нахождения препарата во внешней среде (воздухе, почве, растениях).

На степень фактического загрязнения атмосферного воздуха влияют: метеорологические факторы (температурный градиент, скорость и направление ветра, влажность воздуха, атмосферное давление); размер площади обработанного участка; количество и концентрация расходуемого препарата; агрегатное состояние и дисперсность пестицида; методы и способы его применения.

Устанавливается зависимость между обнаруженными концентрациями пестицида в атмосферном воздухе и перечисленными факторами.

Отбор проб воздуха. Для каждого пестицида необходимо экспериментально разработать оптимальные условия отбора проб воздуха путем подбора сорбента, который улавливал бы не только аэрозольные частицы, но и парообразную фазу. Объем протянутого воздуха должен быть не менее 1 куб. м.

Пробы воздуха отбирают на различных расстояниях от места применения пестицида. В сельской местности рекомендуются ориентировочные дистанции от 100 до 10 тыс. метров. В условиях города - от 50 до 2 тыс. метров.

Отбор проб воздуха необходимо осуществлять одновременно в 2 - 3 точках на данных расстояниях с подветренной стороны. В каждой точке в течение дня следует отбирать 5 - 8 проб. Все пробы отбираются в одно и то же время после обработки участка (30, 60 мин., 3 часа). Пробы воздуха берутся в период низкой величины турбулентного обмена в атмосфере, а также во время максимального повышения температуры воздуха.

Следует применять принцип суммации сорбента нескольких проб и объема протянутого воздуха. Другими словами, необходимо смешивать сорбент нескольких проб, отобранных в одно время и в идентичных условиях.

Для поглощения только аэрозольной формы препарата (хлорорганические вещества, нитрофенолы, мышьяк и медьсодержащие препараты, производные карбаминовой кислоты и др.) можно ограничиться фильтрами АФА-В-10, АФА-В-18, АФА-ХС-18, АФА-ХА-18, АФА-ХМ-18 и другими, а также фильтрующими материалами из волокнистой ткани и хлопчатобумажной ваты. Парообразная фаза препарата улавливается при протягивании воздуха через поглотительные растворы со скоростью не более 1 литра в минуту или через специальные молекулярные сорбенты - силикагель, активированный уголь, окись алюминия, фарфоровый порошок (скорость прохождения через эти сорбенты устанавливается в эксперименте). Определение пестицидов в атмосферном воздухе производится до установления их полного исчезновения.

Основным методом отбора проб атмосферного воздуха для выяснения степени загрязнения его пестицидами является метод аспирации. О загрязнении воздуха можно судить также и косвенно - на основании исследований проб дождевой воды, листьев, почвы.

Для сравнения результатов, полученных в различные времена года, необходимо взятые объемы воздуха привести к нормальным условиям, то есть к температуре 0° и атмосферному давлению 760 мм рт. ст. по формуле:

V Н

V = -----------------,

0 (1 + альфа t) 760

где:

V - объем воздуха, приведенный к нормальным условиям;

V - данный объем воздуха;

Н - барометрическое давление в момент взятия пробы;

альфа - коэффициент объемного расширения воздуха, равный 1/273;

t - температура воздуха во время взятия пробы.

Полученные результаты исследований нужно изложить по схеме, приведенной в табл. 17.

Таблица 17

СВОДНАЯ ТАБЛИЦА ПО ОПРЕДЕЛЕНИЮ ФАКТИЧЕСКОГО ЗАГРЯЗНЕНИЯ

АТМОСФЕРНОГО ВОЗДУХА ПЕСТИЦИДАМИ

Дни
иссле-
дова-
ний

Концентрация
(мг/куб. м)

Расстояние точек отбора проб
воздуха от места обработки (м)

Обрабо-
танная
площадь
(га)

Концентрация
и количество
препарата на
1 га

Метод и
способ
обра-
ботки

Метеорологические условия

темпе-
ратура
воздуха
(°С)

влажность
воздуха
(%)

скорость
ветра
(м/сек.)

атмо-
сферное
давление
(мм рт.
ст.)

100

500

1000

2000

5000

7000

10000

Максимально
разовая
среднесуточ-
ная
% полож.
проб

б) Изучение рефлекторного действия пестицидов на человека

Исследования должны быть направлены на выявление пороговых и подпороговых концентраций пестицида, оказывающих рефлекторное действие на человека. Оно проводится в соответствии с рекомендуемой программой (см. В.А. Рязанов "Предельно допустимые концентрации атмосферных загрязнений", вып. 1 - 9).

С этой целью необходимо определить порог запаха и раздражающего действия препарата по его влиянию на функциональное состояние коры головного мозга методами адаптометрических и электроэнцефалографических исследований.

в) Подход к нормированию ПДК пестицидов

в атмосферном воздухе

В качестве максимально разовой ПДК пестицида принимается подпороговая концентрация, определенная при изучении рефлекторного действия пестицида на человека.

Для обоснования среднесуточной ПДК в атмосферном воздухе необходимо использовать пороговую концентрацию, установленную в хроническом токсикологическом эксперименте в течение 4 - 6 месяцев при 4-часовой ежедневной экспозиции, которая служит для обоснования ПДК в воздухе рабочей зоны (раздел II, глава 3).

Следует отметить, что контакт с пестицидами в условиях сельского хозяйства носит сезонный и, в большинстве случаев, непродолжительный характер. Кроме того, в атмосферном воздухе происходит последовательное снижение концентрации пестицида, начиная с момента его применения. В связи с вышеизложенным нет необходимости проводить специальные исследования с круглосуточной ингаляционной затравкой животных в течение длительного периода.

Среднесуточную предельно допустимую концентрацию пестицида в атмосферном воздухе рекомендуется устанавливать на 1 - 2 порядка меньше величин, чем пороговая концентрация, определенная в хроническом опыте на животных. Коэффициент запаса должен быть увеличен для высокотоксичных пестицидов, обладающих узкой зоной токсического действия, резко выраженными кумулятивными свойствами и кожно-резорбтивными свойствами, а также для препаратов, представляющих потенциальную опасность в отношении отдаленных последствий. Запас увеличивают при условии длительного пребывания пестицида в атмосферном воздухе и поступлении его в организм человека с пищей и водой. Следует также принимать во внимание вероятность воздействия пестицида на более ранимые контингенты населения (детей, стариков, больных).

г) Регламентация условий применения пестицидов

На основании сопоставления данных о фактическом загрязнении атмосферного воздуха пестицидом и дальности распространения его с рекомендуемыми предельно допустимыми концентрациями устанавливается санитарно-защитная зона.

Фактическое загрязнение атмосферного воздуха сопоставляется с методом и способом применения пестицида, формой и концентрацией препарата, расходом его на гектар площади, учитывают метеорологические условия. Полученные данные служат основанием для рекомендации наиболее приемлемых с гигиенической точки зрения условий использования пестицида.

д) Рекомендации к составлению заключения по гигиенической

оценке пестицидов с позиций защиты атмосферного воздуха

В заключении должны быть отражены следующие вопросы:

а) источники поступления пестицида в атмосферный воздух;

б) зона распространения пестицида от источника поступления;

в) сроки обнаружения пестицида в атмосферном воздухе после обработки и в каких концентрациях;

г) обоснование максимально-разовой и среднесуточной допустимой концентрации пестицида в атмосферном воздухе;

д) обоснование размера зоны санитарного разрыва;

е) регламентация условий применения пестицида.

IV. РЕКОМЕНДАЦИИ К СОСТАВЛЕНИЮ ОБЩЕГО ЗАКЛЮЧЕНИЯ

ПО ТОКСИКОЛОГО-ГИГИЕНИЧЕСКОЙ ОЦЕНКЕ НОВОГО ПЕСТИЦИДА

Заключение направляется в проблемную комиссию "Научные основы гигиены и токсикологии пестицидов" и Комитет по изучению и регламентации ядохимикатов.

В заключении должны отражаться следующие вопросы:

1. Полная токсикологическая характеристика вещества (параметры токсичности, с указанием пороговых доз и клинической картины при остром и хроническом отравлениях, коэффициент кумуляции, свойство вызывать отдаленные патологические эффекты и количества, их вызывающие, способность выделяться с молоком).

2. Отнесение пестицида к определенной группе гигиенической классификации.

3. Вывод о допустимости использования препарата в сельском хозяйстве. При решении указанного вопроса следует основываться на лимитирующем критерии, то есть, если хотя бы по одному из показателей (стойкость, токсичность, кумуляция, бластомогенность, эмбриотоксичность и т.д.) вещество относится к I группе гигиенической классификации пестицидов, то такое вещество не может быть внедрено в практику.

4. При отнесении вещества к последующим группам гигиенической классификации должны быть рекомендованы регламенты, гарантирующие безопасность его применения.

5. Обоснование ПДК препарата в рабочей зоне, воде, атмосферном воздухе, ДОК и толерантности в пищевых продуктах.

Привести рекомендуемые предельно допустимые концентрации в воздухе, воде, ДОК и толерантность в пищевых продуктах, тщательно их обосновать экспериментальными данными и данными, полученными в результате гигиенических исследований различных сред.

6. Описание метода определения содержания пестицида в воздухе, воде, пищевых продуктах, указать необходимые реактивы, оборудование.

7. Рекомендации наиболее рациональных, с гигиенических позиций, условий применения пестицида.

В результате сравнительной гигиенической оценки различных форм пестицидов (дусты, эмульсии, суспензии), способов (опыливание, опрыскивание и т.д.) и методов его применения (авиационный, наземный) необходимо рекомендовать самые безопасные из них. При этом в качестве важнейших критериев должны использоваться данные о загрязнении пестицидом продовольственных и технических культур, атмосферного воздуха, водоемов на различном расстоянии от места применения. Кроме того, должны быть внесены предложения по улучшению конструкции машин и аппаратов для применения пестицидов.

8. Сроки выхода на работу после применения пестицида.

Сроки устанавливаются с учетом ПДК и типа проводимых работ (взрыхление почвы, чеканка хлопчатника и др.).

9. Регламентация условий обработки продовольственных, кормовых и технических культур с обоснованием сроков ожидания. Регламентация условий обработки животных и птицы.

10. Рекомендации по спецодежде и средствам индивидуальной защиты.

V. РЕКОМЕНДАЦИИ К СОСТАВЛЕНИЮ ИНСТРУКЦИИ

ДЛЯ САНИТАРНЫХ ВРАЧЕЙ ПО КОНТРОЛЮ ЗА ПРИМЕНЕНИЕМ

ПЕСТИЦИДА В СЕЛЬСКОМ ХОЗЯЙСТВЕ

В инструкции приводится название препарата, синонимы его, структурная формула, описываются физические и химические свойства с обязательным приведением данных о стойкости, летучести и растворимости в воде и органических растворителях. Кратко говорится о том, против вредителей каких сельскохозяйственных культур и в какие сезоны года, месяцы, за сколько времени до снятия урожая будет применяться препарат, дается описание форм, методов и способов его применения, обусловливаются концентрации и нормы расхода.

Описываются токсические свойства пестицида для теплокровных животных и человека, пути возможного поступления его в организм, кумулятивные свойства, клиническая картина острого и хронического отравления, первая помощь при отравлении. Приводятся данные о сравнительной токсичности пестицида и других, ранее изученных, препаратов.

Приводятся ПДК в воздухе рабочей зоны, атмосферном воздухе, ДОК и толерантность в пищевых продуктах, ПДК в воде.

Описывается метод определения пестицида в различных средах.

Даются рекомендации по организации работ с пестицидом, гарантирующие безопасность работающих.

Определяются противопоказания для работы с данным пестицидом; кроме того, указываются наиболее рациональные, с гигиенической точки зрения, способы применения (учитываются физико-химические свойства, агрегатное состояние, токсичность пестицида, пути поступления в организм). Рекомендуется комплект спецодежды и индивидуальных защитных приспособлений.

Описываются меры предосторожности, которые необходимо соблюдать при хранении, транспортировке и применении препаратов.

При рекомендации этих мер следует учитывать форму применения и свойства препарата: летучесть, стойкость и т.д. Необходимо дать рекомендации по методу дегазации пестицида, тары, спецодежды, аппаратуры и др. Даются рекомендации по личной гигиене.

Приводится порядок осуществления санитарного контроля за проведением работ с пестицидом.

Дается краткая гигиеническая характеристика пищевых продуктов, полученных от продовольственных культур, обработанных препаратом.

Необходимо сопоставить характеристику пищевых продуктов с методами и сроками обработки продовольственных культур и расходом препарата на площадь посевов. Такое сопоставление позволит санитарным работникам выявить нарушения условий использования пестицида для обработки продовольственных культур.

Указываются сроки ожидания (период времени от окончания обработки до снятия урожая) для различных продовольственных, технических и кормовых культур. Регламентируются условия обработки сельскохозяйственных растений.

Дается характеристика пищевых продуктов, полученных от обработанных животных и птицы, характеристика яиц. Сопоставляются сведения о качестве пищевых продуктов с условиями обработки животных и птицы, регламентируются эти условия.

Рекомендуются пути осуществления санитарного контроля за пищевыми продуктами, подвергшимися воздействию пестицида.

В этом разделе следует отразить:

а) рекомендации по контролю за правильным применением препарата в сельском хозяйстве для обработки продовольственных культур, в соответствии с действующими инструкциями Министерства сельского хозяйства СССР. Приводится толерантность каждого пищевого продукта;

б) в каких случаях нет надобности подвергать пищевые продукты лабораторному исследованию (по материалам гигиенической оценки пищевых продуктов);

в) санитарную экспертизу пищевых продуктов (определение органолептических свойств и остаточных количеств пестицидов);

г) порядок вынесения заключения по санитарной экспертизе.

При составлении заключения о качестве пищевых продуктов, полученных от растений и животных, подвергшихся воздействию пестицидов, необходимо исходить из данных органолептических свойств и допустимых остаточных количеств их в пищевых продуктах.

При наличии в данном пищевом продукте пестицида в количествах, превышающих допустимые, должны быть даны рекомендации о порядке использования такого продукта (подсортировка, выдерживание в течение определенного срока до реализации, термическая обработка, соответствующая технологическая переработка, консервирование, варка и т.д.).

Если указанные мероприятия неприемлемы, пищевые продукты бракуют и в питание не допускают.

При решении вопроса о реализации пищевого продукта, случайно загрязненного пестицидом, исходят из ДОК, принадлежности его к определенной группе гигиенической классификации, удельного веса в пищевом рационе.

Приводятся рекомендации по охране воды, водоемов, а также рыбы, которая водится в таких водоемах. Даются рекомендации по осуществлению контроля за водными источниками и рыбой, атмосферным воздухом, регламентируются условия применения, предупреждающие загрязнения атмосферного воздуха и воды.

Приложения

Приложение 1

Выписка из Приказа

по Министерству

здравоохранения СССР

от 10 марта 1966 г. N 163

СУТОЧНЫЕ НОРМЫ КОРМОВ

ДЛЯ ЛАБОРАТОРНЫХ ЖИВОТНЫХ И ПРОДУЦЕНТОВ

Таблица N 1

СУТОЧНЫЕ НОРМЫ КОРМОВ ДЛЯ ЛАБОРАТОРНЫХ МЫШЕЙ

(В ГРАММАХ НА ОДНО ЖИВОТНОЕ)

Вариант N 1

┌─────────┬───────┬───────────────────────────────────────────────────────────────────────┐

│ Группа │Вес жи-│ Наименование кормов │

│животных │вотных ├─────┬───────┬─────┬────┬───┬────┬───┬────┬────┬─────┬──────┬─────┬────┤

│ │(г) │зер- │хлеб │крупа│дет-│мо-│соч-│се-│зе- │рыб-│дрож-│рыбий │кост-│соль│

│ │ │новая│пшенич-│овся-│ская│ло-│ные │но │лень│ная │жи │жир │ная │по- │

│ │ │смесь│ный из │ная │мука│ко │кор-│лу-│ │мука│кор- │(вита-│мука │ва- │

│ │ │ │муки │ │ │ │ма │го-│ │ │мовые│мини- │ │рен-│

│ │ │ │2-го │ │ │ │ │вое│ │ │ │зир.) │ │ная │

│ │ │ │сорта │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │

├─────────┼───────┼─────┼───────┼─────┼────┼───┼────┼───┼────┼────┼─────┼──────┼─────┼────┤

│Взрослое │ │11 │1,8 │3 │0,2 │10 │3 │2 │4 │0,3 │0,2 │0,1 │0,2 │0,1 │

│производ-│ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │

│ственное │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │

│поголовье│ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │

│Молодняк │8 - 14 │4 │0,9 │1 │- │4 │1,5 │1 │1,5 │0,1 │0,1 │0,05 │0,1 │0,05│

│Молодняк │14 - 22│5 │1,3 │2 │- │4 │2 │1 │2 │0,2 │0,1 │0,05 │0,2 │0,1 │

└─────────┴───────┴─────┴───────┴─────┴────┴───┴────┴───┴────┴────┴─────┴──────┴─────┴────┘

СУТОЧНЫЕ НОРМЫ КОРМОВ ДЛЯ МОЛОДНЯКА ЛАБОРАТОРНЫХ МЫШЕЙ

(В ГРАММАХ НА ОДНО ЖИВОТНОЕ)

Вариант N 2

┌────────────┬───────────────────────────────────────────────────┐

│Вес животных│ Наименование кормов │

│ (в г) ├──────┬──────┬──────┬──────┬────┬─────────┬────────┤

│ │брикет│молоко│сочные│сено │зе- │нерафини-│рыбий │

│ │ N 1 │ │корма │(луго-│лень│рованное │жир │

│ │ │ │ │вое) │ │подсол- │(витами-│

│ │ │ │ │ │ │нечное │низир.) │

│ │ │ │ │ │ │масло │ │

├────────────┼──────┼──────┼──────┼──────┼────┼─────────┼────────┤

│8 - 14 │4,5 │4 │1,5 │1 │2 │0,1 │0,05 │

│14 - 22 │6 │4 │2 │1 │2,5 │0,1 │0,05 │

└────────────┴──────┴──────┴──────┴──────┴────┴─────────┴────────┘

Примечания:

1. Взрослые подопытные животные (весом свыше 22 г) кормятся по норме молодняка старшего возраста.

2. Норма кормов взрослого производственного поголовья рассчитана с учетом кормов для подсоса.

3. Ремонтный молодняк по достижении половой зрелости переводится на норму кормов взрослого производственного поголовья.

4. При кормлении животных брикетированными кормами необходим постоянный доступ к чистой воде, который обеспечивается автопоением.

5. Состав зерновой смеси: овес - 70%, просо - 10%, пшеница - 10%, подсолнечник - 10% (для линейных мышей: овес - 50%, просо - 10%, пшеница - 20%, подсолнечник - 20%).

6. Пшеница дается в пророщенном виде.

7. Овсяная крупа может быть заменена пшеном.

8. Для выращивания зелени используется семенное зерно из расчета: 1 г зерна для получения 5 г зелени вместе с промытыми корнями. Семенное зерно выделяется дополнительно к зерновой смеси.

9. Молоко может быть заменено равноценным по питательности количеством творога.

10. Из сочных кормов следует скармливать красную морковь (преимущественно), кормовую или сахарную свеклу, капусту.

Таблица N 2

СУТОЧНЫЕ НОРМЫ КОРМОВ ДЛЯ ЛАБОРАТОРНЫХ КРЫС

(В ГРАММАХ НА ОДНО ЖИВОТНОЕ)

Вариант N 1

┌─────────┬─────────┬──────────────────────────────────────────────────────────────────────────────┐

│ Группа │ Вес │ Наименование кормов │

│ │животных ├─────┬───────┬─────┬──────┬───┬─────┬────┬────┬──────┬──────┬──────┬─────┬────┤

│ │ (в г) │зер- │хлеб │крупа│комби-│мо-│мясо │соч-│зе- │рыбий │рыбная│дрожжи│кос- │соль│

│ │ │новая│пшенич-│овся-│корм │ло-│2-й │ные │лень│жир │ мука │кормо-│тяная│по- │

│ │ │смесь│ный из │ная │для │ко │кате-│кор-│ │(вита-│ │вые │мука │ва- │

│ │ │ │муки │ │молоч-│ │гории│ма │ │мини- │ │ │ │рен-│

│ │ │ │2-го │ │ных │ │ │ │ │зир.) │ │ │ │ная │

│ │ │ │сорта │ │телят │ │ │ │ │ │ │ │ │ │

├─────────┼─────────┼─────┼───────┼─────┼──────┼───┼─────┼────┼────┼──────┼──────┼──────┼─────┼────┤

│Взрослое │- │35 │12 │9 │10 │25 │10 │20 │15 │0,5 │1,0 │0,5 │0,5 │0,3 │

│производ-│ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │

│ственное │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │

│поголовье│ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │

│Молодняк │40 - 130 │10 │2 │1,5 │- │5 │3 │5 │5 │0,1 │0,3 │0,1 │0,1 │0,1 │

│Молодняк │130 - 240│15 │4 │3 │- │8 │5 │10 │10 │0,1 │0,5 │0,2 │0,2 │0,2 │

│Молодняк │240 - 350│15 │6 │4,5 │- │10 │7 │10 │10 │0,2 │0,7 │0,3 │0,3 │0,2 │

└─────────┴─────────┴─────┴───────┴─────┴──────┴───┴─────┴────┴────┴──────┴──────┴──────┴─────┴────┘

СУТОЧНЫЕ НОРМЫ КОРМОВ ДЛЯ МОЛОДНЯКА ЛАБОРАТОРНЫХ КРЫС

(В ГРАММАХ НА ОДНО ЖИВОТНОЕ)

Вариант N 2

┌────────────┬───────────────────────────────────────────────────┐

│Вес животных│ Наименование кормов │

│ (в г) ├──────┬──────┬──────┬──────┬───────────┬───────────┤

│ │брикет│молоко│сочные│зелень│нерафиниро-│рыбий жир │

│ │ N 1 │ │корма │ │ванное под-│(витамини- │

│ │ │ │ │ │солнечное │зир.) │

│ │ │ │ │ │масло │ │

├────────────┼──────┼──────┼──────┼──────┼───────────┼───────────┤

│40 - 130 │13 │5 │8 │5 │0,5 │0,1 │

│120 - 240 │20 │8 │10 │10 │1,0 │0,1 │

│240 - 350 │25 │8 │10 │10 │1,5 │0,2 │

└────────────┴──────┴──────┴──────┴──────┴───────────┴───────────┘

Примечания:

1. Взрослые подопытные животные (весом свыше 350 г) кормятся по норме молодняка старшего возраста.

2. Норма кормов взрослого производственного поголовья рассчитана с учетом кормов для подсоса.

4. При кормлении животных брикетированными кормами необходим постоянный доступ к чистой воде, который обеспечивается автоматическим поением.

5. Состав зерновой смеси: овес - 60%, просо - 10%, пшеница - 10%, подсолнечник - 20%.

6. Пшеница дается в пророщенном виде.

7. Овсяная крупа может быть заменена пшеном.

8. Для выращивания зелени используется семенное зерно из расчета 1 г зерна для получения 5 г зелени вместе с промытыми корнями. Семенное зерно выделяется дополнительно к зерновой смеси.

9. Из сочных кормов следует скармливать красную морковь (преимущественно), кормовую свеклу, капусту.

Таблица N 3

СУТОЧНЫЕ НОРМЫ КОРМОВ ДЛЯ ЛАБОРАТОРНЫХ МОРСКИХ СВИНОК

(В ГРАММАХ НА ОДНО ЖИВОТНОЕ)

Вариант N 1

┌─────────┬─────────┬──────────────────────────────────────────────────────────────────────────────────┐

│ Группа │ Вес │ Наименование кормов │

│ │животных ├────┬─────┬─────┬───┬──────────┬─────┬─────┬──────┬────┬────┬─────┬─────┬────┬────┤

│ │ (в г) │овес│отру-│крупа│мо-│ сочные │сено │трава│рыбий │зе- │рыб-│дрож-│хвой-│соль│ас- │

│ │ │ │би │овся-│ло-│ корма │луго-│луго-│жир │лень│ная │жи │ная │по- │кор-│

│ │ │ │ │ная │ко ├────┬─────┤вое │вая │(вита-│ │мука│кор- │мука │ва- │би- │

│ │ │ │ │ │ │ка- │свек-│ │ │мини- │ │ │мовые│ │рен-│но- │

│ │ │ │ │ │ │пус-│ла, │ │ │зир.) │ │ │ │ │ная │вая │

│ │ │ │ │ │ │та │мор- │ │ │ │ │ │ │ │ │кис-│

│ │ │ │ │ │ │ │ковь,│ │ │ │ │ │ │ │ │лота│

│ │ │ │ │ │ │ │кар- │ │ │ │ │ │ │ │ │ │

│ │ │ │ │ │ │ │то- │ │ │ │ │ │ │ │ │ │

│ │ │ │ │ │ │ │фель │ │ │ │ │ │ │ │ │ │

├─────────┼─────────┼────┼─────┼─────┼───┼────┼─────┼─────┼─────┼──────┼────┼────┼─────┼─────┼────┼────┤

│Взрослое │ │20 │20 │2,5 │23 │80 │40 │50 │350 │0,5 │15 │- │0,3 │0,5 │0,5 │0,02│

│производ-│ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │

│ственное │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │

│поголовье│ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │

│Молодняк │150 - 300│10 │14 │2,0 │10 │50 │30 │30 │200 │0,3 │6 │- │0,1 │0,1 │0,2 │0,01│

│Молодняк │Свыше 300│25 │10 │- │10 │70 │30 │40 │250 │0,3 │9 │- │0,2 │0,2 │0,3 │0,01│

│Продуцен-│Свыше 350│25 │15 │1,5 │15 │70 │40 │50 │350 │0,3 │9 │0,2 │0,2 │0,3 │0,3 │0,02│

│ты │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │

└─────────┴─────────┴────┴─────┴─────┴───┴────┴─────┴─────┴─────┴──────┴────┴────┴─────┴─────┴────┴────┘

СУТОЧНЫЕ НОРМЫ КОРМОВ

ДЛЯ МОЛОДНЯКА ЛАБОРАТОРНЫХ МОРСКИХ СВИНОК

(В ГРАММАХ НА ОДНО ЖИВОТНОЕ)

Вариант N 2

┌────────┬─────────┬──────────────────────────────────────────────────────┐

│ Группа │ Вес │ Наименование кормов │

│животных│животных ├──────┬────┬──────────┬────┬────┬────┬─────┬─────┬────┤

│ │ (в г) │брикет│мо- │ сочные │сено│тра-│зе- │рыбий│хвой-│ас- │

│ │ │ N 2 │локо│ корма │(лу-│ва │лень│жир │ная │кор-│

│ │ │ │ ├────┬─────┤го- │(лу-│ │(ви- │мука │би- │

│ │ │ │ │ка- │свек-│вое)│го- │ │та- │ │но- │

│ │ │ │ │пус-│кла, │ │вая)│ │мини-│ │вая │

│ │ │ │ │та │мор- │ │ │ │зир.)│ │кис-│

│ │ │ │ │ │ковь,│ │ │ │ │ │лота│

│ │ │ │ │ │кар- │ │ │ │ │ │ │

│ │ │ │ │ │то- │ │ │ │ │ │ │

│ │ │ │ │ │фель │ │ │ │ │ │ │

├────────┼─────────┼──────┼────┼────┼─────┼────┼────┼────┼─────┼─────┼────┤

│Молодняк│150 - 300│20 │10 │50 │30 │30 │200 │9 │0,3 │0,2 │0,01│

│Молодняк│Свыше 300│25 │10 │70 │30 │40 │250 │9 │0,3 │0,3 │0,01│

└────────┴─────────┴──────┴────┴────┴─────┴────┴────┴────┴─────┴─────┴────┘

Примечания:

1. Взрослые подопытные животные кормятся по норме молодняка старшего возраста.

2. Норма кормов взрослого производственного поголовья рассчитана с учетом кормов для подсоса.

4. Зелень и хвойная мука вводятся в рацион в зимне-весенний период.

5. Для выращивания зелени используется семенное зерно из расчета: 1 г зерна для получения 3 г зелени без корней. Семенное зерно выделяется дополнительно к зерну рациона.

6. Аскорбиновая кислота дается при отсутствии в рационе капусты или травы. Продуцентам аскорбиновая кислота дается в течение всего года.

7. Свинкам продуцентам дополнительно в рационе вводится 20 мг сернокислого железа и 1 мг сернокислой меди в сутки.

8. В летний период в зависимости от количества и качества скармливаемой травы из рациона полностью или частично исключается: сено, сочные корма, дрожжи и рыбий жир.

Таблица N 4

СУТОЧНЫЕ НОРМЫ КОРМОВ ДЛЯ ЛАБОРАТОРНЫХ КРОЛИКОВ

(В ГРАММАХ НА ОДНО ЖИВОТНОЕ)

Вариант N 1

┌────────┬─────────┬────────────────────────────────────────────────────────┐

│ Группа │ Вес │ Наименование кормов │

│животных│животных ├──────┬──────┬────┬────┬────┬────┬─────┬─────┬────┬─────┤

│ │ (в кг) │зерно │комби-│шрот│соч-│сено│тра-│рыбий│кост-│соль│дрож-│

│ │ │(овес)│корм │под-│ные │(лу-│ва │жир │ная │по- │жи │

│ │ │ │для │сол-│кор-│го- │(лу-│(ви- │мука │ва- │кор- │

│ │ │ │молоч-│неч-│ма │вое)│го- │тами-│ │рен-│мовые│

│ │ │ │ных │ный │ │ │вая)│ни- │ │ная │ │

│ │ │ │телят │ │ │ │ │зир.)│ │ │ │

├────────┼─────────┼──────┼──────┼────┼────┼────┼────┼─────┼─────┼────┼─────┤

│Взрослое│ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │

│произ- │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │

│водст- │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │

│венное │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │

│поголо- │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │

│вье: │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │

│самцы │- │75 │10 │5 │200 │100 │450 │0,5 │2,0 │1,0 │0,4 │

│самки │- │140 │50 │30 │400 │250 │1200│1,0 │3,5 │1,75│1,0 │

│Молодняк│0,8 - 1,5│60 │5 │5 │60 │80 │250 │0,3 │2,0 │0,6 │0,2 │

│от 1,5 │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │

│до 2 │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │

│месяцев │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │

│Молодняк│1,5 - 2,5│80 │10 │15 │120 │100 │400 │0,5 │2,0 │1,0 │0,4 │

│от 2 до │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │

│4 меся- │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │

│цев │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │

│Молодняк│2,5 - 3,5│80 │30 │10 │150 │150 │450 │0,5 │2,0 │1,25│0,4 │

│старше │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │

│4 меся- │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │

│цев │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │

│Проду- │Свыше 2,5│90 │30 │10 │200 │150 │500 │0,5 │2,0 │1,25│0,5 │

│центы │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │

└────────┴─────────┴──────┴──────┴────┴────┴────┴────┴─────┴─────┴────┴─────┘

СУТОЧНЫЕ НОРМЫ КОРМОВ ДЛЯ ЛАБОРАТОРНЫХ КРОЛИКОВ

(В ГРАММАХ НА ОДНО ЖИВОТНОЕ)

Вариант N 2

┌─────────────┬─────────┬────────────────────────────────────────┐

│ Группа │ Вес │ Наименование кормов │

│ животных │животных ├─────────┬──────┬───────┬──────┬────────┤

│ │ (кг) │гранули- │сочные│ сено │трава │рыбий │

│ │ │рованный │корма │луговое│(луго-│жир │

│ │ │комбикорм│ │ │вая) │(витами-│

│ │ │ │ │ │ │низир.) │

├─────────────┼─────────┼─────────┼──────┼───────┼──────┼────────┤

│Взрослое про-│ │ │ │ │ │ │

│изводственное│ │ │ │ │ │ │

│поголовье: │ │ │ │ │ │ │

│самцы │- │80 │200 │100 │450 │0,5 │

│самки │- │220 │400 │250 │1200 │1,0 │

│Молодняк │0,8 - 1,5│65 │60 │80 │250 │0,3 │

│от 1,5 до 2 │ │ │ │ │ │ │

│месяцев │ │ │ │ │ │ │

│Молодняк │1,5 - 2,5│95 │120 │100 │400 │0,5 │

│от 2 до 4 │ │ │ │ │ │ │

│месяцев │ │ │ │ │ │ │

│Молодняк │2,5 - 3,5│110 │150 │150 │450 │0,5 │

│старше 4 │ │ │ │ │ │ │

│месяцев │ │ │ │ │ │ │

└─────────────┴─────────┴─────────┴──────┴───────┴──────┴────────┘

Примечания:

1. Взрослые подопытные животные (весом свыше 3,5 кг) кормятся по норме молодняка старшего возраста.

2. Норма кормов самок рассчитана с учетом кормов для подсоса.

3. Ремонтный молодняк по достижении половой зрелости переводится на норму взрослого производственного поголовья.

4. Нормы кормов взрослого производственного поголовья являются средними для кроликов в период покоя, случки, беременности и лактации.

5. Из сочных кормов следует скармливать: морковь, кормовую или сахарную свеклу, капусту, брюкву, картофель, силос (морковно-капустный).

6. В летний период в зависимости от количества и качества скармливаемой травы из рациона полностью или частично исключается: сено, сочные корма, дрожжи, рыбий жир.

7. Лактирующим самкам в первые 20 дней лактации допускается дача молока в количестве 25 г на крольчонка.

8. Кроликам продуцентам дополнительно в рацион вводится 30 мг сернокислого железа, 2 мг сернокислой меди и 0,5 г хвойной муки в сутки.

Таблица N 5

СУТОЧНЫЕ НОРМЫ КОРМОВ ДЛЯ ПОДОПЫТНЫХ КОШЕК

(В ГРАММАХ НА ОДНО ЖИВОТНОЕ)

┌────────┬────────────────────────────────────────────────────────────────┐

│ Группа │ Наименование кормов │

│животных├────┬─────┬─────┬───┬────┬────┬────┬─────┬─────┬─────┬─────┬────┤

│ │хлеб│крупа│мясо │мо-│ка- │кар-│мор-│ши- │рыбий│дрож-│кост-│соль│

│ │пше-│овся-│2-й │ло-│пус-│то- │ковь│пов- │жир │жи │ная │по- │

│ │нич-│ная │кате-│ко │та │фель│ │ник │(ви- │пе- │мука │ва- │

│ │ный │ │гории│ │ │ │ │(пло-│тами-│кар- │ │рен-│

│ │из │ │ │ │ │ │ │ды) │низи-│ские │ │ная │

│ │муки│ │ │ │ │ │ │ │ро- │сухие│ │ │

│ │2-го│ │ │ │ │ │ │ │ван- │ │ │ │

│ │сор-│ │ │ │ │ │ │ │ный) │ │ │ │

│ │та │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │

├────────┼────┼─────┼─────┼───┼────┼────┼────┼─────┼─────┼─────┼─────┼────┤

│Взрослые│30 │20 │100 │150│40 │30 │20 │1 │3 │1,5 │4 │3 │

│кошки │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │

│Котята │20 │10 │60 │100│30 │20 │20 │1,5 │2 │1 │3 │1,5 │

└────────┴────┴─────┴─────┴───┴────┴────┴────┴─────┴─────┴─────┴─────┴────┘

Примечания: 1. Мясо может быть заменено равноценным по питательности количеством свежей рыбы.

2. Шиповник дается в виде настоя.

Таблица N 6

СУТОЧНЫЕ НОРМЫ КОРМОВ ДЛЯ ПОДОПЫТНЫХ СОБАК

(В ГРАММАХ)

┌────────┬────────┬───────┬─────────────────────────────────────────────────────────────────────┐

│ Группа │ Вес │Система│ Наименование кормов │

│животных│животных│расчета├─────┬─────┬─────┬─────┬───┬────┬────┬────┬────┬────┬─────┬─────┬────┤

│ │ (в кг) │ │хлеб │овся-│ячне-│мясо │мо-│кар-│мор-│ка- │све-│жир │дрож-│рыбий│соль│

│ │ │ │пше- │ная │вая │2-й │ло-│то- │ковь│пус-│кла │сви-│жи │жир │по- │

│ │ │ │нич- │крупа│крупа│кате-│ко │фель│ │та │ │ной │пе- │(ви- │ва- │

│ │ │ │ный │ │ │гории│ │ │ │ │ │топ-│кар- │тами-│рен-│

│ │ │ │из │ │ │ │ │ │ │ │ │ле- │ские │ни- │ная │

│ │ │ │муки │ │ │ │ │ │ │ │ │ный │ │зир.)│ │

│ │ │ │2-го │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │

│ │ │ │сорта│ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │

├────────┼────────┼───────┼─────┼─────┼─────┼─────┼───┼────┼────┼────┼────┼────┼─────┼─────┼────┤

│Взрослые│8 - 10 │На одно│100 │30 │30 │160 │120│100 │25 │40 │15 │12 │3 │3 │8 │

│собаки │ │живот- │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │

│ │ │ное │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │

│-"- │10 - 14 │ │125 │35 │35 │200 │125│125 │30 │50 │15 │16 │4 │4 │8 │

│-"- │14 - 17 │ │160 │40 │40 │250 │160│180 │40 │60 │20 │20 │5 │4 │10 │

│-"- │17 - 21 │ │200 │50 │50 │300 │200│200 │50 │75 │25 │25 │6 │5 │10 │

│-"- │Свыше 21│ │225 │55 │55 │330 │200│200 │50 │90 │25 │30 │6 │5 │10 │

│Щенки │ │На 1 кг│10 │8 │6 │17 │30 │9 │2,5 │4 │1,5 │2 │0,4 │0,4 │0,6 │

│ │ │живого │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │

│ │ │веса │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │

└────────┴────────┴───────┴─────┴─────┴─────┴─────┴───┴────┴────┴────┴────┴────┴─────┴─────┴────┘

Примечание. Щенок старше года переводится на норму кормов собак соответствующего веса.

Приложение 2

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ МЕТОДА НАИМЕНЬШИХ КВАДРАТОВ

ДЛЯ ПРОБИТ-АНАЛИЗА КРИВЫХ ЛЕТАЛЬНОСТИ

(В.Б. ПРОЗОРОВСКИЙ) <1>

--------------------------------

<1> Журнал "Фармакология и токсикология", 1962, N 1. Статья дана с сокращениями.

В настоящее время пробит-анализ кривых летальности прочно вошел в арсенал методов количественной фармакологии (М.Л. Беленький, 1959; В.Б. Прозоровский, 1960). Однако этот метод во всех его модификациях, несмотря на ряд неоспоримых достоинств, не может быть признан совершенным. Существенным недостатком метода является проведение прямой пробитного графика "на глаз". Субъективность такого построения усугубляется тем обстоятельством, что все точки на графике имеют разный "вес". Необходимость учета весов увеличивает число возможных вариантов проведения прямой между разбросанными точками, а следовательно, и вероятность ошибки в построении графика. Предложенный Личфильдом и Вилькоксоном (Litchfield, Wilcokson, 1949) способ последующей оценки правильности построения графика мало удовлетворяет требовательного исследователя, поскольку такая оценка убеждает лишь в том, что сделанная ошибка не чрезмерно велика. Приблизительность и субъективность пробит-анализа в его настоящем виде исчезает при использовании для расчета прямой графика метода наименьших квадратов. Применение этого метода для пробит-анализа кривых летальности было впервые предложено Н.А. Толоконцевым и В.Б. Прозоровским в их докладе на III Всесоюзном совещании по применению математики в биологии. Сущность метода наименьших квадратов сводится к нахождению такой прямой, расстояние от которой (точнее квадрат расстояния) у всех экспериментальных точек был бы наименьшим. При расчете учитывают также и вес точек, который тем больше, чем точка ближе к 50%.

Разберем применение метода наименьших квадратов на примере определения

летальности мышей при подкожном введении физостигмина. Примененные дозы

(Х ) и соответствующие им эмпирические значения летальности (У )

э э

представлены в табл. 1.

Таблица 1

РАСЧЕТ ПРЯМОЙ ГРАФИКА ДЛЯ ПРОБИТ-АНАЛИЗА КРИВОЙ ЛЕТАЛЬНОСТИ

МЫШЕЙ ПРИ ПОДКОЖНОМ ВВЕДЕНИИ ФИЗОСТИГМИНА

┌──────┬───────────┬──────┬────────┬────────────┬────┬─────┬──────┬───────┐

│ │ │ │ │ │ │ 2 │ │ │

│Доза в│Летальность│Место │Пробиты,│ Весовой │Х В │Х В │ У В │ Х У В │

│мг/кг,│ в %, У │доз, Х│ У │коэффициент,│ │ │ │ │

│ Х │ э │ │ │ В │ │ │ │ │

│ э │ │ │ │ │ │ │ │ │

├──────┼───────────┼──────┼────────┼────────────┼────┼─────┼──────┼───────┤

│0,75 │0 │1 │3,04 │1,0 │1,0 │1,0 │3,04 │3,04 │

│0,80 │40 │2 │4,75 │4,8 │9,6 │19,2 │22,78 │45,46 │

│0,85 │50 │3 │5,00 │5,0 │15,0│45,0 │25,00 │75,00 │

│0,90 │50 │4 │5,00 │5,0 │20,0│80,0 │25,00 │100,00 │

│0,95 │100 │5 │6,96 │1,0 │5,0 │25,0 │6,96 │34,80 │

│Сумма │ │ │ │16,8 │50,6│170,2│82,78 │258,30 │

└──────┴───────────┴──────┴────────┴────────────┴────┴─────┴──────┴───────┘

Следует указать, что согласно проведенному нами анализу 84 кривых летальности, полученных на кафедре фармакологии Ленинградского педиатрического медицинского института, при построении графика летальности на оси абсцисс предпочтительно откладывать не логарифмы доз, как рекомендуют многие авторы, а их абсолютные значения. Преимущество натуральной (арифметической) шкалы состоит в том, что при ее использовании большинство кривых оказывается симметричными, в то время как при использовании логарифмической шкалы большинство кривых приобретает левую асимметрию (В.Б. Прозоровский, 1961).

Значение испытанных доз (Х ) для последующих вычислений заменяют

условным обозначением места каждой дозы (Х). Если интервалы между дозами

равны (как в нашем примере), то места доз обозначают последовательными

целыми числами (1, 2, 3... и т.д.). Если же интервалы между дозами не

равны, то обозначенные места дозы определяют, исходя из величины того

интервала, который может считаться основным, и принимают за единицу.

Например, ряд доз 6,0; 6,3; 7,0; 7,6; 8,0 должен быть обозначен как 1,0;

1,3; 2,0; 2,6; 3,0. После заполнения графы Х по табл. 2 находят значения

пробитов (У), соответствующих экспериментальным значениям летальности (У ).

Таблица 2

ТАБЛИЦА ДЛЯ ПЕРЕВОДА ПРОЦЕНТОВ В ПРОБИТЫ ПО БЛИССУ

(BLISS, 1938)

┌────┬─────┬─────┬─────┬─────┬─────┬─────┬─────┬─────┬─────┬─────┐

│ % │ 0 │ 1 │ 2 │ 3 │ 4 │ 5 │ 6 │ 7 │ 8 │ 9 │

├────┼─────┼─────┼─────┼─────┼─────┼─────┼─────┼─────┼─────┼─────┤

│0 │- │2,67 │2,95 │3,12 │3,25 │3,36 │3,44 │3,52 │3,60 │3,66 │

│10 │3,72 │3,77 │3,82 │3,87 │3,92 │3,96 │4,01 │4,05 │4,08 │4,12 │

│20 │4,16 │4,19 │4,23 │4,26 │4,29 │4,33 │4,36 │4,39 │4,42 │4,45 │

│30 │4,48 │4,50 │4,53 │4,56 │4,59 │4,62 │4,64 │4,67 │4,70 │4,72 │

│40 │4,75 │4,77 │4,80 │4,82 │4,85 │4,87 │4,90 │4,92 │4,95 │4,98 │

│50 │5,00 │5,02 │5,05 │5,08 │5,10 │5,13 │5,15 │5,18 │5,20 │5,23 │

│60 │5,25 │5,28 │5,30 │5,33 │5,36 │5,38 │5,41 │5,44 │5,47 │5,50 │

│70 │5,52 │5,55 │5,58 │5,61 │5,64 │5,67 │5,71 │5,74 │5,77 │5,81 │

│80 │5,84 │5,88 │5,92 │5,95 │5,99 │6,04 │6,08 │6,13 │6,18 │6,23 │

│90 │6,28 │6,34 │6,40 │6,48 │6,56 │6,64 │6,75 │6,88 │7,05 │7,33 │

└────┴─────┴─────┴─────┴─────┴─────┴─────┴─────┴─────┴─────┴─────┘

Поскольку доз, вызывающих летальность 0 и 100%, теоретически не

существует, так как кривая летальности приближается к оси абсцисс

асимптотически, приходится для 0 и 100% находить "исправленные" значения

летальности. По Барлетту (Barlett, 1937), "исправленный" процент

летальности для дозы, не приводящей к гибели ни одного животного в опытной

0,25 х 100

группе, равен ---------- %, а для дозы, дающей гибель всех животных, -

(n - 0,25) х 100

---------------- % (n - число животных в данной группе).

М.Л. Беленький (1960) на основе этих формул составил таблицу, в которой привел пробиты, соответствующие "исправленным" процентам (табл. 3).

Таблица 3

ПРОБИТЫ ДЛЯ ЭФФЕКТОВ, РАВНЫХ 0 И 100%

┌─────────────────────────────────────┬──────────────────────────┐

│ Число животных в группе │ Пробиты для эффектов │

│ ├────────────┬─────────────┤

│ │ 0% │ 100% │

├─────────────────────────────────────┼────────────┼─────────────┤

│4 │3,47 │6,53 │

│5 │3,36 │6,64 │

│6 │3,27 │6,73 │

│7 │3,20 │6,80 │

│8 │3,13 │6,87 │

│9 │3,09 │6,91 │

│10 │3,04 │6,96 │

└─────────────────────────────────────┴────────────┴─────────────┘

В нашем опыте на каждую дозу было испытано по 10 животных; по табл. 3 против этого числа находим пробит для 0% = 3,04 и для 100% = 6,96. Значения весов точек (В) определяют по табл. 4, которая представляет собой упрощенный вариант таблицы, предложенной Финни (Finney, 1947). Остальные графы табл. 1 заполняют на основании величин Х, У и В.

Таблица 4

ВЕСОВОЙ КОЭФФИЦИЕНТ ПРОБИТОВ

┌──────┬─────┬─────┬─────┬─────┬─────┬─────┬─────┬─────┬────┬────┐

│Пробит│ 0,0 │ 0,1 │ 0,2 │ 0,3 │ 0,4 │ 0,5 │ 0,6 │ 0,7 │0,8 │0,9 │

├──────┼─────┼─────┼─────┼─────┼─────┼─────┼─────┼─────┼────┼────┤

│3 │1,0 │1,2 │1,4 │1,6 │1,8 │2,0 │2,3 │2,6 │2,9 │3,2 │

│4 │3,5 │3,7 │3,9 │4,1 │4,3 │4,5 │4,6 │4,7 │4,8 │4,9 │

│5 │5,0 │4,9 │4,8 │4,7 │4,6 │4,5 │4,3 │4,1 │3,9 │3,7 │

│6 │3,5 │3,2 │2,9 │2,6 │2,3 │2,0 │1,8 │1,6 │1,4 │1,2 │

└──────┴─────┴─────┴─────┴─────┴─────┴─────┴─────┴─────┴────┴────┘

Зависимость между дозами и пробитами, как и всякая прямолинейная зависимость, выражается уравнением:

У = А + А Х. (а)

0 1

Коэффициенты А и А находят из системы уравнений:

0 1

(SUM В) А + (SUM Х В) А = SUM У В, 1 (б)

0 1

(SUM Х В) А + (SUM Х В) А = SUM Х У В, 2

0 1

где SUM - обозначение суммы.

Подставляя значение А из первого уравнения:

(SUM У В) - (SUM Х В) А

А = ------------------------, (в)

0 SUM В

во второе, получаем:

SUM Х В 2

------- [SUM У В - (SUM Х В) А ] + (SUM Х В) А = SUM Х У В. (г)

SUM В 1 1

Подставляя значение SUM В, SUM Х В, SUM Х В и SUM Х У В в

уравнение (г), находим:

50,6

---- (82,78 - 50,6А ) + 170,2А = 258,3

16,8 1 1

или

250,0 - 152,8А + 170,2А = 258,3, отсюда А = 0,47.

1 1 1

Подставляя значение А в уравнение (в), находим:

82,78 - 50,6 х 0,47

А = ------------------- = 3,51.

0 16,8

Найдя коэффициенты А и А , легко подсчитать значение У для всех

0 1

значений Х, используя формулу (а):

У = 3,51 + 0,47 х 1 = 3,98,

У = 3,51 + 0,47 х 2 = 4,45,

У = 3,51 + 0,47 х 3 = 4,92,

У = 3,51 + 0,47 х 4 = 5,39,

У = 3,51 + 0,47 х 5 = 5,86.

На рисунке (здесь и далее рисунки не приводится) изображены две прямые,

из которых одна (I) проведена "на глаз", а вторая (II) построена по методу

наименьших квадратов LD , по кривой I определяется графически и равна

0,855. При использовании метода наименьших квадратов LD можно вычислить,

исходя из формулы (а). Учитывая, что У = 50% соответствует пробиту У = 5

и, подставляя значения А и А , находим:

0 1

5 = 3,51 + 0,47Х.

5 - 3,51

Х = -------- = 3,17 единицы.

0,47

Если одна единица, как приняли вначале, соответствует интервалу доз

0,05, то 0,17 единицы соответствует 0,0085. Зная, что 3 единицы

соответствуют 0,85 мг/кг, находим LD , которая равна 0,85 + 0,0085 =

0,858.

Уточнение величины LD в результате учета весов не столь велико,

однако изменение наклона кривой за счет имеющих большой вес точек 2 и 4

оказывается весьма значительным. Правильность определения наклона кривой к

оси абсцисс очень важна по той причине, что именно наклоном определяется

величина ошибки LD .

Мы приведем расчет ошибки LD по одному из наиболее распространенных

методов, предложенному Миллер и Тейнтер (Miller, Tainter, 1944). По кривой

I графически находим, каким дозам соответствуют пробиты 6 (84%) и 4 (16%).

Разность между этими дозами равна величине двух средних квадратических

ошибок:

2 сигма = LD - LD = 0,92 - 0,79 = 0,13.

1 84 16

Найденное значение 2 сигма подставляем в предложенную Миллер и Тейнтер

2 сигма

формулу S_ = +/- -------, где S_ - ошибка LD , а N - общее число животных

х __ х 50

\/2N

в группах, летальность в которых была не меньше 6,7% (пробит 3,5) и не

больше 93,3% (пробит 6,5). В нашем примере в каждой из пяти групп было

испытано по 10 животных, но поскольку лишь в 3 группах, летальность была в

пределах указанного интервала, число животных в опыте следует считать

равным 30.

Подставляя значение 2 сигма и N в формулу, находим ошибку LD по

1 50

кривой I:

0,13

S_ = +/- -------- = +/- 0,017 мг/кг.

х1 ______

\/2 х 30

Величина LD и LD по кривой II может быть определена либо

84 16

графически, как это было описано для кривой I, либо, при необходимости

особо точных вычислений, по той же формуле (а), что и LD :

2 сигма = 0,97 - 0,75 = 0,22.

Ошибка LD по кривой II:

0,22

S_ = +/- -------- = +/- 0,028 мг/кг.

х2 ______

\/2 х 30

Уточнение ошибки LD (0,028 вместо 0,017) является столь значительным,

что им уже нельзя пренебречь даже при исследовании, не требующем большой

точности.

Метод наименьших квадратов может быть использован не только при пробит-анализе кривых летальности, но и при обработке любых кривых доза-эффект. Мы полагаем, что незначительный выигрыш во времени при отказе от вычислений, связанных с применением предлагаемого метода, никак не может искупить неточностей, а порой и ошибок, которые неизбежно возникают всякий раз, когда расчет заменяется глазомером.

Определение доверительных интервалов

Доверительные границы LD рассчитываем по методу, предложенному Миллер

и Тейнтер (1944).

Доверительный интервал LD находится в границах:

LD +/- S_ - t,

50 х

где:

S_ - ошибка LD ;

х 50

t - критерий Стьюдента.

При принятом нами уровне вероятности (Р = 0,05) в соответствующей графе таблицы 5 находим значение t для числа степеней свободы f = N - 1, где N - количество животных в группах, летальность в которых не меньше 6,7% и не больше 93,3%.

Таблица 5

t - РАСПРЕДЕЛЕНИЕ СТЬЮДЕНТА

┌───────────────────────────────┬────────────────────────────────┐

│ f │ Р = 0,05 │

├───────────────────────────────┼────────────────────────────────┤

│1 │12,71 │

│2 │4,30 │

│3 │3,18 │

│4 │2,78 │

│5 │2,57 │

│6 │2,45 │

│7 │2,36 │

│8 │2,31 │

│9 │2,26 │

│10 │2,23 │

│11 │2,20 │

│12 │2,18 │

│13 │2,16 │

│14 │2,14 │

│15 │2,13 │

│16 │2,12 │

│17 │2,11 │

│18 │2,10 │

│19 │2,09 │

│20 │2,09 │

│21 │2,08 │

│22 │2,07 │

│23 │2,07 │

│24 │2,06 │

│25 │2,06 │

│26 │2,06 │

│27 │2,05 │

│28 │2,05 │

│29 │2,05 │

│30 │2,04 │

│беск. │1,96 │

└───────────────────────────────┴────────────────────────────────┘

Приложение 3

ВЫЧИСЛЕНИЕ КОЭФФИЦИЕНТА КУМУЛЯЦИИ

В качестве примера приводим вычисление коэффициента кумуляции ТМТД.

Животным ежедневно вводили 1/20 ЛД ТМТД (тетраметилтиурамдисульфид), что

составляло 26,5 мг/кг веса (ЛД ТМТД, установленная при однократном

введении, равна 530 мг/кг).

В течение всего опыта отмечали, на какой день от начала введения

наступала гибель животных и подсчитывали суммарную дозу яда, полученную

животными до момента гибели.

Вычисление ЛД chronica отличается тем, что вместо однократно вводимых

доз учитываются суммарные дозы, полученные каждым животным до момента

гибели. Так, например, в опыте было 10 животных, из них погибло 8. Первое

животное погибло на 18-й день, получив суммарно 477 мг/кг (26,5 х 18),

второе - на 23-й день введения, получив суммарно 609,5 мг/кг (26,5 х 23), и

т.д.

Следовательно, максимальной суммарной дозой, не вызвавшей гибели ни

одного животного, была доза, полученная крысами после 17 введений - 450,5

мг/кг. Эта доза будет соответствовать 0 в графе "Летальность в %" таблицы

расчета ЛД (табл. 1).

Таблица 1

ЗАВИСИМОСТЬ % ЛЕТАЛЬНОСТИ ОТ ПОЛУЧЕННОЙ ДОЗЫ

┌─────────────────┬──────────────┬─────────────┬─────────────────┐

│ Сроки гибели │Суммарная доза│ Количество │Летальность (в %)│

│животных (в днях)│ (в мг/кг) │ погибших │ │

│ │ │ животных │ │

├─────────────────┼──────────────┼─────────────┼─────────────────┤

│17 │450,5 │0 │0 │

│18 │477,0 │1 │10 │

│23 │609,5 │1 + 1 = 2 │20 │

│27 │715,5 │1 + 2 = 3 │30 │

│35 │927,5 │1 + 3 = 4 │40 │

│50 │1325,0 │1 + 4 = 5 │50 │

│69 │1828,5 │1 + 5 = 6 │60 │

│77 │2040,5 │1 + 6 = 7 │70 │

│83 │2199,5 │1 + 7 = 8 │80 │

└─────────────────┴──────────────┴─────────────┴─────────────────┘

Следует подчеркнуть, что при заполнении граф "Количество погибших животных" и "Летальность в %" при подсчете животных, погибших от каждой последующей суммарной дозы, учитываются и животные, погибшие от предыдущих доз. Так, например, от дозы 477,0 мг/кг погибло одно животное (на 18-й день), от дозы 609,5 мг/кг погибло также одно животное (на 23 день). В графах "Количество погибших животных" и "Летальность в %" для дозы 609,5 мг/кг учитывается и первое животное, погибшее от 477,0 мг/кг, и т.д.

Дальнейший расчет ЛД chronica ведется по В.Б. Прозоровскому,

аналогично расчету ЛД acuta с вычислением доверительных границ по Миллеру

и Тейнтеру.

Следует отметить, что при расчете доверительных границ для ЛД

chronica условно принимают, что на каждую суммарную дозу приходится по 10

животных.

Следовательно, для данного расчета число животных = 80 (учитывается только количество животных в группах с летальностью в пределах от 6,7 до 93,3%) при Р = 0,05, t = 1,96 (f > 30).

Составляем таблицу для расчета на основании данных табл. 1.

Таблица 2

РАСЧЕТ УРАВНЕНИЯ ПРЯМОЙ ДЛЯ ПРОБИТ-АНАЛИЗА КРИВОЙ

ЛЕТАЛЬНОСТИ ПРИ ВВЕДЕНИИ КРЫСАМ ТМТД

┌──────┬──────────┬─────┬───────┬───────────┬──────┬───────┬──────┬───────┐

│ │ │ │ │ │ │ 2 │ │ │

│ (Х ) │ (У ) │ (Х) │ (У) │(В) весовой│ Х В │ Х В │ У В │ Х У В │

│ э │ э │место│пробиты│коэффициент│ │ │ │ │

│доза, │ летальн. │ доз │ │ │ │ │ │ │

│мг/кг │ в % │ │ │ │ │ │ │ │

├──────┼──────────┼─────┼───────┼───────────┼──────┼───────┼──────┼───────┤

│450,5 │0 │1 │3,04 │1,0 │1,0 │1,0 │3,04 │3,04 │

│477,0 │10 │2 │3,72 │2,6 │5,2 │10,4 │9,67 │19,34 │

│609,5 │20 │7 │4,16 │3,9 │27,3 │191,1 │16,22 │113,54 │

│715,5 │30 │11 │4,48 │4,5 │49,5 │544,5 │20,16 │221,76 │

│927,5 │40 │19 │4,75 │4,8 │91,2 │1732,8 │22,80 │433,20 │

│1325,0│50 │34 │5,00 │5,0 │170,0 │5780,0 │25,00 │850,00 │

│1828,5│60 │53 │5,25 │4,8 │254,4 │13483,2│25,20 │1335,60│

│2040,0│70 │61 │5,52 │4,5 │274,5 │16744,5│24,84 │1515,24│

│2199,5│80 │67 │5,84 │3,9 │261,3 │17507,1│22,76 │1524,92│

│Сумма │ │ │ │35,0 │1134,4│55994,6│169,7 │6016,64│

└──────┴──────────┴─────┴───────┴───────────┴──────┴───────┴──────┴───────┘

SUM Х В 2

------- [SUM У В - (SUM Х В) А ] + (SUM Х В) А = SUM Х У В.

SUM В 1 1

1134

---- (170 - 1134А ) + 55994,6А = 6016,64.

35 1 1

5508 - 36741,6А + 55994,6А = 6016,64.

1 1

19253А = 508,64.

508,64

А = ------ = 0,027.

1 19253

(SUM У В) - (SUM Х В) А

1 169,7 - 1134 х 0,027

А = ------------------------ = -------------------- = 3,97.

0 SUM В 35

Находим место дозы ЛД - Х:

5 - А

0 5 - 3,97

Х = ------ = -------- = 38.

А 0,027

Составляем пропорцию:

1325 - 34

ЛД - 38

отсюда:

1325 х 38

ЛД = --------- = 1481 мг/кг.

50 34

Расчет ошибки:

2 сигма

S = +/- -------,

х __

1 \/2N

где:

N - число животных в группах, летальность в которых была не меньше 6,7%

и не больше 93,3%;

2 сигма представляет собой разность между величинами доз,

соответствующих пробитам 6 и 4, т.е. разность величин ЛД и ЛД .

84 16

Находим места доз ЛД и ЛД и величины ЛД и ЛД из уравнения У =

84 16 84 16

А + А Х, подставляя вместо У пробиты соответствующих доз:

0 1

6 - А

0 6 - 3,97

Х = ------ = -------- = 74,8.

ЛД А 0,027

84 1

2199,5 - 67

ЛД - 74,8

2199,5 х 74,8

ЛД = ------------- = 2462 мг/кг.

84 67

4 - А

0 4 - 3,97 0,03

Х = ------ = -------- = ----- = 1,11.

ЛД А 0,027 0,027

16 1

450,5 - 1

ЛД - 1,11

450,5 х 1,11

ЛД = ------------ = 500,0.

16 1

2 сигма = 2462 - 500 = 1962, следовательно:

2 сигма 1962 1962

S_ = +/- ------- = ----- = ---- = 154,5 мг/кг.

х __ ___ 12,7

\/2N \/160

Вычисляем доверительные границы ЛД (при Р = 0,05) по формуле:

ДЕЛЬТА ЛД = S_ х t,

50 х

где:

S_ - стандартная ошибка;

t - находим по таблице Беленького при Р = 0,05. t = 1,96.

ДЕЛЬТА ЛД = 154,5 х 1,96 = 302,82 мг/кг.

ЛД = 1481 (1784 - 1178), мг/кг.

Для проверки правильности расчета строим график, по вертикальной оси

которого откладываем пробиты (У) для испытанных мест доз, по горизонтальной

- места испытанных доз (Х) (рис.).

Пробиты для испытанных доз находим по формуле:

У = А + А Х.

0 1

У = 3,97 + 0,027 х 1 = 3,997,

У = 3,97 + 0,027 х 2 = 4,024,

У = 3,97 + 0,027 х 7 = 4,159,

У = 3,97 + 0,027 х 11 = 4,267,

У = 3,97 + 0,027 х 19 = 4,483,

У = 3,97 + 0,027 х 34 = 4,888,

У = 3,97 + 0,027 х 53 = 5,401,

У = 3,97 + 0,027 х 61 = 5,617,

У = 3,97 + 0,027 х 67 = 5,779.

Совпадение ЛД , ЛД и ЛД расчетных с графическими свидетельствует о

50 16 84

правильности этих данных.

Следовательно, получив ЛД acuta и ЛД chronica, можно вывести

50 50

коэффициент кумуляции:

ЛД chronica

50 1481

К = ------------- = ---- = 2,8.

кум ЛД acuta 530

Приложение 4

ПАТОМОРФОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Вскрытие животных. Отбор материала

для патогистологического исследования

При проведении патоморфологических исследований необходимо принимать во внимание вид животного, его породу, возраст, пол, степень упитанности, условия содержания, время года и прочие обстоятельства, в той или иной степени, влияющие на ход эксперимента. Для достоверности морфологических исследований из каждого опыта необходимо брать органы 3 - 5 мышей или крыс, более крупных животных может быть меньше.

Изучение органов животных проводится в динамике. Так, в частности в остром опыте рекомендуется исследовать органы через 24 часа, 2, 5, 10, 15, 20 дней после затравки.

В хроническом эксперименте патоморфологические исследования части животных осуществляются в конце опыта. У оставшихся животных проводят гистологическое исследование через 10 - 15 дней после окончания эксперимента для выяснения обратимости имеющего место патологического процесса.

Для изучения динамики патоморфологических изменений на протяжении хронического опыта следует использовать также органы павших животных, независимо от срока, при условии, что от момента гибели прошло не более суток. При этом следует учитывать, что желудочно-кишечный тракт обычно бывает непригоден для микроскопического изучения.

Для патоморфологических исследований также можно использовать органы животных из опыта по изучению материальной кумуляции, которых убивают в динамике (см. раздел кумуляции).

Патоморфологическому изучению подвергают легкие, сердце, селезенку, печень, желудок, тонкий и толстый кишечник, поджелудочную железу, почки, надпочечники, головной мозг.

Учитывая специфику действия некоторых пестицидов необходимо, кроме того, исследовать мышцы животных в опытах с фосфорорганическими пестицидами (определение холинэстеразы), щитовидную железу - карбаматами и бромсодержащими пестицидами, костный мозг - мышьяксодержащими и соединениями, имеющими в своем составе бензольное или фенольные кольца. В опытах по изучению кожно-резорбтивного действия пестицидов для исследования берется кожа животных с места нанесения препарата с окружающей тканью.

Для умерщвления экспериментальных животных применяют легкий эфирный наркоз и двусторонний пневмоторакс. Для этого быстро вскрывают грудную клетку, обнажая легкие и сердце, которое продолжает сокращаться, и при необходимости, из него можно взять кровь для исследования. При ингаляционном пути введения пестицида эфир может явиться дополнительным токсическим фактором, отрицательно влияющим на структуру уже поврежденных клеток легкого. В этих случаях у крыс и мышей производят разрыв спинного мозга в шейном отделе. Для этого кожу и подкожную клетчатку сзади в области шеи захватывают корнцангом, держат его рукой или прикрепляют к неподвижному предмету. Второй рукой берут животное за хвост, ближе к туловищу, и с усилием натягивают. Смерть наступает тотчас же.

Кроликов лучше всего умерщвлять воздушной эмболией или разрывом спинного мозга в шейном отделе под воздействием удара. Этот случай не пригоден, если надо исследовать продолговатый мозг, так как в нем отмечают обширные кровоизлияния, что затрудняет микроскопическое исследование.

Собак и кошек убивают электротоком.

Животных, предназначенных для вскрытия, укрепляют на специальных деревянных станках или приспособленных для этого столах. Мелких лабораторных животных удобно вскрывать на пробковых пластинках или плоских кюветах, дно которых залито парафином. Обычно крысу или мышь прикалывают за лапы булавками или иглами от шприца спиной книзу. Переднюю поверхность туловища смачивают водой, чтобы избежать попадания волос в брюшную полость. При необходимости взять материал стерильно место разреза смачивают какой-либо дезинфицирующей жидкостью (лизолом, хлорамином, спиртом). Кожу и подкожную жировую клетчатку разрезают остроконечными ножницами. На передней брюшной стенке, чуть выше лонного сочленения, делают надрез, осторожно, чтобы не повредить кишечник, и разрезают ножницами до грудины. Пинцетом приподнимают нижний край грудины и отсекают от ребер. В результате проведенного вскрытия хорошо видны грудная и брюшная полости, в которых осматривают состояние серозных оболочек и наличие содержимого.

Для извлечения у мышей, крыс, морских свинок, кошек, кроликов сердца и легких с трахеей, приподнимают пинцетом нижний край легких и пересекают ножницами пищевод и кровеносные сосуды выше диафрагмы. Органокомплекс оттягивают пинцетом вверх, ножницами отделяют от позвоночника в грудном и шейном отделах и перерезают в области глотки. Вместе с трахеей выделяется щитовидная железа.

При вскрытии собак кожу и подкожную клетчатку разрезают специальным ножом. Разрез ведут сверху вниз. Грудину отсекают у места прикрепления ребер по хрящам. Диафрагму подрезают с двух сторон до позвоночника, затем перерезают сосуды и пищевод. В верхней части шеи перерезают трахею и пищевод и отделяют от позвоночника ножом сверху вниз. Отпрепарированный органокомплекс - сердце, легкие с трахеей - извлекают целиком. Органы брюшной полости выделяют отдельно.

У большинства лабораторных животных печень многодольчатая и при взятии материала все доли следует извлекать. Почки берут с околопочечной жировой клетчаткой, в которой располагаются надпочечники. Поджелудочную железу выделяют с двенадцатиперстной кишкой и ее брыжейкой.

Для извлечения головного мозга у мышей и крыс снимают кожу с головы, не удаляя ее. Бранши малых ножниц вводят в глазницы и пересекают носовую кость на ее границе с лобной. Затем браншу ножниц вводят в полость черепа и осторожно, чтобы не повредить мозг, разрезают кости крыши черепа, обнажая поверхность мозга. Затем с двух сторон подрезают мосто-мозжечковый намет, приподнимают большие полушария спереди и вверх и осторожно отделяют мозг от черепной коробки. Разрезают сосуды и нервы и выделяют мозг из его ложа.

Можно также выделять мозг после отсечения головы от туловища (большими ножницами). Кожу рассекают с двух сторон от большого затылочного отверстия спереди, обнажая череп. Также с двух сторон рассекают малыми ножницами места сращения костей крышки черепа и скуловых костей. Затылочную кость зажимают пинцетом и отворачивают вверх и вперед, в результате чего мозг оказывается обнаженным. Приподнимают мозжечок, постепенно подрезая выходы нервов и сосудов, и осторожно вылущивают мозг из его ложа. Для выделения гипофиза глазными ножницами разрезают турецкое седло.

Следует также отметить, что можно фиксировать головной мозг, не вынимая его из черепной коробки, только сняв черепную крышку, а после фиксации извлечь.

Для выделения мозга у кроликов, кошек, собак кости черепа распиливают пилой, снимая верхнюю черепную крышку.

При осмотре внутренних органов экспериментальных животных необходимо обращать внимание на ряд особенностей их анатомического строения, что представлено в табл. 1. Пищеводный отдел желудка мышей и крыс не следует брать для микроскопии, так как он выстлан многослойным плоским эпителием с ороговением, гистологические изменения в этой области мало выражены.

Таблица 1

ОСОБЕННОСТИ АНАТОМИЧЕСКОГО СТРОЕНИЯ НЕКОТОРЫХ ВНУТРЕННИХ

ОРГАНОВ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ЖИВОТНЫХ

┌─────────┬──────────────────────────────┬────────────────────────┬────────────────────┐

│ Вид │ Легкие │ Печень │Поджелудочная железа│

│животного├───────────────┬──────────────┤ │ │

│ │ правое │ левое │ │ │

├─────────┼───────────────┼──────────────┼────────────────────────┼────────────────────┤

│Мышь │4 доли: │1 доля │4 доли: левая боковая │2 доли: правая при- │

│ │верхушечная, │ │(самая большая), │легает к двенадцати-│

│ │сердечная, │ │левая внутренняя, │перстной кишке, │

│ │диафрагмальная,│ │правая боковая (с │левая позади желудка│

│ │добавочная │ │хвостатым отростком), │и прилегает к │

│ │ │ │правая внутренняя (с │селезенке │

│ │ │ │сосцевидным отростком) │ │

│Крыса │4 доли: те же │1 доля │6 долей: левая боковая │2 доли (располагают-│

│ │ │ │(самая большая), │ся в брыжейке): │

│ │ │ │левая внутренняя, │правая (маленькая) │

│ │ │ │правая внутренняя, │- вблизи двенадцати-│

│ │ │ │правая боковая, │перстной кишки, │

│ │ │ │хвостатая, │левая - по большой │

│ │ │ │добавочная │кривизне желудка │

│ │ │ │Примечание: желчный │ │

│ │ │ │пузырь отсутствует │ │

│Морская │4 доли: те же │3 доли: │6 долей: левая боковая, │2 доли: правая │

│свинка │ │верхушечная, │левая срединная, │(маленькая) - вблизи│

│ │ │сердечная, │квадратная (маленькая), │двенадцатиперстной │

│ │ │добавочная │наружная правая, │кишки, левая - по │

│ │ │ │внутренняя правая, │большой кривизне │

│ │ │ │хвостатая (на ней │желудка │

│ │ │ │вдавление для почки) │ │

│Кролик │4 доли: те же │3 доли: │6 долей: левая наружная,│2 доли: правая │

│ │ │верхушечная │левая внутренняя, │(лопасть) - по ходу │

│ │ │(редуциро- │правая, │разветвлений перед- │

│ │ │ванная), │средняя или квадратная │ней и задней двенад-│

│ │ │сердечная, │ная (узкая), │цатиперстно-желудоч-│

│ │ │диафрагмальная│хвостатая, │ных артерий, левая -│

│ │ │ │сосцевидная │располагается на │

│ │ │ │Примечание: края печени │малой кривизне │

│ │ │ │часто имеют насечки │желудка и в желудоч-│

│ │ │ │ │но-селезеночной │

│ │ │ │ │связке │

│Кошка │3 доли: │3 доли: │7 долей: левая наружная,│1 доля, от которой │

│ │верхушечная, │верхушечная, │левая внутренняя, │отходит небольшой │

│ │сердечная, │сердечная, │левая квадратная, │отросток вверх │

│ │добавочная │диафрагмальная│правая наружная, │ │

│ │ │ │правая внутренняя, │ │

│ │ │ │сосцевидный отросток, │ │

│ │ │ │хвостатая │ │

│Собака │4 доли: │3 доли: │7 долей: левая наружная,│Тело, правая и левая│

│ │верхушечная │верхушечная, │левая внутренняя, │доли. Тело железы │

│ │(иногда │сердечная, │правая наружная, │упирается в двенад- │

│ │раздвоена), │диафрагмальная│правая внутренняя, │цатиперстную кишку, │

│ │сердечная, │ │квадратная, │правая доля распола-│

│ │диафрагмальная,│ │хвостатая, │гается вдоль двенад-│

│ │дорсальная │ │медиальная │цатиперстной кишки, │

│ │добавочная │ │Примечание: хорошо │левая доля направле-│

│ │Примечание: диафрагмальные │выражены сосочковый и │на к желудку │

│ │полости сообщаются между собой│хвостатые отростки │ │

└─────────┴──────────────────────────────┴────────────────────────┴────────────────────┘

Внешний вид органа уже до некоторой степени позволяет судить о патологическом процессе. Наличие язв, очагов некроза, кровоизлияний и других патологий тщательно документируется. Так, в частности, обнаружив в каком-либо участке тела или органе язву, следует отметить ее форму, размеры, глубину, отношение к окружающей ткани (приподнята или углублена), внешний вид (покрыта налетом, грануляциями, участками некроза), состояние краев (истончены, ровные, подрытые, утолщенные, омозолелые). При исследовании очагов некроза также отмечают размеры (длина, ширина, глубина), форму, консистенцию (влажные, сухие), цвет.

При описании легких отмечают цвет ткани, воздушность, наличие кровоизлияний, ателектазов, в трахее - состояние слизистой оболочки, содержимое в просвете. При описании сердца обращают внимание на конфигурацию органа, цвет, консистенцию, наличие обескровленных очагов и пр. В печени - консистенцию, цвет, наличие кровоизлияний, состояние краев (острые, закругленные). У павших животных поверхность печени, прилегающая к кишечнику, приобретает зеленовато-бурый цвет, ткань дряблая. В ряде случаев у крыс, кроликов, реже у мышей и кошек, на поверхности и на разрезе печени имеются белые пузырьки и рубцы, что связано с глистной инвазией. По мере возможности, печень таких животных не следует подвергать патоморфологическим исследованиям. При изучении почек, после снятия капсулы, обращают внимание на поверхность (гладкая или дольчатая, наличие рубцов), на разрезе - выраженность слоев, их цвет. Описывают форму селезенки, цвет, консистенцию, наличие фолликулов. При вскрытии желудка и кишечника отмечают состояние слизистых оболочек и стенок, наличие кровоизлияний, язв, также следует обращать внимание на содержимое, которое, в ряде случаев, может быть окрашено кровью (свежей или бурой).

На вскрытии животных (особенно это касается павших) следует обращать внимание на состояние желудка, кишечника, надпочечников и желез, в которых явления аутолиза развиваются очень быстро.

В головном мозге описывают состояние оболочек (полнокровие, отек) и вещества мозга (дряблое, плотноватое, влажное), наличие кровоизлияний и пр.

Фиксация

Ткани, изолированные от организма, очень скоро подвергаются распаду - аутолизу. Этот процесс характеризуется необратимой дезинтеграцией и прогрессивной диссоциацией тканей. Синтез в клетках прекращается, тогда как литические явления прогрессируют. В тканях образуется фосфорная и молочная кислоты, в результате чего pH клеток снижается с 7,2 до 6,7, а к концу первых суток после смерти - до 6,4.

Во избежание указанного, для микроскопирования исследуемого материала необходимо провести фиксацию, цель которой заключается, прежде всего, в предотвращении гнилостных процессов и дает возможность сохранить структуру тканей. Фиксация обусловливает коагуляцию белков и лабильных белковых соединений в стойкие, нерастворимые. Следует подчеркнуть, что всякая фиксация вызывает более или менее выраженные изменения как структуры, так и объема исследуемого материала. Поэтому в качестве фиксаторов могут быть использованы вещества, не вызывающие грубых нарушений структуры, не сморщивающие материал или незначительно сморщивающие его.

Отдельные детали структуры клеток и тканей по отношению к воздействию фиксирующей жидкости ведут себя по разному, что требует применения различных фиксаторов, в зависимости от цели исследования. Например, одни фиксаторы дают возможность особенно четко выявить структуру ядра, другие способствуют последующей обработке органоидов цитоплазмы и т.д. Одним из показателей выбора фиксатора является также срок, которым располагает исследователь для получения ответа на интересующий его вопрос.

Общие условия фиксации

Номер животного, подвергающегося патоморфологическому исследованию, регистрируется в специальном журнале, где указывают условия опыта, дату взятия материала, фиксатор.

Извлеченные из тела животного органы после макроскопического описания и взвешивания подвергаются фиксации. Категорически запрещается промывать органы водой. Излишки крови удаляют фильтровальной бумагой или марлевыми тампонами (вата оставляет волокна, мешающие дальнейшей гистологической обработке).

Органы каждого животного лучше фиксировать в отдельной банке с притертой пробкой или завинчивающейся крышкой. В крайнем случае, полулитровые банки закрывают полиэтиленовыми крышками или затягивают резиной от старых хирургических перчаток.

Фиксирующая жидкость должна проникать в ткань со всех сторон, для этого на дно сосуда кладут стеклянную или простую вату, марлю, фильтровальную бумагу. Во время фиксации необходимо несколько раз взбалтывать сосуд.

На банке делается соответствующая надпись стеклографом или на приклеенной этикетке простым карандашом.

Менее удобным является фиксация в одном сосуде органов нескольких животных. В этом случае материал каждого животного помещают в отдельный марлевый мешочек, органы должны располагаться свободно для лучшего проникновения фиксатора. Номер животного пишут простым карандашом на небольшом кусочке клеенки или плотной фотографической бумаге и вкладывают вместе с органами.

Пользоваться фиксатором следует однократно, его объем должен в 5 - 10 раз превышать объем кусочков (для формалина - в 20 - 30 раз).

Фиксация, как правило, проводится при комнатной температуре, иногда, при специальных фиксаторах, при 37°, при 4° и даже при 0°. В последнем случае структура даже крупных кусочков сохраняется значительно лучше, что связано с остановкой аутолитических процессов.

Длительность фиксации варьирует в зависимости от состава и свойств фиксирующей жидкости, величины фиксируемого объекта. Органы или части их можно извлекать из фиксирующей жидкости не раньше, чем она полностью пропитает ткань. В сомнительных случаях ткань разрезают острой бритвой и контролируют степень проникновения фиксатора, по изменению цвета и консистенции органа.

Кусочки органов, подлежащие фиксации, не должны быть очень большими.

Органы мелких лабораторных животных обычно фиксируют целиком (легкие, щитовидную железу, надпочечники, поджелудочную железу; в сердце отсекают верхушку, параллельно основанию). У более крупных животных от органа острыми ножницами или лезвием опасной бритвы отсекают несколько небольших кусочков. При этом следует учитывать особенности гистологического строения органов. В печени, селезенке, щитовидной железе, надпочечниках, поджелудочной железе разрезы могут проходить в любой плоскости, но вырезанный участок обязательно должен прилегать к поверхностной капсуле. В почках, надпочечниках, полых органах разрезы необходимо проводить перпендикулярно поверхности так, чтобы на препарате были видны все слои органа.

Для определения местно-раздражающего действия пестицидов, возникает необходимость гистологического исследования пораженного участка кожи. Иссечение проводят в границах здоровой ткани и на значительную глубину. Гистологический срез должен иметь участок пораженной и здоровой ткани. Фиксировать кожу лучше в растянутом виде и приколотой иглами к парафиновой пластинке или пришитой нитками к картону.

Поперечно-полосатую мышцу перед фиксацией выдерживают в вате, смоченной физиологическим раствором 0,5 - 1 час, в противном случае резкое сокращение волокон, которое возникает в фиксирующей жидкости, деформирует мышцу. Мозг мелких лабораторных животных фиксируют целиком; на мозге кроликов, кошек, собак делают несколько фронтальных разрезов и все их фиксируют.

Особого подхода требует выделение глазного яблока (при изучении местно-раздражающего действия на слизистые оболочки). У мелких лабораторных животных выделение глаз производят после фиксации головы в целом. У более крупных животных глаз осторожно извлекают из орбиты, перерезая мышцы и соединительную ткань. Наносят насечки для ориентации (правый, левый, верх, низ) и помещают на слой ваты в фиксирующую жидкость.

Обычно для фиксации вырезают кусочки следующих размеров: длина 1 см, ширина 0,5 см, для хорошего проникновения фиксатора толщина кусочков из органов должна быть не более 0,5 см. Соединительно-тканную капсулу предварительно надсекают в нескольких местах. Кишечник фиксируют небольшими кусочками длиною 2 см, содержимое удаляют споласкиванием в теплом физиологическом растворе. Если возникает необходимость разрезать желудок вдоль, то разрезают по большой кривизне и стенку накалывают иглами или булавками к парафиновой пластинке или пришивают нитками к картону. Желудок мышей и крыс фиксируют целиком.

Если по каким-либо причинам фиксация не может быть проведена сразу же после смерти животного, то материал необходимо сохранить при пониженной температуре. Лучше всего для этой цели иметь в виварии специально выделенный холодильник, так как при температуре около 0° части органов и ткани могут сохраняться длительное время.

Все фиксирующие средства делятся на простые и сложные, в зависимости от того, входит ли в их состав одно или несколько веществ. При использовании сложных фиксаторов устраняются побочные явления: сморщивание, набухание тканей и появление осадков. Однако употребление их требует особого внимания: при длительной фиксации органы нередко становятся хрупкими, что затрудняет их дальнейшую обработку. При невозможности сразу же после фиксации проводить дальнейшую обработку материала (проводку, заливку) следует ограничиться формалиновой фиксацией, при которой материал может сохраняться годами.

Следует обязательно сохранять архив органов, особенно при формалиновой фиксации, так как в ряде случаев может возникнуть необходимость в дополнительных исследованиях. Например, при микроскопическом исследовании печени в цитоплазме гепатоцитов обнаружена вакуолизация, которая может быть следствием гидропического перерождения либо жировой дистрофии. Для уточнения данного вопроса кусочки органов после формалиновой фиксации подвергают специальной окраске на жир.

Ткани, которые требуют после фиксации промывку спиртом, могут сохраняться в спирте такой же концентрации не более 2 - 5 суток, а затем должны быть подвергнуты дальнейшей гистологической обработке.

Простые фиксирующие жидкости

Формалин - универсальный фиксатор. В продажу поступает в виде 40-процентного водного раствора формальдегида (бесцветная жидкость с характерным запахом). При хранении на свету и холоде выпадает осадок - параформальдегид, который частично растворяется при нагревании до 60 - 80°. Более плотная часть осадка растворяется через несколько дней при добавлении на каждые 10 л раствора 5 мл 5 - 10-процентного раствора углекислого натрия. В практической работе продаваемый формалин обычно принимают за 100% и из него готовят необходимые концентрации. Например, для приготовления 5-процентного раствора формалина берут 5 мл 40-процентного водного раствора формальдегида и 95 мл воды.

Для фиксации применяют 5, 10, 12 и 20-процентные растворы, которые приготовляют на водопроводной воде (дистиллированная вызывает набухание тканей, что не пригодно для фиксации). Можно также изготовлять растворы формалина на физиологическом растворе.

Растворы формалина должны иметь нейтральную реакцию, что достигается настаиванием продаваемой формы его 1 - 2 дня на мелу или углекислой магнезии, которые добавляют из расчета 100 г на 1 л формалина. Если продаваемый формалин слабокислый, то нейтрализация его достигается разведением водопроводной водой, которая имеет слабощелочную реакцию.

Взаимодействия формалина с тканевыми белками многообразны и сложны, он вступает в соединения с различными функциональными группами, во многих случаях образуя связи типа мостиков. Именно эта способность к образованию связей между соседними цепями белков обусловливает успешное применение формалина в качестве фиксатора.

Этиловый спирт - 96° и 100°. Второй меньше деформирует ткани, его получают, настаивая 96° спирт на обезвоженном медном купоросе, который прокаливают в фарфоровой чашке до белого цвета, подсыпая обезвоженный купорос до тех пор, пока последняя порция его перестанет синеть.

Этиловый спирт чаще всего применяют для фиксации гликогена, РНК, выявления железа, кальция, а также некоторых ферментов. Не пригоден он для выявления жира, а также для фиксации рыхлых, отечных и слизисто-перерожденных тканей, так как вызывает их сильное сморщивание. Фиксация в 96° спирте до 24 часов, в 100° - до 4 часов.

Метиловый спирт - наибольшее распространение получил для фиксации мазков крови, а также гликогена и нуклеиновых кислот. Фиксацию проводят в течение 2 - 4 часов.

Ацетон - обычно применяют для некоторых гистохимических и иммунохимических реакций - для определения АТФ, кислой фосфатазы, холинэстеразы. Фиксировать 0,5 - 2 часа при 4°.

Сложные фиксирующие смеси

Фиксатор Карнуа: спирт абсолютный или этиловый 96° - 60 мл, хлороформ - 30 мл, уксусная кислота ледяная - 10 мл.

Используют для специального выявления органоидов клеток, гликогена. Фиксируют 2 - 4 часа, при 4° - 10 часов.

Фиксатор Буэна - насыщенный водный раствор пикриновой кислоты 15 мл, 40% формальдегид - 5 мл, уксусная кислота ледяная - 1 мл.

Применяют для исследования ядра и деления клеток, а также выявления структуры щитовидной железы (с последующей окраской азаном). Фиксировать 2 - 4 часа.

Смесь "СУЗА" - сулема - 4,5 г, хлористый натрий - 0,5 г, дистиллированная вода - 80 мл, трихлоруксусная кислота - 2,0 г, уксусная кислота ледяная - 4 мл, 40% формальдегид - 20 мл.

Фиксирующая и одновременно декальцинирующая смесь. Менее пригодна для фиксации материала, содержащего много соединительной ткани. Фиксировать 0,5 - 4 часа.

Ледяная уксусная кислота - спирт: спирт этиловый абсолютный - 80 мл, уксусная кислота ледяная - 20 мл.

Хорошо фиксирует ядра клеток. Фиксация 2 - 4 часа.

Фиксатор Ценкера - бихромат калия - 2,5 г, сернистый натрий - 1 г, дистиллированная вода - 100 мл, сулема - 5 г, уксусная кислота ледяная (добавлять перед употреблением) - 5 мл. Применяют для выявления структуры ядра. Фиксируют 2 - 24 часа.

Фиксатор Максимова - к фиксатору Ценкера перед употреблением добавляют 10 мл 40-процентного формальдегида на 10 мл раствора. Фиксируют 1 - 6 часов. Применяют для выявления структуры ядер.

Фиксатор Нейкирха - 10-процентный нейтральный формалин, насыщенный декстрозой. Используют для выявления гликогена. Фиксировать 24 - 96 час.

Фиксатор Шабадаша - I раствор: 96° этиловый спирт - 100 мл, азотно-кислый кальций - 1,8 г; азотно-кислая медь - 0,9 г. II раствор - 96° этиловый спирт - 100 мл, азотно-кислый кальций - 2,6 г, 40% формальдегид (перед употреблением) - 10 мл. Используется для выявления гликогена с последующей окраской по Шабадашу. Фиксация в каждом растворе 1,5 часа.

Фиксатор Бродского - 40-процентный формальдегид - 30 мл, 96° этиловый

спирт - 10 мл, уксусная кислота ледяная - 3 мл. Применяют для выявления

NH и SH-групп и белков (метод с бромфеноловым синим). Фиксировать 0,5 - 2

часа.

Смесь Лилли - 40-процентный формальдегид - 10 мл, уксусная кислота ледяная - 5 мл, 96° этиловый спирт - 35 мл.

Применяется для выявления мукополисахаридов, нуклеиновых кислот, гликогена. Фиксация 24 часа при 4°.

Проводка

Это процесс, заключающийся в обезвоживании тканей и заливке их в парафин.

Предварительно органы из фиксирующей жидкости отмывают от фиксатора водой или спиртом. После фиксации в формалине промывают проточной водой в течение 12 - 24 часов, а после фиксации в смесях с пикриновой кислотой (Буэн) - 70° и 80° спиртом. После метанола, фиксаторов Карнуа, Шабадаша, Бродского, Нейкирха, Лилли, уксусная кислота - спирт - промывают в течение 1 - 2 часов 96° спиртом. После фиксаторов, в состав которых входит сулема ("Суза", Ценкера, Максимова), промывку осуществляют 70° спиртом, в который добавляют йод - йодистокалиевый спиртовый раствор до светло-коричневого цвета (2 г металлического йода, 3 г йодистого калия, 100 мл 90° спирта). Промывку проводят в течение 20 - 24 часов, меняя несколько раз раствор.

После отмывания производят вторичное вырезание кусочков органов по тем же правилам, которые приведены ранее в разделе "Фиксация", однако размеры их несколько уменьшают: длина - 0,5 - 0,8 см, ширина - 0,5 см, толщина - 0,2 - 0,3 см.

Обезвоживание тканей осуществляют путем последовательного выдерживания органов в спиртах восходящей крепости и органических растворителях (бензоле, ксилоле, хлороформе) с последующим пропитыванием, уплотнением и заливкой в парафин.

Обезвоживание начинают со спирта, концентрация которого выше, чем промывная жидкость. После водной промывки помещают в 50° спирт, после 70° - в 80°. Если промывка осуществлялась 96° спиртом, то кусочки помещают сразу в абсолютный спирт. В табл. 2 приведен способ разведения спиртов до необходимой концентрации.

Таблица 2

РАЗВЕДЕНИЕ СПИРТОВ

┌────────────────────┬────────────────────────────────────────────┐

│ В мл │ Крепость получаемого спирта │

│ ├────────┬────────┬────────┬────────┬────────┤

│ │ 50° │ 60° │ 70° │ 80° │ 90° │

├────────────────────┼────────┼────────┼────────┼────────┼────────┤

│Количество / │50 │60 │70 │80 │90 │

│96° спирта/ │ │ │ │ │ │

│ /Количество│ 46│ 36│ 26│ 16│ 6│

│ / воды │ │ │ │ │ │

└────────────────────┴────────┴────────┴────────┴────────┴────────┘

Спирты необходимой концентрации и органические растворители наливают в полулитровые банки из прозрачного стекла с притертой пробкой - батарея для проводки. Следует внимательно следить за чистотой спирта, так как при помутнении его и появлении осадка обезвоживание тканей ухудшается, что сказывается на качестве гистологических препаратов.

Органические растворители - бензол, ксилол, хлороформ - употребляют как промежуточную среду между обезвоживанием и заключением в парафин, так как они обладают свойством хорошо смешиваться со спиртом и растворять парафин. Для гистологической работы используют химически чистый парафин с точкой плавления 48 - 52°. Перед употреблением его гомогенизируют, то есть придают ему аморфность и пластичность, что достигается путем повторного кипячения и быстрого охлаждения парафина в воде или на льду. Гомогенность парафина является обязательным условием, так как от этого зависит толщина будущего среза.

Схема и время обезвоживания кусочков ткани

и заливка их в парафин

1) Спирт 50° - 12 - 24 часа (в зависимости от размера кусочка) <1>.

--------------------------------

<1> Если размеры кусочков меньше 0,5 х 0,5 х 0,2 см, то время обезвоживания может быть сокращено до 6 - 12 часов.

2) Спирт 60° - 12 - 24 часа (в зависимости от размера кусочка).

3) Спирт 70° - 12 - 24 часа (в зависимости от размера кусочка).

4) Спирт 80° - 12 - 24 часа (в зависимости от размера кусочка).

5) Спирт 90° - 12 - 24 часа (в зависимости от размера кусочка).

6) Спирт 96° или 100° (первый) - 12 - 24 часа (в зависимости от размера кусочка).

7) Спирт 96° или 100° (второй) - 12 - 24 часа (в зависимости от размера кусочка).

8) Спирт - ксилол (поровну) - 2 - 4 часа или спирт - бензол (поровну) - 3 - 6 часов или спирт - хлороформ (поровну) - 6 - 12 часов.

9) Ксилол - 2 - 4 часа или бензол - 3 - 6 часов или хлороформ - 6 - 12 часов (можно на ночь).

10) Ксилол - парафин (поровну) - 2 часа при 37° или бензол - парафин (поровну) - 2 часа при 37° или хлороформ - парафин (поровну) - 2 часа при 37°.

11) Парафин I при 54° - 1,5 - 2 часа.

12) Парафин II при 54° - 1,5 - 2 часа.

13) Парафин III - заливка в формы.

14) Охлаждение в воде.

Парафин постоянно находится в фарфоровых или химических стаканах в термостате при температуре 54°. В качестве формы для заливки используют специальные медные или свинцовые L-образные рамки. При их отсутствии изготовляют бумажные лодочки или используют металлические или стеклянные чашки с плоским дном (например, чашки Петри). Расплавленный парафин наливают в форму и на дно теплым пинцетом, не допуская охлаждения, помещают органы, вынутые из второго парафина. Сюда же вклеивают номер животного. Когда парафин в форме несколько охладится (появление пленки на поверхности), форму опускают в сосуд с водой для полного охлаждения. Органы, залитые в парафин, вырезают в блоки, которые сохраняют при комнатной температуре в отдельных бумажных конвертах или коробках, на которых указаны номер животного и условия эксперимента. Дальнейшую гистологическую обработку блоков (резку на микротоме и окраску) проводят специалисты - лаборанты-гистологи.